PRODUKSI LAKASE DARI Marasmius sp. MENGGUNAKAN BIOREAKTOR IMERSI BERKALA TERMODIFIKASI UNTUK PEMUTIHAN PULP KIMIA TESIS

Transkripsi

1 PRODUKSI LAKASE DARI Marasmius sp. MENGGUNAKAN BIOREAKTOR IMERSI BERKALA TERMODIFIKASI UNTUK PEMUTIHAN PULP KIMIA TESIS Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister dari Institut Teknologi Bandung oleh HENDRO RISDIANTO NIM: Program Studi Teknik Kimia INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2007 i

2 ABSTRAK PRODUKSI LAKASE DARI Marasmius sp. MENGGUNAKAN BIOREAKTOR IMERSI BERKALA TERMODIFIKASI UNTUK PEMUTIHAN PULP KIMIA oleh Hendro Risdianto NIM: Pulp dari proses kraft harus diputihkan untuk mendapatkan kertas putih. Pemutihan biasanya dilakukan dengan reaksi bertahap yang melibatkan klor dan natrium hidroksida. Limbah yang berbahaya akan dihasilkan dari proses pemutihan menggunakan senyawa klor yang terdeteksi sebagai Adsorbable Organic Halide (AOX). Usaha untuk mengurangi efek negatif proses pemutihan telah banyak usaha dilakukan diantaranya dengan pemutihan sistem Elemental Chlorine Free (ECF) dan Totally Chlorine Free (TCF). Pada pemutihan ECF menggunakan senyawa klordioksida, sementara pada TCF menggunakan senyawa selain klor untuk memutihkan pulp. Salah satu bahan pemutih yang ramah lingkungan adalah enzim pendegradasi lignin. Enzim pendegradasi lignin yang telah banyak digunakan dalam industri pulp dan kertas adalah lakase. Penelitian ini difokuskan pada produksi lakase untuk proses pemutihan pulp. Pada penelitian ini dilakukan empat tahapan penelitian yaitu (a) pemilihan spesies jamur untuk produksi lakase, (b) pemilihan media imobilisasi, (c) produksi lakase dalam bioreaktor imersi termodifikasi dan (d) penggunaan enzim kasar lakase untuk pemutihan pulp kimia. Penelitian pemilihan jamur menunjukkan bahwa Marasmius sp. mempunyai pertumbuhan dan kemampuan delignifikasi yang lebih baik daripada Trametes hirsuta. Laju rata-rata pertumbuhan koloni Marasmius sp. sebesar 20,68 mm/hari, nilai ini lebih tinggi daripada Trametes hirsuta sebesar 14,17 mm/hari. Laju pertumbuhan koloni arah radial Marasmius sp. (25,05 mm/hari) juga lebih tinggi daripada Trametes hirsuta (17,45 mm/hari). Demikian pula untuk laju pertumbuhan spesifik Marasmius sp. (2,06/hari) lebih tinggi daripada Trametes hirsuta (1,33/hari). Pada uji degradasi lignin menunjukkan bahwa Marasmius sp. mampu mendegradasi lignin dalam medium agar secara sempurna setelah 60 hari inkubasi. Sedangkan Trametes hirsuta menunjukkan aktivitas yang kurang efektif walaupun kedua jamur tersebut menghasilkan enzim ekstraseluler. Berdasarkan hasil ini maka Marasmius sp. dipilih untuk penelitian selanjutnya. Penelitian pertumbuhan Marasmius sp. pada media imobilisasi dilakukan untuk memilih bahan terbaik sebagai media imobilisasi Marasmius sp. dalam kultur rendam berkala. Pemilihan dilakukan terhadap medium sintetis (bioball dan sabut i

