BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Bahan dan Alat

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi SEAFAST Centre, Laboratorium Biokimia Pangan dan Laboratorium Kimia Pangan Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, IPB pada bulan Februari hingga Juli 200. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun mengkudu (Morinda citrifolia L.) dengan 2 tingkat ketuaan yaitu daun pangkal berwarna hijau tua dan daun pucuk yang berwarna hijau agak muda (Gambar ). Bahan kimia diantaranya Na asetat (Merck), asam asetat (Merck), EDTA (Amersham Biosciences), gliserol (Bio Basic Inc), polivinilpirolidon (PVP K 30),, βmercaptoetanol (Bio Basic Inc), es batu, akuades, akuabides (Ikapharmindo Putramas), silika gel 60 H (Merck), ammonium sulfat (Merck), etanol (Merck), asam fosfat (Merck), asam borat (Amersham Biosciences), boraks (Merck), kasein (Merck), NaOH (Merck), HCl (Merck), tirosin (Merck), TCA (Merck), Na sulfit (Merck), asam sulfat (Merck), CaCl 2 (Merck), Na 2 CO 3 (Merck), pereaksi folin ciocalteau (Sigma Aldrich), marker BM rendah (Fermentas SM043), yaitu beta galaktosidase 6kDa, bovin serum albumin 66.2kDa, ovalbumin 45kda, laktat dehidrogenase 35kDa, RE ase Bsp 25kDa, beta laktoglobulin 8.4kDa dan lisozim 4.4kDa, akrilamid (Applichem), buffer trishcl (Amersham BiosciencesMerck), SDS (Bio Basic Inc), TEMED (N,N,N,Ntetrametilenetilendiamina), APS (ammonium persulfat), bromophenol blue, BSA serta kasein Hammerstein (Merck), bromophenol blue (Bio Basic Inc), Coomassie Brilliant Blue R250 (Applichem), Coomassie Brilliant Blue G250 (Bio Basic Inc). Peralatan yang digunakan adalah hand blender Aletta A746, sentrifus Hermle Z383K, oven, neraca analitik, seperangkat alat elektroforesis gel mini protean 3 sel (Biorad), kantong dialisis Sigma D9652, freezer, spektrofotometer UVVis, Shimadzu seri UV2450, Quantity one (Biorad), penangas air, pengaduk magnetik, tabung eppendorf, pipet mikro dan alatalat gelas. 9

2 A B

3 Daun mengkudu Penyortasian Pengeringanginan analisa proksimat Penambahan buffer sodium asetat ph 5 ( 5mM EDTA, 4mM 2 mercaptoetanol, 0% PVPP dan 0% gliserol (daun :buffer = :5 ; berat daun 0g) Penggilingan menggunakan blender (4 5detik pada kecepatan tinggi) Penyaringan Ampas Sentrifugasi filtrat pada 3775g (4 o C), 30 menit Ampas Supernatan (Ekstrak enzim kasar) * Penambahan silika gel 60 H.4%, divorteks 5 menit Sentrifugasi 3775g (4 o C), 5 menit Ampas Supernatan (Ekstrak Silika) * Penambahan ammonium sulfat 00% jenuh,diaduk dengan magnetic stirrer, 30 menit Sentrifugasi 972g (4 o C), 30 menit Supernatan* Endapan* Pelarutan dalam jumlah pelarut minimal Dialisis Dialisat* Elektroforesis SDSPAGE, Zimogram Pendugaan Kelas Protease Gambar 3. Garis besar kerja penelitian Ket: *Analisa kadar protein (Bradford, 976) ) dan aktifitas protease (Bergmeyer dan Grassl, 983) 2

