Efek Antimalaria Ekstrak Sambiloto Terstandar (Parameter Kadar Aandrografolida) Pada Mencit Terinfeksi Plasmodium Berghei.

Transkripsi

1 Efek Antimalaria Ekstrak Sambiloto Terstandar Majalah Farmasi Airlangga, Vol.5 No.1, April Efek Antimalaria Ekstrak Sambiloto Terstandar (Parameter Kadar Aandrografolida) Pada Mencit Terinfeksi Plasmodium Berghei. Dwi Kusumawardhani, Aty Widyawaruyanti*, Idha Kusumawati Bagian Ilmu Bahan Alam Fakultas Farmasi Universitas Airlangga Andrographis paniculata Nees. which known as sambiloto is used for antimalaria. Andrographolide is an main content of sambiloto which is believed to have antimalarial activity. The previous research had shown that sambiloto extract have antimalarial activity both in vitro and in vivo. But, there is no data for the effective dose of standardized sambiloto extract as antimalaria. In this research, the standardized extract of sambiloto was tested in vivo as antimalarial agent using Peter s 4 day suppressive test. Mice (16-29 body weight) were infected with Plasmodium berghei intra peritoneally with suspension containing infected red blood cell taken from donor mice with parasitemia >20%, when parasite concentration in erythrocyte reached >1%, treatment with suspension extract was given for four consecutive days orally with doses mg andrographolide/kg mice body weight. Blood samples were taken to determine parasitemia level for seven days and compared to non treated and chloroquin treated subjects and ED 50 was obtained by analyzing inhibition level in five days with probit analysis. The result showed that standardized sambiloto extract [(10.82±0.37)% andrographolide] has an ED 50 value of mg extract equal to mg andrographolide/kg body weight against Plasmodium berghei. Key words: Standardized sambiloto extract, andrographolide, antimalarial, Plasmodium berghei PENDAHULUAN Malaria merupakan penyakit infeksi parasit utama di dunia yang mengenai hampir 170 juta orang tiap tahunnya. Penyakit ini juga berjangkit di hampir 103 negara, terutama negara-negara di daerah tropik dan subtropik. Di Indonesia, malaria tergolong penyakit menular yang masih bermasalah. Penyakit ini berjangkit di semua pulau di Indonesia, mulai dari dataran rendah hingga dataran tinggi, baik di kota maupun di desa. Sebagian penduduk di 20 provinsi di Indonesia terjangkit malaria. Lebih dari 40 juta penduduk Indonesia bermukim di daerah malaria, sekitar 11 juta diantaranya tinggal di Jawa dan Bali (Mursito, 2002). Obat malaria standar yang digunakan di Indonesia untuk semua spesies parasit adalah klorokuin (Depkes RI, 1991) akan tetapi sudah banyak strain dari Plasmodium falciparum dan Plasmodium lain yang resisten terhadap klorokuin di beberapa negara di Asia, Afrika dan Amerika Tengah sehingga mendorong para ilmuwan untuk mencari obat malaria baru, salah satunya berasal dari tanaman. Plasmodium berghei merupakan salah satu spesies malaria yang menyerang mamalia selain manusia, dan spesies ini adalah salahsatu dari empat (4) spesies yang menyerang rodensia di Afrika Barat. Parasit ini merupakan subyek yang praktis untuk penelitian dan percobaan mengenai parasit mamalia serta terbukti analog dengan malaria manusia pada segi-segi penting dari struktur, fisiologi dan siklus hidup. Plasmodium berghei merupakan model ideal untuk penelitian parasit malaria dibandingkan tiga spesies parasit rodensia yang lain, karena telah tersedianya teknologi