BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Pelaksanaan Penanaman Brokoli Perbanyakan Serangga Uji Crocidolomia pavonana

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE 19 Tempat dan Waktu Pelaksanaan Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi dan Toksikologi Serangga, Departemen Proteksi Tanaman, Institut Pertanian Bogor (IPB) dan Kebun Percobaan Cikabayan IPB mulai Maret 2008 hingga Juni Penanaman Brokoli Benih brokoli (Brassica oleracea L. var. italica Plenck cv. Liberty; Petoseed, Onard, California) disemai pada nampan plastik yang berisi tanah dan pupuk kandang dengan perbandingan 3:1. Bibit yang telah berumur 3 minggu dipindahkan ke polybag kapasitas 5 L sebanyak satu bibit per polybag. Pemeliharaan meliputi penyiraman, penyiangan, dan pemupukan. Tanaman dipupuk dengan NPK (15:15:15) sebanyak 0,4 g per polybag pada saat tanaman berumur 3-4 minggu. Daun yang diambil dari tanaman yang berumur 2 bulan digunakan sebagai pakan larva Crocidolomia pavonana dan Plutella ylostella. Perbanyakan Serangga Uji Crocidolomia pavonana Larva C. pavonana diperbanyak di Laboratorium Fisiologi dan Toksikologi Serangga, Departemen Proteksi Tanaman IPB. Larva tersebut diberi pakan daun brokoli dalam wadah plastik (13 cm 11 cm 5 cm) yang bagian atasnya berjendela kasa sampai larva menjelang berpupa. Pemeliharaan dilakukan setiap hari dan pakan diganti dua hari sekali atau sesuai kebutuhan. Menjelang berpupa, larva dipindahkan ke dalam wadah plastik lain yang berisi serbuk gergaji sebagai medium berpupa. Pupa yang terbentuk dikeluarkan dari wadah dan dipindahkan ke dalam kurungan plastik-kasa berbingkai kayu (40 cm 40 cm 40 cm). Imago yang muncul diberi pakan larutan madu (10%) yang diserapkan pada gumpalan kapas. Dua hari setelah kemunculan imago, ke dalam kurungan dimasukkan daun brokoli yang ditempatkan dalam botol film berisi air sebagai tempat peletakan telur. Telur yang menempel di permukaan daun dipindahkan ke dalam kotak

2 20 plastik (5 cm 25 cm 5 cm) sampai menetas. Larva dipelihara seperti di atas sampai beberapa generasi. Larva instar II digunakan untuk percobaan dan selebihnya digunakan untuk perbanyakan selanjutnya. Plutella ylostella Perbanyakan P. ylostella dilakukan seperti cara perbanyakan C. pavonana di atas. Setelah larva memasuki instar IV akhir, larva dibiarkan berpupa pada daun pakan. Selanjutnya pupa dipindahkan ke dalam kurungan plastik bening berbentuk tabung (garis tengah 20 cm, tinggi 50 cm) hingga terbentuk imago. Larva yang digunakan untuk percobaan adalah larva instar II. Diadegma semiclausum Perbanyakan parasitoid D. semiclausum menggunakan larva instar III P. ylostella sebagai inangnya. Satu ekor imago betina D. semiclausum dipajankan pada ekor larva P. ylostella dalam kurungan plastik (diameter 7,5 cm dan tinggi 20 cm) selama 24 jam. Setelah itu parasitoid dikeluarkan dari kurungan dan diberi larva inang baru. Larva inang dipelihara hingga terbentuk imago parasitoid. Imago D. semiclausum yang berhasil keluar dari kokon dipindahkan ke dalam kurungan plastik berbentuk tabung dengan garis tengah 10 cm dan tinggi 25 cm. Imago D. semiclausum diberi makan madu 10% yang diserapkan pada gumpalan kapas. Imago D. semiclausum yang berumur 2-3 hari setelah keluar dari kokon digunakan untuk percobaan. Bahan Uji Bahan tumbuhan yang digunakan sebagai sumber ekstrak ialah buah cabai jawa (Piper retrofractum) dan daun kacang babi (Tephrosia vogelii), yang masing-masing dibeli dari kios obat tradisional di Bogor dan Lembaga Pertanian Sehat, Dompet Dhuafa Republika di Kecamatan Caringin, Kabupaten Bogor (636 m dpl, ,7 LS dan ,5 BT). Sebagai insektisida pembanding digunakan formulasi yang mengandung bahan aktif Bacillus thuringiensis (Ture