4 Pemurnian Enzim Tahap pemurnian enzim meliputi ekstraksi enzim kasar, penambahan silika, pemekatan menggunakan garam ammonium sulfat jenuh, dialisis serta fraksinasi enzim menggunakan Sodium Dodecil Sulfat Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDSPAGE) dan zimogram untuk mengetahui bobot molekul enzim protease. Penelitian ini menggunakan buffer asetat ph 5, dicampur dengan EDTA 5mM, Polyvinyl pyrrolydone (PVP K 30) 0%, gliserol 0% dan β merkaptoethanol 4mM. Buffer yang diperlukan untuk ekstraksi disiapkan pada hari yang sama dengan hari ekstraksi. Sampel daun (0g) dipotongpotong dan ditambah buffer ekstraksi bersuhu 4 o C (daun : buffer ekstraksi = : 5), kemudian diblender dengan kecepatan tinggi (4 x 5 detik) dengan wadah yang dikelilingi oleh es batu, selanjutnya disaring menggunakan kain saring (2 lapis) dan filtrat disentrifus dingin 4 o C 3775g (5900 rpm) selama 30 menit sehingga dihasilkan supernatan ekstrak enzim kasar. Supernatan yang didapat ditambah dengan silika,4% dan divorteks selama 5 menit dan disentrifus 4 o C pada 3775g (5900 rpm) selama 5 menit. Supernatan yang dihasilkan adalah ekstrak hasil penambahan silika (ekstrak silika). Supernatan yang didapat selanjutnya diendapkan menggunakan ammonium sulfat 00% jenuh. Ammonium sulfat yang ditambahkan 00% dengan tujuan untuk mengendapkan semua protein yang ada. Endapan enzim dipisahkan menggunakan sentrifus dingin 4 o C 972,2g (3500 rpm). Endapan enzim selanjutnya didialisis menggunakan kantung dialisis atau membran selulosa Sigma seri D9652 dengan diameter 2mm, panjang 0cm. Sebelum melakukan dialisis, kantung selulosa dipersiapkan terlebih dahulu. Sepanjang 0cm kantung dialisis dicuci dengan air mengalir selama 34 jam, kemudian direndam dalam larutan Na sulfit 0.3% selama menit pada suhu 80 o C. Kantung dialisis dicuci menggunakan air bersuhu 60 o C selama 2 menit dan diasamkan dengan larutan asam sulfat 0,2%. Sisa asam dihilangkan dengan cara membilas kantung dialisis menggunakan air bersuhu 60 o C. Dialisis endapan enzim dilakukan selama 5 jam dengan wadah dikelilingi dengan es batu. Setiap jam buffernya diganti dan selanjutnya sampel difraksinasi dengan SDSPAGE dan 22

5 zimogram untuk mengetahui bobot molekul protease (Bollag dan Edestein, 99). Setiap tahap pemurnian diukur massa yang masuk dan massa keluar dan massa yang hilang (Gambar 4). Kehilangan massa terbesar terjadi pada saat pemblenderan dan penyaringan karena ampas tertinggal di dalam blender dan kertas saring. Pengamatan Kadar Air (AOAC, 999) Sejumlah sampel (2g) dimasukkan ke dalam cawan yang telah diketahui beratnya. Kemudian cawan dimasukkan ke dalam oven bersuhu 05 o C hingga diperoleh berat yang konstan. Perhitungan kadar air dilakukan berdasarkan berat basah dengan menggunakan rumus : Kadar air (%b/b) = a b c Dimana : 00% a = berat cawan dan sampel awal (g) b = berat cawan dan sampel akhir (g) c = berat sampel awal (g) Kadar Protein (AOAC, 999) Sejumlah sampel (00250mg) ditimbang ke dalam labu Kjeldahl. Kemudian ditambahkan.9 ± 0.g K 2 SO 4, 40 ± 0mg HgO dan 2 ± 0.ml H 2 SO 4. Sampel dididihkan selama.5 jam dengan kenaikan suhu secara bertahap sampai cairan menjadi jernih, lalu didinginkan. Sejumlah kecil akuades diteteskan secara perlahan lewat dinding labu kemudian labu digoyang pelan agar kristal yang terbentuk larut kembali. Isi labu kemudian dipindahkan ke dalam alat destilasi dan labu dibilas 56 kali dengan 2ml akuades. Selanjutnya ditambahkan 80ml larutan 60% NaOH5% Na 2 S 2 O 3 ke dalam alat destilasi. Erlenmeyer yang berisi 5ml H 3 BO 3 dan 2 tetes indikator metilen redmetilen blue diletakkan di bawah kondensor dengan kondisi ujung kondensor terendam di bawah larutan H 3 BO 3. 23