kultivasi in vitro dan dapat dilakukan dalam skala besar, adanya data tentang pemetaan dan struktur gen, metode untuk memodifikasi parasit secara genetis, dan klon-klon yang khas dan galur-galur mutan yang dimodifikasi secara genetis (LUMC, 2002) Indonesia merupakan negara terbesar kedua setelah Brasilia dalam hal kekayaan keanekaragaman hayati atau merupakan negara terbesar pertama bila biota laut ikut diperhitungkan. Hal ini merupakan faktor yang sangat menguntungkan bagi upaya penelitian maupun pemanfaatan tanaman yang dapat digunakan untuk pengobatan serta pengembangan formulasi berbagai ramuan yang berasal dari tanaman. Andrographis paniculata Nees. atau yang biasa dikenal dengan nama daerah sambiloto merupakan tanaman obat yang secara empiris digunakan sebagai antimalaria. Penelitian terdahulu menunjukkan bahwa ekstrak tanaman ini mempunyai aktivitas antimalaria dengan cara menghambat pertumbuhan Plasmodium falciparum in vitro (Suyanto, 1995; Widyawaruyanti, dkk, 1995; Rahman et al.., 1999). Uji in vivo dari ekstrak sambiloto terhadap Plasmodium berghei pada mencit juga menunjukkan aktivitas`antimalaria (Rahman et al.., 1999). Sedangkan pada penelitian yang terbaru dilaporkan bahwa isolat andrografolida menghambat 50% pertumbuhan Plasmodium berghei (ED 50 ) secara in vivo sebesar 3,6000 mg/kg BB (Widyawaruyanti dkk, 2003). Namun, masih belum ada penelitian lebih lanjut mengenai dosis efektif untuk ekstrak sambiloto terstandar (parameter kadar andrografolida) sebagai antimalaria. BAHAN DAN METODE Bahan. Simplisia herba Andrographis paniculata Nees. (Sambiloto) dari daerah Pacet, Jawa Timur, Plasmodium berghei strain ANKA dari Laboratorium Biokimia Eichmann Jakarta, binatang percobaan mencit jantan galur Balb-C dari Pusat Vertenaria Farma (Pusvetma) Surabaya pada bulan Agustus 2003, bahan pembanding klorokuin difosfat (Sigma C-6628, 25gram, Lot ), Bahan lain yang digunakan untuk uji antimalaria secara in vivo adalah medium Alceiver,

2 26 Majalah Farmasi Airlangga, Vol.5 No.1, April 2005 KusumawardhaniD.,et.al pewarna Giemsa dalam dapar fosfat, metanol absolut, dan oleum imersi. Pelarut yang digunakan antara lain : etanol (teknis-redestilasi), etanol p.a. (Merck), PBS (Phosphat Buffered Saline), DMSO (Dimetil Sulfoksida) (Merck), metanol (Merck), kloroform (Merck) dan aqua bidestilata, Plate KLT silika gel 60 F- 254 (Merck). Alat. Densitometer (Camag TLC Scanner 3, software Cats 4.06), penggetar ultrasonik (Branson Ultrasonic 3510E-MT). Pembuatan Ekstrak. Simplisia herba sambiloto dimaserasi dengan etanol 96%, dipekatkan dan dikeringkan dengan Cab-O-Sil secukupnya sampai kering yang selanjutnya disebut bulk ekstrak Validasi Metode. Penetapan kadar dengan metode yang valid dapat menggambarkan kadar senyawa aktif yang sebenarnya. Untuk itu dilakukan validasi metode penetapan kadar andrografolida dengan KLTdensitometer terlebih dahulu. Adapun parameter validasi metode yang dipersyaratkan ialah selektivitas, akurasi, presisi, limit deteksi/kuantitasi dan linieritas. Penetapan Kadar Andrografolida. Ditimbang bulk ekstrak sambiloto 50,0 mg, kemudian digetarkan dengan penggetar ultrasonik selama 5 menit, dipanaskan pada suhu 50 0 C selama 10 menit, ditambah etanol 96% ad 5,0 ml, lalu ditotolkan 2 µl pada plate KLT Silica Gel 60 F-254. Replikasi sampel dilakukan minimal 3 kali. Kemudian dieluasi dengan kloroform-metanol (9:1) dan dipayar dengan densitometer. Uji Aktivitas