3 21 WP, delta-endotoksin B. thuringiensis var. aizawai strain GC-91 3,8%, IU/mg) dan profenofos (Curacron 500 EC, kadar bahan aktif 499,53 g/l), yang masing-masing diperoleh dari PT. Tanindo Subur Prima dan PT. Syngenta Indonesia, Jakarta. Ekstraksi dan aksinasi P. retrofractum dan T. vogelii Ekstraksi P. retrofractum dan T. vogelii Simplisia bahan uji dihaluskan dengan blender dan diayak dengan pengayak bermata 0,5 mm. Serbuk P. retrofractum 150 g diekstrak dengan pelarut etil asetat dengan teknik perkolasi. Perendaman ulang dilakukan hingga larutan hasil perkolasi tidak berwarna. Hasil perkolasi ditampung dalam labu penguap, kemudian diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 50 C dan tekanan 337 mbar. Pelarut yang diperoleh kembali dari penguapan digunakan untuk perkolasi ulang ampas ekstrak tersebut. Ekstrak T. vogelii diperoleh dengan cara maserasi 300 g serbuk dengan pelarut heksana. Pemilihan jenis pelarut tersebut berdasarkan tingkat keaktifan yang lebih tinggi pada ekstraksi bertahap (Wulan 2008). Setelah cairan ekstrak disaring dengan menggunakan corong kaca (diameter 9 cm) beralaskan kertas saring Whatman No. 41, ampas direndam ulang lima kali masing-masing dengan 1,5 l heksana. Perendaman ulang dilakukan hingga larutan hasil penyaringan tidak berwarna. Hasil saringan ditampung dalam labu penguap, kemudian diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 50 C dan tekanan 335 mbar. Pelarut yang diperoleh kembali dari penguapan digunakan untuk merendam ulang ampas ekstrak tersebut. Semua ekstrak yang diperoleh disimpan di dalam lemari es dengan suhu ± 4 o C sampai digunakan untuk pengujian. aksinasi P. retrofractum dan T. vogelii Ekstrak P. retrofractum dan T. vogelii difraksinasi secara terpisah dengan kromatografi vakum cair (KVC) dengan penjerap Silica Gel 60 F 254 (40-63 µm) seperti yang dikemukakan oleh Coll & Bowden (1986). Pelarut yang digunakan

4 22 adalah dikorometana dan etilasetat dengan perbandingan berturut-turut 1:0, 9:1, dan 0:1. aksi aktif KVC T. vogelii dipisahkan lebih lanjut dengan kromatografi kolom (KK) menggunakan eluen berturut-turut diklorometana-etilasetat 9:1, etilasetat, dan metanol. aksi yang diperoleh diperiksa kehomogenannya dengan kromatografi lapisan tipis (KLT) menggunakan pelat aluminium berpenjerap Silica Gel 60 F 254 dan pelarut pengembang kloroform-dietil eter (19:1). Bercak komponen fraksi pada pelat KLT dideteksi menggunakan sinar ultraviolet (UV) λ 254 nm. aksi dengan retention factor (Rf) sama disatukan dan setiap fraksi atau fraksi gabungan diuji aktivitasnya terhadap larva C. pavonana dengan cara seperti yang diuraikan pada uji toksisitas. aksi yang aktif selanjutnya diperiksa kemurniannya dengan KLT dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Kondisi KCKT: kolom C18, pelarut bergradien metanol:air dari perbandingan 50:50 menjadi 95:5 dalam waktu 15 menit, deteksi dengan sinar UV pada λ 275 nm untuk fraksi aktif P. retrofractum dan 295 nm untuk fraksi aktif T. vogelii. Prosedur ekstraksi dan fraksinasi ekstrak P. retrofractum dan T. vogelii secara skematis ditunjukkan pada Gambar 1 dan 2. Metode Percobaan Percobaan 1. Uji Toksisitas Ekstrak dan aksi Aktif P. retrofractum dan T. vogelii serta Campurannya terhadap Larva C. pavonana Metode residu pada daun. Ekstrak atau fraksi dilarutkan dalam campuran pengemulsi metanol, aseton, dan Tween 80 (5:5:2) kemudian diencerkan dengan akuades hingga volume yang diinginkan (konsentrasi akhir metanol + aseton + Tween 80 1,2%). Pada pemantauan fraksinasi ekstrak P. retrofractum dan T. vogelii dengan KVC, setiap fraksi diuji pada konsentrasi 0,1% 0,5% dan pada pemisahan fraksi aktif T. vogelii dengan KK, setiap fraksi diuji pada konsentrasi 0,01%- 0,1%. Daun brokoli berukuran 4 cm 4 cm dicelupkan dalam emulsi ekstrak perlakuan dan kontrol (campuran akuades, pelarut, dan pengemulsi) hingga basah