3 penggosok) dan media alami (bulustru/luffa). Penentuan media yang dipilih berdasarkan pengamatan visual pertumbuhan jamur. Hasil penelitian menunjukkan bahwa bulustru merupakan media terbaik untuk pertumbuhan Marasmius sp. Dengan demikian bulustru dipilih sebagai media imobilisasi Marasmius sp. Penelitian produksi lakase dari Marasmius sp. yang terimobilisasi menggunakan bulustru dalam bioreaktor imersi berkala termodifikasi dilakukan untuk mempelajari pengaruh variasi waktu imersi. Waktu imersi yang digunakan pada penelitian ini adalah 15 menit, 12 jam dan 24 jam. Hasil penelitian menunjukkan bahwa waktu imersi 12 jam menghasilkan lakase dengan aktivitas paling tinggi. Aktivitas lakase maksimum yang diperoleh pada waktu imersi 12 jam adalah 457,6 U/l, lebih tinggi dibandingkan waktu imersi 15 menit (348,4 U/l) dan waktu imersi 24 jam (281,9 U/l). Namun, waktu imersi 12 jam tidak menunjukkan produktivitas kultur tertinggi. Variasi waktu 15 menit menghasilkan produktivitas kultur tertinggi (348,4 U/l/hari), kemudian berikutnya adalah waktu imersi 24 jam (281,9 U/l/hari) dan waktu imersi 12 jam (152,5 U/l/hari). Aktivitas lakase pada siklus kedua untuk semua variasi waktu imersi menunjukkan bahwa aktivitas lakase yang dihasilkan lebih rendah dibandingkan siklus pertama. Persentase penurunan tertinggi terjadi pada waktu imersi 24 jam (80,66%) selanjutnya diikuti oleh waktu imersi 12 jam (64,30%), dan 15 menit (3,83%). Penurunan aktivitas lakase pada siklus kedua diperkirakan karena adanya enzim lain (kemungkinan besar adalah selulase). Aktivitas lakase dapat juga dinyatakan dengan Unit per mg total protein (U/mg protein). Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas lakase yang dihasilkan pada siklus pertama lebih tinggi daripada siklus kedua. Aktivitas lakase pada siklus pertama untuk waktu imersi 12 jam adalah 7,46 U/(mg protein), waktu imersi 15 menit adalah 3,49 U/(mg protein), dan waktu imersi 24 jam adalah 2,57 U/(mg protein). Penurunan aktivitas lakase pada siklus kedua untuk waktu imersi 15 menit, 12 jam dan 24 jam masing-masing adalah 58,08%; 82,24%; 91,68%. Penelitian penggunaan lakase untuk pemutihan pulp menunjukkan bahwa perlakuan awal menggunakan enzim kasar lakase menghasilkan peningkatan derajat putih pulp yang masih terbatas. Perlakuan ini dilaksanakan dengan dan tanpa ABTS sebagai mediator. Pemutihan pulp menggunakan enzim kasar sengan bantuan ABTS selama 6 jam dan suhu 45 C dapat meningkatkan derajat putih sebesar 2,8 poin. Sedangkan pada kondisi yang sama namun tanpa penambahan ABTS dapat meningkatkaan derajat putih 0,7 poin. Hal ini menunjukkan bahwa pengunaan ABTS dapat meningkatkan proses pemutihan. Sementara penggunaan enzim kasar selama 6 hari dapat meningkatkan derajat putih sebesar 5,3 poin. Analisis distribusi serat sebelum dan sesudah perlakuan awal penggunaan enzim selama 6 hari mengakibatkan adanya pemotongan serat yang cukup banyak, kemungkinan disebabkan oleh selulase. Sedangkan pada penggunaan ABTS tidak terlalu banyak terjadi pemotongan serat. Oleh karena itu, perlu adanya perbaikan produksi lakase untuk mendapatkan aktivitas yang lebih tinggi dan mengurangi adanya selulase. Kata kunci: jamur pelapuk putih, Marasmius sp., laccase, bioreaktor imersi berkala termodifikasi, bulustru, pemutihan, enzim kasar, derajat putih ii