Antimalaria. Setelah kadar andrografolida dalam bulk ekstrak sambiloto diketahui, bahan uji dihitung dosisnya. Pemilihan rentang dosis didasarkan pada hasil orientasi dosis sebelumnya. Dalam penelitian ini dosis ekstrak sambiloto terstandar yang digunakan adalah 0,0046; 0,0463; 0,4629; 4,6296; 23,1482; 46,2963; 231,4815; 462,9629 dan 925,9259 mg ekstrak/kg BB mencit yang setara dengan 0, mg andrografolida/kg BB. Bahan uji diberikan pada mencit dalam bentuk suspensi, yaitu bulk ekstrak sambiloto yang disuspensikan dalam larutan CMC Na 0,5% dan DMSO 2%, setelah itu baru diberikan per oral pada mencit yang terinfeksi Plasmodium berghei 1-5%. Sebagai kontrol positif digunakan larutan klorokuin difosfat 10 mg/kg BB mencit dan sebagai kontrol negatif digunakan larutan CMC Na 0,5% dan DMSO 2%. Pengujian aktivitas antimalaria in vivo dilakukan dengan menggunakan metode Peter, The 4-day suppressive test of blood schizontocidal action (Phillipson, 1991). Perlakuan diberikan 4 hari berturut-turut, sedangkan parasitemia diamati tiap hari sampai hari ke tujuh (D 0 - D 6 ). Untuk menentukan %-parasitemia, dihitung jumlah eritrosit terinfeksi parasit tiap 5000 sel eritrosit. Sedangkan untuk menentukan harga ED 50 dibuat analisis probit dari % penghambatan selama 5 hari dengan program SPSS. HASIL DAN PEMBAHASAN Validasi Metode. Hasil validasi metode penetapan kadar andrografolida dengan KLT-Densitometer dapat dilihat pada tabel 1. Tabel 1. Penetapan parameter validasi andrografolida dengan metode KLT-densitometri menggunakan fase diam silica gel 60 F-254 dan fase gerak kloroform-metanol Parameter Validasi Hasil Selektifitas Eluen kloroform: metanol (9:1) dengan resolusi dengan noda di atasnya = 3,50 resolusi dengan noda di bawahnya = 2,73 Panjang gelombang maksimum 233 nm LOD pada λ 233 nm 1,34 ng/2µl LOQ pada λ 233 nm 4,05 ng/2µl Linieritas pada λ 233 nm Persamaan regresi y = 2439,5779 x ,2635; r=0,9958 dan Vxo = 1,80% Akurasi pada λ 233 nm rata-rata %-rekoveri = (107,135 ± 2,24)% Selektifitas dilakukan dengan membandingkan resolusi eluen kloroform-metanol dengan beberapa perbandingan untuk andrografolida sehingga diperoleh pemisahan yang paling baik, dengan noda bulat dan tidak berekor serta mempunyai Rf yang sama dengan standar. Dari tiga macam perbandingan eluen yang digunakan, eluen kloroform-metanol dengan perbandingan 9:1 memiliki resolusi yang terbaik dan telah memenuhi persyaratan yaitu >1,5 (Indrayanto, 1994). Eluen ini juga memberikan bentuk noda yang bulat, tidak berekor dan harga Rf yang sama dengan standar yaitu 0,34. Panjang gelombang maksimum yang terpilih sedikit berbeda dengan literatur, yaitu 228 nm, hal ini kemungkinan dipengaruhi perbedaan alat (pada pengukuran ini menggunakan KLT-densitometer), kondisi (senyawa tidak dalam bentuk larutan tapi berupa noda pada plate KLT), serta adanya proses eluasi sebelumnya. LOD dan LOQ ditentukan dengan membuat larutan standar dengan konsentrasi yang menurun kemudian dihitung area noda dengan KLT-densitometer. Berdasarkan hasil penelitian diketahui bahwa untuk mendapatkan presisi dan akurasi yang baik maka harus bekerja pada kadar di atas 4,05 ng/2µl dan berada dalam range linieritas yang telah ditentukan. Linieritas dilihat dari harga koefisien korelasi (r) dan koefisian variasi fungsi (Vxo). Range linieritas yang dibuat yaitu (0,4-6) μg/2µl kemudian dihitung persamaan regresi antara kadar Vs area, harga r dan Vxo. Harga r dan Vxo dari persamaan di atas sudah memenuhi persyaratan yaitu harga r yang lebih besar