6 Daun mengkudu DM :0g; DT:0g Buffer asetat ph 5 DM : 50g; DT: 50g Pemblenderan dan penyaringan Ampas DM: 3.30g; DT:3,57g Hilang (loss) DM:7.49g; DT:7.94g Filtrat DM:49.2g; DT:48.49g Sentrifugasi Ampas DM:.70g; DT:.63g Ekstrak kasar DM:46.66g;DT:46.03g Hilang (loss) DM:0.7g; DT:2.86g Silika.4% DM:0.63g; DT:0.64g Sentrifugasi Ampas DM:2.82g; DT:2.9g Ekstrak silika DM:42.30;DT:4.5 Hilang (loss) DM: 2.7g; DT:2.26g Garam ammonium sulfat DM:2.46g; DT:2.06g Pengendapan Supernatan DM:52.03g; DT:49.78g Hilang (loss) DM:4.8g; TK4:5.36g Endapan DM:6.92g; DT:7.42g Buffer diganti setiap jam selama 5 jam Dialisis Dialisat DM:7.8mL; DT:7.5mL Gambar 4. Diagram Neraca Massa selama Tahapan Pemurnian (DM : daun pucuk, DT : daun pangkal) 24

7 Destilasi dilakukan hingga diperoleh destilat sebanyak ±5ml. Destilat yang diperoleh selanjutnya diencerkan hingga ± 50ml dan dititrasi dengan HCl terstandar sampai terjadi perubahan warna menjadi abuabu. Perhitungan kadar protein dilakukan dengan rumus : % N = Kadar protein Kadar Abu (AOAC, 999) [(ml HClml blanko) N HCl mg sampel g protein 00g bahan basah = %N 6.25 Sampel ditimbang 3.0g dalam cawan pengabuan, sampel diarangkan sampai tidak berasap di oven. Sampel yang sudah menjadi arang dimasukkan pada tanur 600 o C. Sampel yang sudah menjadi abu didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Kadar abu (% b b ) = Kadar Lemak (AOAC, 999) berat abu berat sampel 00 Labu lemak dikeringkan dengan oven, didinginkan dalam desikator dan ditimbang sebelum digunakan. Sampel ditimbang 3.0g, dibungkus dengan kertas saring dan diekstraksi soxhlet menggunakan pelarut heksan selama 6 jam. Labu lemak hasil ekstraksi dioven, didinginkan dalam desikator dan ditimbang sampai tercapai berat konstan. Kadar lemak (% b berat lemak ) = b berat sampel 00 Aktifitas Enzim (Bergmeyer dan Grassl, 983) Aktifitas protease diukur mengikuti prosedur seperti pada Tabel 4. Pereaksi disiapkan terlebih dahulu. Supernatan yang sudah diwarnai diukur absorbansinya pada 578nm. Aktifitas protease dihitung berdasarkan rumus : Aktiitas protease ( U A sampel A blanko) ) = (/T) x FP ml A standar A blanko 25

8 Dimana : A : absorbansi T : waktu inkubasi (35 menit) FP: faktor pengenceran Satu unit aktifitas protease didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan µmol produk tirosin per menit pada kondisi pengukuran. Specific Activity (Harris dan Angal, 989) Specific activity atau aktifitas spesifik dihitung berdasarkan persamaan : Speciic activity ( U mg ) = Aktiitas enzim (U) total protein (mg) Recovery (%) (Harrris, 989) Recovery (%) dihitung berdasarkan persamaan : Recovery % = total aktiitas enzim tahap (n) total aktiitas enzim tahap (n ) Purification fold (Harris, 989) Purification fold dihitung berdasarkan persamaan berikut : Puriicat ion fold = Neraca Massa (Toledo, 99) speciic activity tahap (n) speciic activity tahap (n ) Neraca massa dihitung berdasarkan prinsip jumlah massa yang masuk sama dengan jumlah massa yang keluar. Neraca massa dihitung berdasarkan persamaan berikut : Massa yang masuk (g) = massa yang keluar (g) + kehilangan massa(g) 26