5 23 Serbuk buah Piper retrofractum (150 g) + EtOAc, disaring, diuapkan Ekstrak kasar (15,86 g) Ekstrak kasar 13 g * KVC, CH 2 Cl 2 ; CH 2 Cl 2 : EtOAc (9:1); EtOAc; MeOH aksi CH 2 Cl 2 (1,8884 g) aksi CH 2 Cl 2 : EtOAc (6,9401 g) aksi EtOAc (1,2748 g) aksi MeOH (1,0149 g) *KLT, kloroform:dietil eter (19:1) * Penggabungan bercak dengan Rf sama Gambar 1 Skema prosedur ekstraksi dan fraksinasi ekstrak buah P. retrofarctum

6 24 Ekstrak heksana daun Tephrosia vogelii (9 g) * KVC, CH 2 Cl 2 ; CH 2 Cl 2 : EtOAc (9:1); EtOAc; MeOH aksi CH 2 Cl 2 (6,7877 g) aksi CH 2 Cl 2 : EtOAc (0,3954 g) aksi EtOAc (0,4090 g) aksi MeOH (1,2867) *KLT, kloroform:dietil eter (19:1) *Penggabungan bercak dengan Rf sama * Kromatografi kolom, CH 2 Cl 2, CH 2 Cl 2 :EtOAc (9:1), EtOAc, MeOH *KLT, kloroform:dietil eter (19:1) *Penggabungan bercak dengan Rf sama 2-4 & 3-3 Gambar 2 Skema prosedur ekstraksi dan fraksinasi ekstrak daun T. vogelii

7 25 merata. Setelah dikeringanginkan, daun brokoli perlakuan atau kontrol diletakkan dalam cawan petri berdiameter 9 cm yang dialasi tisu, kemudian 15 ekor larva instar II C. pavonana dimasukkan ke dalam cawan tersebut. Setiap perlakuan dan kontrol diulang lima kali. Setelah 48 jam daun perlakuan diganti dengan daun tanpa perlakuan. Jumlah larva yang mati dicatat setiap hari hingga hari ke-3. aksi dianggap aktif bila perlakuan dengan fraksi tersebut dapat mengakibatkan kematian larva uji > 80% (kematian kumulatif pada hari ke-3). aksi yang aktif, yaitu fraksi 2 dan 3 KVC P. retrofractum serta fraksi 2-4 KK T. vogelii, diuji lebih lanjut terhadap larva C. pavonana pada lima taraf konsentrasi yang diharapkan dapat menyebabkan kematian serangga uji antara 0% dan 100% (eksklusif). Untuk setiap taraf konsentrasi digunakan 15 ekor larva instar II dengan lima ulangan. Mortalitas larva diamati dan dicatat setiap hari hingga hari ke-3. Hubungan antara konsentrasi bahan uji dan tingkat kematian serangga uji diolah dengan analisis probit (Finney 1971) menggunakan program POLO-PC (LeOra Software 1987). Uji toksisitas campuran fraksi aktif P. retrofractum dan T. vogelii terhadap larva C. pavonana dilakukan dengan cara yang sama seperti di atas. Campuran yang diuji ialah fraksi 2 + fraksi 3 KVC P. retrofractum (2:5), fraksi 2 KVC P. retrofractum + fraksi 2-4 KK T. vogeliii (8:5), dan fraksi 3 KVC P. retrofractum + fraksi 2-4 KK T. vogelii (2:5). Perbandingan konsentrasi dalam campuran berdasarkan perbandingan LC 50 komponen masing-masing. Toksisitas insektisida pembanding profenofos (Curacron 500 EC) terhadap larva C. pavonana juga diuji dengan cara yang sama seperti di atas. Pengujian dilakukan pada lima taraf konsentrasi berdasarkan uji pendahuluan. Untuk pengujian, formulasi profenofos diencerkan dengan akuades yang mengandung Tween 80 0,2% sesuai konsentrasi yang diinginkan. Air yang mengandung Tween 80 0,2% digunakan sebagai larutan kontrol. Metode kontak. Metode ini dilakukan untuk mengevaluasi lebih lanjut sifat racun kontak ekstrak kasar, fraksi 2, 5, dan 3 KVC P. retrofractum, fraksi 2-