3 % parasitemia Efek Antimalaria Ekstrak Sambiloto Terstandar Majalah Farmasi Airlangga, Vol.5 No.1, April dari r tabel (α=0,05 dan n=8) adalah 0,6660 dan Vxo lebih kecil dari 5% untuk analit bahan tanaman (Indrayanto, 1994). Paramater validasi yang terakhir yang ditentukan yaitu akurasi. Sebagai parameter akurasi ini adalah %- rekoveri. Rekoveri dapat ditentukan dengan membuat sampel plasebo kemudian ditambah dengan analit konsentrasi (80-120)% dari kadar yang diperkirakan, tetapi bila tidak memungkinkan untuk pembuatan plasebo maka dapat dilakukan dengan penambahan standar pada sampel yang akan diperiksa, lalu dianalisis dengan metode tersebut (Indrayanto, 1994). Sampel sendiri telah mengandung analit konsentrasi tertentu maka kadar sebenarnya dalam hal ini adalah jumlah dari kadar yang dalam sampel dengan kadar analit yang ditambahkan. Penambahan standar dilakukan minimal 3 konsentrasi dengan replikasi masing-masing minimal 3 kali (USP Convention, 2003), tetapi karena keterbatasan bahan, pada penelitian ini dilakukan panambahan standar 2,5 mg atau satu macam konsentrasi saja dengan replikasi 6 kali. Dari hasil penelitian diketahui bahwa %-rekoveri telah memenuhi persyaratan yaitu dalam rentang % (Mulja, 1995). Berdasarkan dari nilai parameter validasi yang ditentukan, semua telah memenuhi persyaratan sehingga metode ini telah tervalidasi dan dapat digunakan untuk penetapan kadar andrografolida dalam sampel ekstrak etanol sambiloto. Kadar andrografolida yang diperoleh dari hasil penetapan kadar yaitu (10,82±0,37)%. Sedangkan hasil uji antimalaria dari ekstrak sambiloto terstandar (parameter kadar andrografolida) dan klorokuin difosfat dapat dilihat pada tabel 2-4. Dari data tersebut di atas kemudian dibuat grafik hubungan antara % parasitemia dengan hari pengamatan seperti pada Gambar 1. Grafik ini menunjukkan pertumbuhan parasit pada mencit terinfeksi Plasmodium berghei selama pemberian bahan uji dan setelah bahan uji dihentikan. Gambar 1. Grafik pertumbuhan parasit selama pemberian bahan uji dan tiga hari setelah pemberian dihentikan D0 D1 D2 D3 D4 D5 D6 hari pengamatan Dari data yang diperoleh pada Tabel 2. dapat dihitung besarnya penghambatan parasit sampai D4 (satu hari setelah hari terakhir pemberian bahan uji) relatif dibandingkan dengan kontrol negatif. Hasilnya dapat dillihat pada Tabel 3 dan 4. berikut ini. Selanjutnya dari data persen penghambatan ini dapat dihitung nilai ED 50 dari ekstrak sambiloto terstandar pada mencit terinfeksi Plasmodium berghei K+ K- Tabel 2. Tingkat parasitemia mencit terinfeksi Plasmodium berghei pada pemberian suspensi ekstrak sambiloto terstandar per oral Kelompok dosis uji Tingkat parasitemia (%) (mg bahan /kg BB mencit) D 0 D 1 D 2 D 3 D 4 D 5 D 6 925,9259 2,59 2,96 2,51 2,96 2,85 4,73 7,05 462,9629 2,14 3,06 4,12 4,55 4,58 6,06 9,91 231,4815 2,52 3,39 3,33 4,17 4,93 6,16 8,57 46,2963 3,03 3,76 4,84 6,31 6,18 8,52 9,75 23,1482 1,17 1,80 2,79 3,80 5,19 6,88 9,76 4,6296 2,05 2,52 4,47 6,18 7,35 7,73 10,24 0,4629 1,00 2,09 4,31 8,15 8,75 9,93 11,71 0,0463 1,03 2,48 6,38 9,19 9,8 10,89 13,65 0,0046 1,11 2,62 7,37 9,28 10,76 12,44 15,44 K+ 3,63 3,79 1,33 0,64 0,18 0,13 0,30 K- 1,17 1,86 4,83 8,06 11,01 14,96 17,21 Keterangan. D0-D6. Pengamatan % parasitemia pada hari ke-0 (sebelum diberi bahan uji sampai hari ke 6 (tiga hari setelah bahan uji dihentikan), K+: kelompok yang diberi bahan obat klorokuin sebagai kontrol positip. K-: kelompok yang diberi suspensi CMC-Na 0,5 sebagai kontrol negatif