4 ABSTRACT LACCASE PRODUCTION FROM Marasmius sp. USING A MODIFIED TEMPORARY IMMERSION BIOREACTOR FOR CHEMICAL PULP BLEACHING by Hendro Risdianto NIM : Pulp from kraft process was bleached in order to obtain white paper. The most common method to bleach pulp is chemical method, employing several phases of reactions using chlorine and natrium hydroxides. This bleaching process produces detrimental pollutant, detected as Adsorbable Organic Halide (AOX). There are several ways have been proposed to reduce the negative impacts of chemical bleaching process, Elemental Chlorine Free (ECF) system and Totally Chlorine Free (TCF) system. ECF system using chlordioxide compounds, whereas TCF system using non chlorine compounds for pulp bleaching. One of enviro-friendly pulp bleaching process is the application of lignindegrading enzymes to reduce or eliminate the use of chlorine compound. Lignindegrading enzyme used in many pulp and paper industries is laccase. This research was focusing on the development of method to produce laccase for pulp bleaching process. The research was divided into four phases of studies i.e.: (a). selection of fungi species for laccase production, (b). selection of support medium, (c). laccase production in a modified temporary immersion bioreactor and (d). utilisation of laccase crude enzyme in pulp bleaching process. Fungi selection study suggesting that Marasmius sp. exhibit a better performance in term of growth and delignification capability, compared to Trametes hirsuta. The Marasmius sp. showed a higher average colony growth rates (20.68 mm/day) compared to that of Trametes hirsuta (14.17 mm/day). The colony radial growth rates Marasmius sp. (25.05 mm/day) was also higher compared to that of Trametes hirsuta (17.45 mm/day). In addition to this, the Marasmius sp. exhibits a higher specific growth rates (2.06/day) compared to that of Trametes hirsuta (1.33/day). Further study on lignin degradation capability indicates that, eventhough both Marasmius sp. and Trametes hirsuta produced extracellular enzymes, only Marasmius sp. exhibited lignin degradation activity during 60 day incubation of fungi in lignin containing agar plate. Based on this study, Marasmius sp. was selected for future studies. Study on growth supporting medium was carried out to select the best material to support the growth of Marasmius sp. The experiment was carried out on synthetic medium (bioball and scouring pad) and natural medium (luffa sponges). Fungi iii

5 growth on the support media was determined based on visual observation. The study showed that Marasmius sp. grows best on luffa sponges, thus luffa sponges was selected as supporting medium for Marasmius sp. Experiments with cultivation of immobilised Marasmius sp. in a modified temporary immersion bioreactor were conducted to study the effect of variations of immersion periods in the production of laccase. The immersion periods applied in this study were 15 minutes, 12 hours and 24 hours. Results showed that immersion period of 12 hours exhibited the highest maximum laccase activity. Maximum level of laccase attained from culture with 12 hours immersion period was U/l, higher compared to that attained with 15 minutes (348.4 U/l) and 24 hours (281.9 U/l) immersion period. However, culture with 12 hours immersion period did not show the highest activity. Culture with 15 minutes immersion period exhibited the highest activity (348.4 U/l/day), followed by culture with 24 hours immersion period (281.9 U/l/day) and culture with 12 hours immersion period (152.5 U/l/day). Further study on second cycle of laccase activitiy shows that all culture in the second cycle produce laccase with lower activity compared to that of first culture. The highest decreasing percentage of laccase activity on 2 nd cycle occured during immersion period of 24 hours (80.66%) then followed with the 12 hours (64.30%) and 15 minutes (3.83%). The decreased in laccase activities possibly due to the production of other enzymes (most probably cellulase). Laccase activity can also be expressed as Unit per total protein (U/mg protein). The study showed that laccase activity in the 1 st cycle of Marasmius sp. cultivation was higher compared to that produced in the 2 nd cycle. Laccase activity in the 1 st cycle for 12 hours immersion period was 7.46 U/(mg protein), the 15 minutes immersion period was of 3.49 U/(mg protein) and the 24 hours immersion period was 2.57 U/(mg protein). The decreasing of laccase activity in 2 nd cycle for immersion period of 15 minutes, 12 hours and 24 hours were 58.08%, 82.24%, 91.68% respectively. Study on the application of laccase for pulp bleaching showed that pulp pretreatment with laccase crude enzymes gives a limited improvement on pulp brightness. The pretreatments have been conducted with and without addition of ABTS as mediator. Utilisation of crude enzymes by addition of ABTS mediator with enzyme exposure time 6 hours at temperature of 45 C increased brightness for 2.8 points. Pretreatment with similar conditions except that no ABTS was added demonstrated an increase in brightness for 0.7 point. It showed that addition of ABTS improved biobleaching process. Whereas pulp exposed to crude enzymes for 6 days at room temperature increased 5.3 points of pulp brightness. Analysis on the pulp fiber distribution before and after enzyme pretreatment showed that pretreatment using crude enzyme for 6 days lead to the reduction of fiber length, which is suggested due to the presence of cellulase. In contrast, a less reduction of fiber length reduction occured on addition of ABTS mediator. It is suggested that improvement of laccase production should be conducted to obtain a higher activity of laccase and reduce the production of cellulase. Keywords: white rot fungi, Marasmius sp., laccase, a modified temporary immersion bioreactor, luffa sponges, bleaching, crude enzyme, brightness iv