8 26 4 KK T. vogelii serta insektisida sintetik profenofos terhadap larva C. pavonana. Konsentrasi tertinggi setiap bahan uji dalam pengujian ini setara dengan lima kali konsentrasi yang dapat mengakibatkan kematian larva C. pavonana sekitar 80% pada uji pendahuluan dengan metode residu pada daun. Setiap bahan uji dilarutkan dalam aseton sesuai konsentrasinya masingmasing. Setiap larutan uji dipipet sebanyak 0,5 ml ke dalam tabung gelas berdiameter 2,2 cm dan tinggi 5,8 cm. Tabung gelas ditutup dan diputar-putar pada posisi miring untuk menyebarkan larutan bahan uji secara merata pada permukaan dalam tabung gelas tersebut. Kelebihan larutan ekstrak dibuang, lalu pelarut diuapkan dengan meletakkan tabung gelas tersebut di dalam kamar asap. Setelah pelarut menguap, tabung dikeluarkan dari dalam kamar asap dan ke dalam setiap tabung dimasukkan 15 larva C. pavonana instar II yang berumur sekitar 3-4 jam setelah ganti kulit. Selanjutnya tabung diletakkan terbalik di atas cawan petri yang bagian permukaannya telah ditetesi dengan bahan uji yang sama serta diuapkan pelarutnya. Sebagai kontrol, larva uji dimasukkan ke dalam tabung gelas yang diberi perlakuan aseton saja. Setelah 2 jam kontak, larva uji dipindahkan ke dalam cawan petri yang dialasi tisu dan berisi potongan daun brokoli (4 cm 4 cm) tanpa perlakuan. Setiap perlakuan diulang lima kali. Jumlah larva yang mati dihitung pada 24 jam setelah perlakuan (setelah pemindahan ke cawan petri). Analisis sifat aktivitas campuran. Senyawa aktif ekstrak P. retrofractum dan T. vogelii memiliki cara kerja yang berbeda sehingga dalam analisis sifat aktivitas campuran digunakan model kerja bersama bebas (Prijono 2002). Hasil analisis probit pada perlakuan fraksi tunggal maupun campuran manghasilkan nilai a (intercept), b (slope), LC 50, dan LC 95. Untuk campuran, LC 50 atau LC 95 yang diperoleh disebut LC 50 atau LC 95 percobaan. Untuk campuran ekstrak yang berasal dari jenis tumbuhan yang sama, sifat aktivitas campuran dianalisis berdasarkan model kerja bersama serupa dengan menghitung nisbah ko-toksisitas pada taraf LC 50 dan LC 95 (Wadley 1945 dalam

9 27 Kosman & Cohen 1996). LC (campuran) yang diperoleh dari pengujian campuran ekstrak disebut LC (campuran) percobaan. LC (campuran) harapan dihitung dengan rumus berikut (Wadley 1945 dalam Kosman & Cohen 1996): LC (campuran) harapan = 1/[(p 1 /LC (1)) + (p 2 /LC (2))] p 1 dan p 2 masing-masing proporsi konsentrasi komponen 1 (fraksi 2 KVC P. retrofractum) dan komponen 2 (fraksi 3 KVC P. retrofractum) dalam campuran; LC (1) dan LC (2) masing-masing LC komponen 1 dan komponen 2. Nisbah kotoksisitas (NK) campuran komponen tersebut dihitung dengan rumus: NK = LC (campuran) harapan LC (campuran) percobaan Kategori sifat interaksi campuran berdasarkan kategori yang dikemukakan oleh Kosman & Cohen (1996) dan Gisi (1996): (1) bila NK < 0,7, komponen campuran bersifat antagonistik; (2) bila NK 0,7 1,3, komponen campuran bersifat aditif; (3) bila NK > 1,3 2, komponen campuran bersifat sinergistik lemah; (4) bila NK > 2, komponen campuran bersifat sinergistik kuat. Untuk campuran ekstrak yang komponennya berasal dari jenis tumbuhan yang berbeda, sifat aktivitas campuran dianalisis berdasarkan model kerja bersama berbeda dengan menghitung indeks kombinasi pada taraf LC 50 dan LC 95. Indeks kombinasi (IK) pada taraf LC tersebut dihitung dengan rumus berikut (Chou & Talalay 1984): 1( cmp) 1 2( cmp) 2 LC LC LC IK = + + LC LC LC 1( cmp) 1 LC LC 2( cmp) 2 LC 1 2 dan LC masing-masing LC komponen fraksi 2 atau 3 KVC P. 1(cm) retrofractum dan fraksi 2 KK T. vogelii pada pengujian terpisah; LC dan LC 2(cm) masing-masing LC komponen fraksi 2 atau 3 KVC P. retrofractum dan