4 Probit 28 Majalah Farmasi Airlangga, Vol.5 No.1, April 2005 KusumawardhaniD.,et.al Tabel 3. Persen pertumbuhan dan penghambatan parasit pada mencit terinfeksi Plasmodium berghei yang diberi ekstrak sambiloto terstandar per oral Dosis ekstrak sambiloto terstandar (mg /kg BB mencit) Rep Pertumbuhan parasit (%) Penghambatan parasit (%) 925, ,28 88,62 2 0,24 90,24 3 0,23 90,65 462, ,72 70,73 2 0,63 74,39 3 0,66 73,13 231, ,67 72,76 2 0,75 69,51 3 0,70 71,54 46, ,81 67,07 2 0,93 62,20 3 0,96 60,98 23, ,04 57,72 2 0,98 60,16 3 0,99 59,76 4, ,39 43,50 2 1,47 40,24 3 1,14 53,66 0, ,94 21,14 2 2,02 17,89 3 1,96 20,33 0, ,18 11,38 2 2,17 11,79 3 2,23 9,35 0, ,42 1,60 2 2,41 2,03 3 2,40 2,44 Tabel 4. Persen penghambatan parasit rata-rata pada mencit terinfeksi Plasmodium berghei yang diberi ekstrak sambiloto terstandar per oral Dosis Ekstrak Sambiloto terstandar (mg /kg BB mencit) Persen Penghambatan Parasit Rata-rata 925, ,84 462, ,75 231, ,27 46, ,42 23, ,21 4, ,80 0, ,79 0, ,84 0,0046 2,02 Analisis Data. Dari data-data di atas dilakukan analisis probit menggunakan program SPSS. Sehingga, dari hasil analisis probit tersebut diperoleh informasi mengenai dosis efektif 50 (Effective Dose 50 = ED 50 ) dari ekstrak sambiloto terstandar (parameter kadar andrografolida) terhadap pertumbuhan Plasmodium berghei pada mencit. Harga ED 50 ini menunjukkan besarnya dosis bahan uji yang dapat menghambat 50% pertumbuhan Plasmodium berghei. Semakin kecil harga ED 50 maka semakin besar efektivitas penghambatan ekstrak terhadap pertumbuhan Plasmodium berghei. Hasil analisis probit dapat dilihat pada gambar 2 berikut ini Probit Transformed Responses -4-3 Log of DOSIS -2 Gambar 2. Kurva analisa probit penghambatan parasit pada berbagai dosis ekstrak sambiloto terstandar -1 Dari hasil analisis data didapatkan harga ED 50 dari ekstrak sambiloto terstandar (parameter kadar andrografolida) adalah 12,2223 mg ekstrak sambiloto terstandar/kg BB yang setara dengan 1,3200 mg andrografolida/kg BB

5 Efek Antimalaria Ekstrak Sambiloto Terstandar Majalah Farmasi Airlangga, Vol.5 No.1, April Suatu senyawa dinyatakan prospektif untuk dikembangkan sebagai bahan obat apabila harga ED 50 nya kecil dan rentang dengan dosis toksik lebar, sehingga selain berkhasiat juga aman digunakan. Menurut literatur senyawa andrografolida sampai pada dosis 40 mg/kg BB masih belum menunjukkan efek toksik pada hewan coba. Dan diketahui LD50 ekstrak metanol sambiloto terstandar sebesar 31,0764 g/kg BB mencit (Wijayanti, 2001). Oleh karena ED 50 hasil penelitan jauh lebih kecil dibandingkan dengan dosis yang dapat mengakibatkan efek toksik, maka dapat dikatakan bahwa senyawa andrografolida berpotensi untuk dikembangkan sebagai obat antimalaria. Hasil penelitian ini bila dibandingkan dengan penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa andrografolida dalam ekstrak sambiloto lebih efektif daripada bentuk isolat atau senyawa tunggalnya karena memiliki nilai ED 50 3,6490 mg/kg BB (Dina, 2004). Hal ini kemungkinan karena andrografolida bekerja sinergis dengan senyawa lain yang terkandung dalam ekstrak sehingga terjadi peningkatan aktivitas antimalaria. Pemberian bahan uji dilakukan sekali sehari selama 4 hari berturut-turut (D 0 D 3 ) dengan alasan diinginkan obat malaria