6 HALAMAN PENGESAHAN PRODUKSI LAKASE DARI Marasmius sp. MENGGUNAKAN BIOREAKTOR IMERSI BERKALA TERMODIFIKASI UNTUK PEMUTIHAN PULP KIMIA oleh Hendro Risdianto NIM : Program Studi Teknik Kimia Institut Teknologi Bandung Tanggal... Juli 2007 Menyetujui Pembimbing Utama (Prof. Dr. Tjandra Setiadi) Co-Pembimbing I Co-Pembimbing II (Dr. Sri Harjati Suhardi) Pusat Ilmu Hayati ITB (Dr. Wardono Niloperbowo) Pusat Ilmu Hayati ITB v

7 PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS Tesis S2 yang tidak dipublikasikan terdaftar dan tersedia di Perpustakaan Institut Teknologi Bandung, dan terbuka untuk umum dengan ketentuan bahwa hak cipta ada pada pengarang dengan mengikuti aturan HaKI yang berlaku di Institut Teknologi Bandung. Referensi kepustakaan diperkenankan dicatat, tetapi pengutipan atau peringkasan hanya dapat dilakukan seizin pengarang dan harus disertai dengan kebiasaan ilmiah untuk menyebutkan sumbernya. Memperbanyak atau menerbitkan sebagian atau seluruh tesis haruslah seizin Direktur Program Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung. vi

8 gxá á Ç átçt ÑxÜáxÅut{~tÇ âçàâ~ ~xwât ÉÜtÇz àât átçt? UtÑt~ eév{ w tçàé wtç \uâ g à Çz fâåtüç çtçz áxätäâ ÅxÇz Çztà~tÇ âçàâ~ uxüuâtà ut ~ ~xñtwt á tñt át}t àtçñt ÑtÅÜ { ~tüxçt áâtàâ áttà Ñtáà t~tç twt utätátç áxà ÅÑtÄA vii

9 KATA PENGANTAR Segala puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala petunjuk, bimbingan dan rahmat-nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini. Penelitian ini berjudul Produksi Lakase dari Marasmius sp. Menggunakan Bioreaktor Imersi Berkala Termodifikasi untuk Pemutihan Pulp Kimia. Penelitian ini tidak akan terlaksana tanpa bantuan dari berbagai pihak. Dalam kesempatan ini, penulis menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesarbesarnya kepada : 1. Prof. Dr. Tjandra Setiadi, Dr. Sri Harjati Suhardi dan Dr. Wardono Niloperbowo selaku dosen pembimbing, yang telah memberikan bantuan, saran dan bimbingan kepada penulis selama penelitian. 2. Segenap pimpinan Balai Besar Pulp dan Kertas, Departemen Perindustrian, Bandung, atas kesempatan yang diberikan kepada penulis sehingga dapat menempuh pendidikan Magister Program Studi Teknik Kimia ITB. 3. Dr. I Nyoman P. Aryantha yang telah memberikan izin melakukan penelitian di Pusat Ilmu Hayati ITB. 4. Drs. Wawan Kartiwa Haroen, MM., atas saran dan bimbingan selama ini. 5. Boy, Achie, Imma dan Arin yang telah banyak membantu pelaksanaan penelitian. 6. Rekan-rekan di Balai Besar Pulp dan Kertas dan Magister Teknik Kimia 2005 atas dukungannya selama ini. Penulis menyadari bahwa laporan penelitian ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu, penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk kesempurnaan penelitian ini. Bandung, Juli 2007 Penulis viii