9 Tabel 4. Pengujian Aktifitas Enzim Metode Bergmeyer dan Grassl (983) Pereaksi Sampel (ml) Blanko (ml) Standar (ml) Bufer borat ph 8 Bufer kasein HCl 0.02 M Larutan enzim protease Akuades Tirosin 5 mm 0.2 0, Inkubasi 35 menit, 37 o C TCA 0. M CaCl Inkubasi 37 o C, 0 menit dilanjutkan dengan sentrifus 448.9g selama 0 menit Supernatan Na 2 CO M Pereaksi FolinCiocalteau Inkubasi 37 o C, 20 menit dan diukur absorbansi pada 578 nm.5 5 Kadar Protein ( Bradford, 976) Sebelum mengukur absorbansi sampel, terlebih dahulu dipersiapkan blanko dan standar sehingga dapat dibuat kurva standar yang digunakan untuk menghitung konsentrasi protein sampel. Standar yang digunakan adalah BSA. Untuk blanko, sebanyak 00ul akuades ditambahkan 5ml pereaksi Bradford dan diukur absorbansinya pada 595nm. Pembuatan standar BSA untuk pembuatan kurva standar adalah sebanyak 00ul larutan BSA (00000ug/ml) dipipet ke dalam tabung reaksi berukuran.2 x 0cm. Kemudian ditambahkan 5ml pereaksi Bradford. Larutan divorteks dan diukur secara spektrofotometri pada λ= 595nm setelah 5 menit. Kurva standar yang diperoleh digunakan untuk mengukur konsentrasi sampel daun pucuk dan daun pangkal. Sampel yang akan dianalisa diambil sebanyak 00µL ditambah 5mL pereaksi bradford, divortek dan didiamkan selama 5 menit, kemudian diukur absorbansi sampel dan dihitung kadar protein. 27

10 Elektroforesis Gel dan Zimogram SDSPAGE Untuk mengetahui bobot molekul protein yang terdapat pada endapan enzim maka digunakan elektroforesis SDSPAGE (Sodium Dodecil Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis). Komposisi gel untuk SDSPAGE dan zimogram dapat dilihat pada Tabel 5. Tabel 5. Komposisi Gel Pemisah dan Gel Penahan SDSPAGE dan Zimogram Bahan Gel Pemisah 2% Gel Penahan 5% Zimogram Aqua bidestilata 3.5mL 2.3mL 2.mL Akrilamid 30% 4.0mL 0.67mL 4.2mL.5M tris HCl ph mL 2.5mL 0.5 M tris HCl ph 6.8.0mL Kasein %.0mL Ammonium persulfat 50µL 30µL 00µL TEMED 5µL 5µL 0µL Jumlah ~0mL ~4mL 0mL Pembuatan Gel Disiapkan sepasang gel elektroforesis, yang terdiri dari gel pemisah (separating gel) dan gel penahan (stacking gel). Bahan kimia yang diperlukan untuk gel pemisah disiapkan, dicampur, diaduk dengan pengaduk magnet, dan dengan cepat diisikan ke dalam plat pembentuk gel. Gel akan terbentuk setelah 3045 menit.larutanlarutan untuk gel penahan disiapkan, dicampur dan diaduk dengan pengaduk magnet dan diisikan pada plat pembentuk gel, di atas gel pemisah. Sisir disiapkan pada larutan gel penahan yang akan mengalami polimerisasi untuk membentuk sumursumur elektroforesis. Gel terbentuk setelah 530 menit. Penyiapan Larutan Sampel dan Protein Marker Protein sampel dan protein penanda masingmasing 40µL dicampur dengan buffer sampel sebanyak 0µL dimasukkan dalam tabung eppendorf dan dipanaskan pada penangas air mendidih selama 5 menit. Protein sampel yang 28