yang pemberiannya cukup sehari sekali dan dalam waktu empat hari sudah dapat menghambat pertumbuhan parasit secara efektif. Pengambilan darah untuk pemeriksaan parasit dilakukan selama 7 hari untuk mengetahui profil pertumbuhan parasit setelah pengobatan dihentikan. Setelah pengobatan dihentikan, secara umum tampak bahwa pertumbuhan parasit mengalami peningkatan. Hal ini dapat disebabkan karena dalam tubuh mencit masih tersisa parasit yang hidup sedangkan bahan obat sudah diekskresikan keluar tubuh sehingga parasit yang masih hidup tersebut bisa melakukan pembelahan lagi dan menyebabkan peningkatan parasitemia. Dari hasil penelitian diketahui bahwa persen penghambatan dari kontrol positif klorokin difosfat sampai hari keempat adalah 100% dan setelah pemberian obat dihentikan ternyata klorokuin difosfat masih mampu memberikan penghambatan. Hal ini mungkin disebabkan karena waktu paruh (t 1/2 ) dari senyawa ini cukup panjang yaitu 127 jam atau sekitar 5 hari. Sedangkan ekstrak sambiloto kemungkinan memiliki t 1/2 lebih pendek sehingga tidak bisa mempertahankan kadar ekstrak dalam darah untuk membunuh atau mencegah pertumbuhan parasit. Dari penelitian uji antimalaria ekstrak sambiloto terstandar (parameter kadar androrgrafolida) terhadap pertumbuhan Plasmodium berghei secara in vivo pada mencit dapat diambil kesimpulan bahwa ekstrak sambiloto terstandar (kadar andrografolida (10,82 ± 0,37)%) memiliki aktivitas antimalaria terhadap pertumbuhan Plasmodium berghei secara in vivo pada mencit dilihat dari harga ED 50 -nya sebesar 12,2223 mg ekstrak sambiloto terstandar/kg BB yang setara dengan 1,3200 mg senyawa andrografolida. DAFTAR PUSTAKA Adlan M, 1997, Standarisasi Ekstrak Etanol Herba Sambiloto dengan Parameter Kadar Andrografolida secara densitometri, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Surabaya. Depkes Republik Indonesia, Farmakope Indonesia. Jilid IV. Jakarta. Depkes Republik Indonesia Materia Medika Indonesia. Jilid III. Jakarta. Dina S, Uji Antimalaria In Vivo Isolat Andrografolida dari Andrographis paniculata Nees. Terhadap Plasmodium berghei pada Mencit, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Surabaya. Leiden University Medical Center (LUMC), The Plasmodium berghei Research Model of Malaria. http: model01.html. Last updated Mulja M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press, Surabaya, p: Mursito B, Ramuan Tradisional Untuk Penyakit Malaria. Jakarta. Penebar Swadaya. Phillipson JD, Wright CW., 1991, antiprotozoal agents from plant sources, Planta Medica, 57 (Suppl. 1), p Rahman ANNN, Furuta T, Kojima S, Antimalarial Activity of Malaysian Medical Plants. J. Of Ethnopharmacology 64, p Suyanto, 1995, Uji Aktivitas Antimalaria secara In Vitro Isolat Androrafolida paniculata Nees, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Surabaya. Wijayanti A, 2001, Uji Toksisitas Akut Ekstrak Metanol Terstandar Andrographis Paniculata Nees Pada Mencit, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Surabaya. Widyawaruyanti A., Ekasari W, Sukardiman, Studiawan H, Rakhmawati, 1995, Uji Antimalaria Ekstrak Herba Sambiloto Terhadap Plasmodium falciparum Secara In Vitro, Laporan Penelitian DIP OPF Unair , Lembaga Penelitian Unair. Widyawaruyanti A., 2001, Uji Aktivitas Antimalaria dari Senyawa Diterpena lakton hasil Isolasi Andrographis paniculata Nees. Laporan Penelitian Project Grand-QUE Project Tahun 2000, Fakultas Farmasi Unair.