10 DAFTAR ISI ABSTRAK... i ABSTRACT... iii HALAMAN PENGESAHAN... v PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS... vi HALAMAN PERUNTUKAN... vii KATA PENGANTAR... viii DAFTAR ISI... ix DAFTAR LAMPIRAN... xii DAFTAR GAMBAR DAN ILUSTRASI... xiii DAFTAR TABEL... xv Bab I Pendahuluan... 1 I.1 Latar Belakang... 1 I.2 Perumusan Masalah. 3 I.3 Tujuan Penelitian... 5 I.4 Ruang Lingkup... 5 Bab II Tinjauan Pustaka... 7 II.1 Pembuatan Pulp... 7 II.1.1 Proses Mekanis... 9 II.1.2 Proses Kimia II.1.3 Proses Semikimia II.2 Pemutihan Pulp II.2.1 Tahap-tahap Pemutihan Konvensional II.2.2 Teknologi Pemutihan Pulp Ramah Lingkungan II.3 Penggunaan Enzim pada Pemutihan Pulp II.4 Mekanisme Biodegradasi Lignin II.5 Produksi Lakase dalam Bioreaktor Bab III Rancangan Penelitian III.1 Metodologi III.2 Bahan dan Alat ix

11 III.2.1. Bahan III.2.2 Alat III.3 Alur Penelitian III.4 Analisis Parameter Penelitian Bab IV Pemilihan Jamur untuk Produksi Lakase IV.1 Pendahuluan IV.2 Bahan dan Metode IV.2.1 Mikroorganisme IV.2.2 Uji Laju Pertumbuhan IV.2.3 Uji Degradasi Lignin IV.2.4 Uji Kualitatif Enzim Ekstraseluler IV.3 Hasil dan Pembahasan IV.3.1 Laju Pertumbuhan Jamur IV.3.2 Uji Degradasi Lignin IV.3.3 Uji Kualitatif Enzim Ekstraseluler IV.4 Kesimpulan Bab V Pemilihan Bahan Imobilisasi Jamur V.1 Pendahuluan V.2 Bahan dan Metode V.2.1 Mikroorganisme V.2.2 Media Imobilisasi V.3 Hasil dan Pembahasan V.4 Kesimpulan Bab VI Produksi Lakase dari Marasmius sp. dalam Bioreaktor Imersi Berkala Termodifikasi VI.1 Pendahuluan VI.2 Bahan dan Metode VI.2.1 Mikroorganisme VI.2.2 Konfigurasi Bioreaktor VI.2.3 Media Imobilisasi VI.2.4 Medium Pertumbuhan Marasmius sp VI.2.5 Kultivasi Marasmius sp x

12 VI.2.6 Uji Aktivitas Lakase VI.2.7 Pengukuran Konsentrasi Protein VI.3 Hasil dan Pembahasan VI.4 Kesimpulan Bab VII Penggunaan Lakase pada Pemutihan Pulp Kimia VII.1 Pendahuluan VII.2 Bahan dan Metode VII.2.1 Enzim VII.2.2 Pulp VII.2.3 Perlakuan awal (pretreatment) Pemutihan Menggunakan Enzim VII.2.4 Pemutihan Lanjutan VII.2.5 Analisis Pulp Hasil Pemutihan VII.3 Hasil dan Pembahasan VII.4 Kesimpulan Bab VIII Kesimpulan dan Saran VIII.1 Kesimpulan VIII.2 Saran Daftar Pustaka xi

13 DAFTAR LAMPIRAN Lampiran A Contoh Perhitungan Aktivitas Lakase Lampiran B Komposisi, Pembuatan Larutan Bradford dan Kurva Standar Protein Lampiran C Cara Uji Derajat Putih (SNI ) Lampiran D Cara Uji Fraksionasi Serat Pulp (Metode Mc Nett) (SNI ) xii