10 28 fraksi 2 KK T. vogelii dalam campuran yang mengakibatkan mortalitas (misal 50% dan 95%). Nilai LC tersebut diperoleh dengan cara mengalikan LC campuran dengan proporsi konsentrasi komponen fraksi 2 atau 6 KVC P. retrofractum dan fraksi 2 KK T. vogelii dalam campuran. Kategori sifat interaksi campuran diadaptasi dari Kosman & Cohen (1996) dan Gisi (1996) berdasarkan kebalikan nilai nisbah ko-toksisitas: (1) bila IK < 0,5, komponen campuran bersifat sinergistik kuat; (2) bila IK 0,5 0,77, komponen campuran bersifat sinergistik lemah; (3) bila IK > 0,77 1,43, komponen campuran bersifat aditif; (4) bila IK > 1,43, komponen campuran bersifat antagonistik. Percobaan 2. Uji Antifeedant aksi Aktif P. retrofractum dan T. vogelii terhadap Larva C. pavonana aksi tunggal yang aktif pada uji toksisitas diuji pengaruhnya terhadap aktivitas makan larva instar II C. pavonana dengan metode pilihan. Setiap jenis fraksi diuji pada lima taraf konsentrasi yang setara dengan LC 10, LC 25, LC 40, LC 55, dan LC 70 berdasarkan hasil pengujian dengan metode residu pada daun. Setiap perlakuan diulang lima kali. Cara pemberian perlakuan pada daun pakan sama seperti pada pengujian toksisitas dengan metode residu pada daun. Potongan daun brokoli (2,5 cm 2,5 cm) dibuat dari bagian lembaran daun brokoli di kedua sisi tulang daun utama. Potongan daun dari salah satu sisi tulang daun digunakan untuk perlakuan dan potongan daun dari sisi lainnya untuk kontrol. Sebelum diberi perlakuan, semua daun diukur dengan menggunakan milimeter blok untuk mendapatkan luas daun awal. Untuk memperkirakan proporsi bobot epidermis, diambil 10 potongan daun lain dengan ukuran yang sama, kemudian bagian mesofil daun dikelupas hingga tersisa bagian epidermisnya saja. Proporsi bobot epidermis terhadap bobot awal daun sebelum dikelupas digunakan untuk memperkirakan proporsi epidermis bila pada bagian daun yang dimakan tersisa epidermis.

11 29 Dua potongan daun perlakuan dan dua potongan daun kontrol diletakkan secara berselang-seling di dalam cawan petri yang dialasi tisu. Selanjutnya 10 ekor larva instar II awal C. pavonana dilepaskan di bagian tengah arena makan. Setelah 24 jam, luas daun yang dimakan dan perkiraan luas total daun akhir diukur dengan menggunakan milimeter blok. Proporsi luas daun yang dimakan kemudian dikalikan dengan luas total daun awal untuk mendapatkan data luas daun yang dimakan. Pengukuran luas total daun awal dan akhir dilakukan untuk memperhitungkan penyusutan luas daun selama periode pengujian (24 jam). Persentase penghambatan makan (efek antifeedant) dihitung berdasarkan data luas daun perlakuan dan daun kontrol yang dimakan larva menggunakan rumus berikut: AF = Dk Dk + Dp Dp 100% AF : efek antifeedant Dk : luas daun kontrol yang dimakan larva (mm 2 ) Dp : luas daun perlakuan yang dimakan larva (mm 2 ) Data perbedaan luas daun kontrol dan daun perlakuan yang dimakan diolah dengan uji-t berpasangan. Pengaruh konsentrasi ekstrak terhadap efek antifeedant diolah dengan sidik ragam yang dilanjutkan dengan uji selang berganda Duncan untuk pembandingan nilai tengah antarperlakuan. Percobaan 3. Uji Toksisitas aksi Aktif P. retrofractum dan T. vogelii serta Campurannya terhadap Larva P. ylostella aksi 2 KVC P. retrofractum dan fraksi 2-4 KK T. vogelii serta campurannya (5:1) diuji toksisitasnya terhadap larva P. ylostella dengan metode residu pada daun seperti uji toksisitas terhadap larva C. pavonana. Formulasi profenofos digunakan sebagai pembanding. Pengujian dilakukan pada lima taraf konsentrasi yang diharapkan dapat menyebabkan kematian serangga uji antara 0% dan 100%. Untuk setiap taraf konsentrasi digunakan 10 ekor larva instar II dengan empat ulangan. Mortalitas

