KARAKTERISTIK FISIKOKIMIA EKSTRAK KOLAGEN LIMBAH TULANG AYAM BROILER MENGGUNAKAN JENIS BAHAN DAN WAKTU DEMINERALISASI BERBEDA ABSTRAK

Transkripsi

1 KARAKTERISTIK FISIKOKIMIA EKSTRAK KOLAGEN LIMBAH TULANG AYAM BROILER MENGGUNAKAN JENIS BAHAN DAN WAKTU DEMINERALISASI BERBEDA Muhammad Irfan Said, Effendi Abustam, Johana C.Likadja, Farida Nur Yuliati Fakultas Peternakan Universitas Hasanuddin, Makassar, Jl.Perintis Kemerdekaan Km. 10 Makassar Telp/Fax (0411) irfanunhas@gmail.com ABSTRAK Tulang ayam merupakan salah satu limbah hasil pemotongan ternak ayam yang kaya dengan senyawa kolagen. Kolagen merupakan produk hidrokoloid sebagai hasil hidrolisis parsial dari jaringan hewan yang saat ini banyak dimanfaatkan dalam bidang pangan maupun farmasi. Proses demineralisasi tulang dalam proses produksi kolagen mempengaruhi sifat-sifat secara kuantitatif maupun kualitatif. Tujuan penelitian ini adalah mengevaluasi karakteristik ekstrak kolagen yang diproduksi menggunakan beberapa jenis bahan dan waktu proses demineralisasi berbeda. Materi utama berupa limbah tulang ayam ras pedaging (broiler), CH 3 COOH 1 M dan HCl 1 M. Desain penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) 2x2 dengan 3 kali ulangan. Faktor I adalah dua jenis bahan demineralisasi (CH 3 COOH dan HCl), faktor II adalah dua waktu proses demineralisasi (48 dan 96 jam). Data dianalisis secara sidik ragam. Parameter yang diamati meliputi rendemen, kekuatan gel, viskositas. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penerapan jenis bahan dan waktu proses demineralisasi berbeda berpengaruh nyata (p<0,05) terhadap rendemen, namun tidak berpengaruh (p>0,05) terhadap nilai kekuatan gel maupun viskositas. Penggunaan HCl 1M memberikan hasil terbaik terkait nilai rendemen dibanding CH 3 COOH 1M pada penggunaan waktu proses 48 jam dan 96 jam. Kata kunci : ekstrak, kolagen, tulang, ayam ras pedaging, demineralisasi ABSTRACT The Characteristics Physicochemical of Collagen Extract of Bone Waste of Broiler Using on The Different Materials and Demineralization Time Chicken bone is one of the results of poultry waste, which is rich in collagen. Collagen are products of hydrocolloid as a result of the partial hydrolysis of animal tissue, which, currently widely used in the foods and pharmaceutical fields. The properties of collagen both quantitative and qualitative from bone was affected by demineralization process. The purpose of this study was to evaluation the characteristics of collagen extracts, which produced by using types of materials and demineralization times different. The bone waste of broiler, solution of CH 3 COOH 1 M dan HCl 1 M was used as materials of study. Completely randomized design (CRD) factorial a 2x2 with three replication was used as design of the study. The first factor was two type of materials (48 and 96 hours) and the second factor was two time of demineralization process (CH 3 COOH 1 M dan HCl 1 M). The data was analyzed by ANOVA. The yields, gel strength and viscosity was used as parameters in this study. The results of this study showed that the application of the type of materials and demineralization time significantly different (p<0.05) on the yields, but it had no effect (p>0.05) on the gel strength and viscosity value. The use of HCl 1M gave the 1