14 DAFTAR GAMBAR DAN ILUSTRASI Gambar II.1 Struktur selulosa... 7 Gambar II.2 Struktur serat tunggal... 8 Gambar II.3 Struktur lignin... 8 Gambar II.4 Perubahan struktur lignin selama pemasakan proses kraft Gambar II.5 Struktur dioksin Gambar II.6 Struktur furan Gambar II.7 Mekanisme biodegradasi lignin Gambar II.8 Skema temporary immersion bioreactor Gambar II.9 Skema bioreaktor imersi produksi lakase Gambar III.1 Jamur pelapuk putih dalam media agar miring Gambar III.2 Media imobilisasi jamur Gambar III.3 Skema bioreaktor imersi berkala termodifikasi Gambar III.4 Alur penelitian Gambar IV.1 Fase pertumbuhan mikroorganisme pada kultur curah Gambar IV.2 Tipikal pertumbuhan jamur arah radial Gambar IV.3 Pertumbuhan koloni arah radial Gambar IV.4 Kurva pertumbuhan jamur arah radial Gambar IV.5 Laju pertumbuhan spesifik Gambar IV.6 Lindi hitam Gambar IV.7 Degradasi lignin oleh jamur pelapuk putih dalam medium padat Gambar IV.8 Uji kualitatif enzim pendegradasi lignin Gambar V.1 Media imobilisasi jamur Gambar V.2 Pertumbuhan Marasmius sp. pada media imobilisasi Gambar VI.1 Degradasi kayu pinus oleh jamur pelapuk putih oleh Phellinus pini. Bagian berwarna putih merupakan daerah delignifikasi atau penyisihan lignin dan bukan merupakan degradasi selulosa Gambar VI.2 Degradasi kayu oleh jamur pelapuk coklat xiii

15 Gambar VI.3 Degradasi kayu oleh jamur pelapuk lunak Gambar VI.4 Skema temporary immersion bioreactor Gambar VI.5 Skema bioreaktor imersi produksi lakase Gambar VI.6 Bioreaktor imersi termodifikasi Gambar VI.7 Oksidasi lakase oleh ABTS menjadi radikal kation (ABTS + ) 62 Gambar VI.8 Aktivitas lakase pada siklus pertama; : waktu imersi 15 menit, : waktu imersi 12 jam, : waktu imersi 24 jam Gambar VI.9 Pengujian stabilitas lakase Gambar VI.10 Aktivitas maksimum lakase pada siklus pertama Gambar VI.11 Produktivitas kultur pada siklus pertama Gambar VI.12 Aktivitas lakase pada siklus kedua; : waktu imersi 15 menit, : waktu imersi 12 jam, : waktu imersi 24 jam Gambar VI.13 Aktivitas maksimum lakase; : siklus pertama dan : siklus kedua Gambar VI.14 Aktivitas lakase;, : waktu imersi 15 menit;, : waktu imersi 12 jam;, : waktu imersi 24 jam Gambar VI.15 Aktivitas maksimum lakase; : siklus pertama dan : siklus kedua Gambar VII.1 Prekursor penyusun lignin; a. p-coumaryl alcohol (phydroxyphenol), b. coniferyl alcohol (guaiacyl), c. sinapyl alcohol (syringyl) Gambar VII.2 Mekanisme oksidasi substrat oleh lakase Gambar VII.3 Mekanisme difusi mediator pada dinding sekunder serat Gambar VII.4 Penurunan aktivitas lakase selama perlakuan awal pemutihan : sebelum, : sesudah Gambar VII.5 Derajat putih lembaran pulp Gambar VII.6 Fraksionasi serat xiv

16 DAFTAR TABEL Tabel I.1 Penelitian penggunaan enzim pada proses pembuatan pulp 2 dan kertas Tabel II.1 Perbandingan proses pembuatan pulp Tabel III.1 Komposisi medium Potato Dextrose Agar Tabel III.2 Komposisi medium Kirk Tabel III.3 Komposisi medium utama Tabel III.4 Komposisi trace element Tabel IV.1 Pertumbuhan koloni jamur arah radial Tabel VI.1 Aktivitas maksimum lakase pada berbagai penelitian Tabel VII.1 Pemutihan konvensional pulp kraft softwood menggunakan Laccase Mediator System (LMS) Tabel VII.2 Penggunaan lakase skala pilot Tabel VII.3 Hasil pemutihan menggunakan lakase Tabel VII.4 Kondisi pemutihan menggunakan enzim kasar lakase Tabel VII.5 Kondisi pemutihan lanjutan Tabel VII.6 Hubungan ukuran saringan dengan panjang serat xv