12 30 larva diamati dan dicatat pada hari ke-2 dan ke-3. Hubungan antara konsentrasi bahan uji dan tingkat kematian serangga uji diolah dengan analisis probit (Finney 1971) menggunakan program POLO-PC (LeOra Software 1987). Sifat aktivitas campuran fraksi aktif P. retrofractum dan T. vogelii dianalisis dengan cara yang sama seperti pada uji toksisitas terhadap larva C. pavonana. Percobaan 4. Uji Toksisitas aksi Aktif P. retrofractum dan T. vogelii serta Campurannya terhadap Imago Parasitoid D. semiclausum aksi 2 KVC P. retrofractum dan fraksi 2-4 KK T. vogelii serta campurannya (5:1) diuji toksisitasnya terhadap imago jantan dan betina parasitoid D. semiclausum dengan metode kontak pada permukaan daun. Konsentrasi sediaan yang diuji ialah 1 LC 95 dan 2 LC 95 tertinggi berdasarkan hasil pengujian terhadap larva C. pavonana dan P. ylostella. Penyiapan bahan uji dilakukan dengan cara yang sama seperti pada pengujian toksisitas terhadap larva C. pavonana dan P. ylostella dengan metode residu pada daun. Sebagai pembanding digunakan insektisida sintetik profenofos (Curacron 500 EC) yang diuji pada konsentrasi formulasi 2% dan 5%. Satu lembar daun brokoli bertangkai dirampingkan helaian daunnya sehingga menyisakan helaian daun berukuran 5 cm 5 cm. Daun selanjutnya dicelupkan dalam suspensi bahan uji hingga membasahi permukaan secara merata. Setelah kering, 10 ekor imago betina atau jantan parasitoid dimasukkan ke dalam setiap tabung plastik pengujian (tinggi 4,5 cm dan diameter 3,5 cm) dan diberi pakan madu 10% yang diserapkan pada kapas. Agar kesegaran daun uji tetap terjaga, setiap tangkai helaian daun uji dimasukkan dalam botol film berisi air. Lama waktu pemaparan ialah 72 jam (parasitoid berada dalam tabung pengujian, kontak dengan bahan uji). Setiap perlakuan diulang tiga kali. Pengamatan mortalitas parasitoid dilakukan setiap hari hingga hari ketiga setelah perlakuan.

13 Percobaan 5. Uji Semilapangan aksi Aktif P. retrofractum dan T. vogelii serta Campurannya terhadap Larva C. pavonana Tanaman brokoli (Brassica oleracea L. var. italica Plenck) cv. Winter Harvest diperoleh dari petani organik Desa Babakan, Kecamatan Darmaga, Kabupaten Bogor yang berumur 1 bulan dipindahkan ke dalam polybag 5 L dan dipelihara hingga memiliki 5-6 helai daun. Selanjutnya tanaman brokoli tersebut diletakkan di lahan percobaan Cikabayan IPB. Percobaan disusun dalam rancangan acak kelompok dengan perlakuan (1) fraksi 2 KVC P. retrofractum 0,138%, (2) fraksi 2-4 KK T. vogelii 0,135%, (3) campuran dua fraksi tersebut (8:5) 0,186%, (4) formulasi Bacillus thuringiensis (Ture WP) 0,0552%, (5) formulasi profenofos (Curacron 500 EC) 0,0900%, dan (6) kontrol. Konsentrasi yang diuji setara dengan 3 LC 95 terhadap larva instar II C. pavonana pada pengujian dengan metode residu pada daun di laboratorium. Tiap unit perlakuan terdiri atas dua tanaman brokoli dengan empat ulangan. Sediaan bahan uji disemprotkan pada tanaman brokoli dengan menggunakan hand sprayer pada permukaan atas dan bawah daun hingga merata. Pada salah satu tanaman brokoli diinfestasikan 15 larva instar II C. pavonana segera setelah cairan semprot mengering dan 7 hari kemudian dilakukan infestasi ulang dengan jumlah larva uji yang sama pada tanaman brokoli kedua. Jumlah larva yang ditemukan pada tanaman dicatat pada 3, 4, dan 7 hari setelah infestasi pertama dan kedua. Data diolah dengan sidik ragam yang dilanjutkan dengan uji selang berganda Duncan pada taraf nyata 5%. 31