2 best results compared CH 3 COOH 1M related on yields with processing time of 48 and 96 hours. Key words : extract, collagen, bone, broiler, demineralization PENDAHULUAN Tulang merupakan salah satu hasil ikutan (by product) dari pemotongan ternak yang sampai saat ini belum termanfaatkan secara maksimal karena sebagian besar masyarakat masih menganggapnya sebagai limbah ternak. Sampai saat ini pemanfaatan tulang dari ternak bagi industri pakan masih sebatas sebagai bahan baku pakan ternak, sehingga tulang masih dikategorikan sebagai by product yang memiliki nilai ekonomi rendah. Salah satu jenis ternak yang menghasilkan limbah tulang cukup besar adalah ayam, karena ternak tersebut menempati posisi populasi terbesar di Indonesia. Tulang secara struktural kaya dengan senyawa bioaktif khususnya protein kolagen yang terikat secara kuat dengan mineral kalsium maupun posfor (Zeugolis et al. 2008, Nagai et al. 2008, Muyonga et al. 2003, Ockerman & Hansen, 2000). Tulang sebagai by product ternak berpotensi besar untuk dimanfaatkan sebagai bahan baku sumber kolagen. Ekstrak kolagen saat ini banyak diterapkan dalam bidang pangan, diantaranya sebagai bahan baku food supplement terutama bagi manula (Shuster et al. 2006, Rogart et al. 1999, Tian et al. 2001). Selain itu, tulang juga banyak dimanfaatkan sebagai bahan pengental, stabilizer dalam industri permen maupun bahan dasar untuk pembuatan cangkang kapsul obat (Anonim 2007). Beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak kolagen tulang sapi menggunakan asam lemah (CH 3 COOH) sebagai bahan demineralisasi selama 48 dan 96 jam menghasilkan rendemen masing-masing sebesar 2,26% dan 2,51% dengan nilai kekuatan gel 200,68 g Bloom dan 297,57 g Bloom serta viskositas 6,00 cp dan 7,50 cp (Said et al. 2013). Ekstrak kolagen dari babi yang diproses menggunakan asam asetat 2%, 4% dan 6% pada umur berbeda menghasilkan rendemen rata-rata masing-masing 10,92%, 11,55% dan 11,99%. Kekuatan gel 138,71 g Bloom, 137,64 g Bloom dan 137,43 g Bloom. Viskositas 6,97 cp, 6,91 cp dan 6,88 cp (Sompie et al. 2012). Beberapa ahli telah menduga, bahwa ekstrak kolagen impor saat ini banyak diproduksi dari kulit babi. Tentunya hal ini menjadi masalah bagi negara yang masyarakatnya mayoritas muslim (Hidaka & Liu 2002, Liu et al. 2007, Nagai et al. 2008). Senyawa kolagen yang terdapat pada tulang ternak pada prinsipnya memiliki kemiripan 2

3 dalam hal komposisi kimia, morfologi, distribusi, fungsi serta patologi dengan senyawa kolagen yang dimiliki oleh tubuh manusia (Junqueira et al. 1998). Untuk memperoleh ekstrak kolagen dengan kuantitas yang maksimal dari tulang, dibutuhkan proses demineralisasi dengan kombinasi bahan dan waktu proses yang tepat. Pada proses demineralisasi, terjadi proses hidrolisis dan solubilisasi komponen mineral serta denaturasi ikatan protein secara terbatas. Proses ini sangat mempengaruhi sifat-sifat fisik dan kimia kolagen yang dihasilkan (Zhang et al. 2007). Tujuan penelitian ini untuk mengevaluasi karakteristik ekstrak kolagen yang diproduksi dari bahan baku limbah tulang ayam ras pedaging (broiler) dengan menerapkan beberapa jenis asam dan waktu proses demineralisasi berbeda. MATERI DAN METODE Materi Penelitian Penelitian ini menggunakan bahan baku berupa limbah tulang broiler dari seluruh bagian tubuh (kecuali kepala dan kaki). Bahan baku tulang ayam merupakan produk sisa proses boneless yang diperoleh dari pasar tradisional Daya, Makassar yang selanjutnya dipotong kecil-kecil dengan ukuran 2-3 cm. Potongan-potongan tulang dari seluruh bagian tubuh ayam kemudian dihomogenkan hingga membentuk komposit. Bahan demineralisasi menggunakan asam lemah berupa asam asetat (CH 3 COOH 1 M) dan asam kuat berupa asam klorida (HCl 1 M). Peralatan Penelitian Peralatan utama yang digunakan dalam proses produksi antara lain : water bath (Memmert Tipe WNB7-45), oven digital (Memmert), timbangan analitik (Sartorius TE 214S), labu ukur, beker glass, erlemenyer, corong gelas, gelas ukur dan termometer. Peralatan-peralatan pendukung untuk proses uji kualitas antara lain : Universal Testing Machine, viskometer Brookville dan ph meter (Hanna NI 8520). Metode Penelitian Proses penyiapan larutan demineralisasi Larutan demineralisasi berupa asam asetat (CH 3 COOH) dan asam klorida (HCl) yang dibuat dengan konsentrasi masing-masing satu molar. 3