11 diinjeksikan sebanyak 0µL dan 7µL untuk protein penanda.protein sampel dan penanda dimasukkan ke dalam sumur elektroforesis menggunakan Syringe Hamilton. Running Elektroforesis Gel yang diisi dengan larutan sampel dan protein penanda dipasang pada piranti elektroforesis. Sebanyak 400mL buffer elektroforesis dituangkan pada tempatnya, sehingga permukaan gel terendam sedalam kirakira 2cm. Elektroforesis dijalankan dengan mengalirkan arus listrik 70V untuk dua gel. Elektroforesis dihentikan setelah warna biru BPB mencapai kirakira 0.5cm dari batas bawah gel pemisah. Gel hasil elektroforesis dilepas dari plat menggunakan spatula dan siap dilakukan pewarnaan protein. Pewarnaan Protein Comassie Blue Gel pemisah hasil elektroforesis direndam dalam larutan pewarna gel selama 20 menit sambil digoyang konstan pada mesin penggoyang. Kelebihan warna dihilangkan dengan larutan peluntur warna sampai diperoleh pitapita protein berwarna biru dengan latar belakang jernih. Bobot molekul (BM) proteinprotein dalam sampel ditentukan dengan menghitung nilai Rf dari masingmasing pita yang nampak, kemudian diplotkan pada kurva standar log BM terhadap Rf protein penanda. Pewarnaan dengan Silver Stain (Moertz et al. 200) Pewarnaan silver disebutkan kali lebih sensitif dibanding pewarnaan dengan comassie (CBB). Pewarnaan ini bisa mendeteksi ng/mm 2 gel protein (Harris dan Angal, 989). Zimogram Pembuatan Gel Disiapkan sepasang gel elektroforesis, yang terdiri dari gel pemisah dan gel penahan. Komposisi gel pemisah dan gel penahan seperti pada Tabel 5. Bahan 29

12 kimia yang diperlukan untuk gel pemisah disiapkan, dicampur, diaduk dengan pengaduk magnet, dan dengan cepat diisikan ke dalam plat pembentuk gel. Gel akan terbentuk setelah 3045 menit. Larutanlarutan untuk gel penahan disiapkan, dicampur dan diaduk dengan pengaduk magnet dan diisikan pada plat pembentuk gel, di atas gel pemisah. Sisir disiapkan pada larutan gel penahan yang akan mengalami polimerisasi untuk membentuk sumursumur elektroforesis. Gel terbentuk setelah 530 menit. Penyiapan Larutan Sampel dan Protein Marker Protein sampel dan protein penanda masingmasing 40µl dicampur dengan buffer sampel sebanyak 0µl dimasukkan dalam tabung eppendorf. Protein sampel yang diinjeksikan sebanyak 8µL dan 5µL untuk protein penanda.protein sampel dan penanda dimasukkan ke dalam sumur elektroforesis menggunakan Syringe Hamilton. Running Elektroforesis Gel yang diisi dengan larutan sampel dan protein penanda dipasang pada piranti elektroforesis. Sebanyak 400mL buffer elektroforesis dituangkan pada tempatnya, sehingga permukaan gel terendam sedalam kirakira 2cm. Elektroforesis dijalankan dengan mengalirkan arus listrik 70V untuk dua gel. Elektroforesis dihentikan setelah warna biru BPB mencapai kirakira 0.5cm dari batas bawah gel pemisah. Gel hasil elektroforesis dilepas dari plat menggunakan spatula dan siap dilakukan pewarnaan protein. Inkubasi Gel pemisah hasil elektroforesis direndam dalam larutan Triton X00 2.5% selama jam sambil digoyang pada mesin penggoyang. Setelah itu gel direndam didalam larutan buffer asetat ph 5 dan diinkubasikan selama jam dan semalaman. 30

13 Pewarnaan Protein Comassie Blue Gel pemisah hasil elektroforesis direndam dalam larutan pewarna gel selama 20 menit sambil digoyang konstan pada mesin penggoyang. Kelebihan warna dihilangkan dengan larutan peluntur warna sampai diperoleh pitapita protein berwarna biru dengan latar belakang jernih. Bobot molekul (BM) proteinprotein dalam sampel ditentukan dengan menghitung nilai Rf dari masingmasing pita yang nampak, kemudian diplotkan pada kurva standar log BM terhadap Rf protein penanda. Pendugaan Kelas Protease Daun Mengkudu Tahap ini dilakukan untuk menduga kelas protease dari daun mengkudu. Pendugaan dilakukan menggunakan literatur, studi pustaka dan bank data yang tersedia. 3