4 Rancangan Penelitian Penelitian dilaksanakan secara eksperimen laboratorium menggunakan rancangan dasar berupa Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial 2 x 2 dengan 3 kali ulangan. Pada penelitian ini diterapkan 2 faktor, faktor I menggunakan 2 jenis bahan demineralisasi (CH 3 COOH 1 M dan HCl 1 M) dan faktor II waktu proses curing (48 jam dan 96 jam). Pelaksanaan penelitian Pelaksanaan penelitian mengacu pada proses produksi ekstrak kolagen menurut Ockerman & Hansen (2000) yang telah dimodifikasi. Sebanyak 300 g bahan baku limbah tulang broiler komposit dimasukkan ke dalam beker glass yang berisi larutan degreasing berupa etanol 70%. Proses degreasing dilakukan selama 24 jam pada suhu ruang. Tulang kemudian dicuci dengan air mengalir selama 3 menit. Bahan baku tulang yang telah dicuci, selanjutnya dimasukkan ke dalam larutan deminineralisasi sesuai kombinasi perlakuan yang telah ditentukan hingga seluruh permukaan tulang terendam secara sempurna. Bahan baku tulang yang telah mengalami proses demineralisasi yang selanjutnya disebut ossein, kemudian dicuci kembali dengan air mengalir. Selanjutnya bahan baku tulang dinetralkan dengan larutan basa (Ca(OH) 2 20% b/v) selama 24 jam dengan rasio tulang : larutan basa (1:1,5). Sampel tulang yang telah dinetralkan, kemudian dimasukkan ke dalam erlemenyer dan ditambah dengan aquades dengan rasio tulang : aquades (1:1). Proses ekstraksi pertama dilakukan dalam water bath suhu 70 o C (fraksi 1) selama 24 jam yang dilanjutkan dengan esktraksi kedua pada suhu suhu 75 o C (fraksi 2) selama 24 jam. Hasil ekstraksi diperoleh ekstrak kolagen cair. Hasil fraksi pertama dan kedua digabung, kemudian dituang pada loyang aluminium yang sebelumnya diberi lapisan plastik bening untuk selanjutnya dikeringkan di dalam oven suhu 55 o C selama jam. Lapisan ekstrak kolagen yang telah kering kemudian digiling dengan blender hingga membentuk serbuk dan selanjutnya ditimbang untuk menentukan nilai rendemen. Serbuk selanjutnya dikemas dengan plastik klip untuk dilakukan uji kualitas. Analisis data Data yang diperoleh dianalisis secara sidik ragam berdasarkan RAL Pola Faktorial dengan bantuan program statistik SPSS (one-way ANOVA). Perlakuan yang menunjukkan pengaruh yang nyata, selanjutnya dilakukan uji beda nyata dengan Duncan S Multiple Range Test (DMRT) pada taraf 5% (Steel & Torrie 1991). 4

5 Cara analisis Rendemen (Giménez et al b ). Bahan baku limbah tulang ditimbang untuk menentukan berat awal bahan baku (g). Setelah proses produksi, ekstrak kolagen yang sudah kering ditimbang untuk menentukan berat akhir produk (g). Rendemen selanjutnya dihitung. Rendemen (%) = (berat akhir produk/berat awal bahan baku) x 100%. Kekuatan gel (Muyonga et al. 2004) (Modifikasi). Kekuatan gel diukur dengan alat Universal Testing Machine yang dilengkapi teflon plunger silinder (diameter 13 mm). Larutan ekstrak kolagen dibuat dengan konsentrasi 6,67% w/v (6,67 g sampai aquadest 100 ml) dipanaskan pada suhu ±60 o C hingga partikel ekstrak larut secara sempurna. Larutan selanjutnya dimasukkan ke dalam wadah yang berdiamater 5 cm dengan tinggi 6 cm kemudian disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 5 o C selama jam. Sampel dalam wadah diletakkan tepat pada bagian bawah plunger (d = 13 mm) untuk selanjutnya dilakukan proses pengujian. Pengujian dilakukan sebanyak 3 kali setiap sampel pada suhu ±10 o C. Hasil pembacaan gaya maksimum yang diberikan plunger pada gel merupakan F.max sampel (dalam N/cm 2 ). Kecepatan plunger menetrasi dalam gel 10 mm/menit sedalam 4 mm. Perhitungan nilai kekuatan gel dilakukan dalam satuan gram Bloom. Nilai Fmax dengan satuan N/cm 2 dapat dikonversi ke satuan gram Bloom dengan menggunakan persamaan : Kekuatan gel (dyne/cm 2 ) (D) = (F/G) x 980, dan Kekuatan gel (gram Bloom) = D. Dalam hal ini, F = tinggi grafik sebelum patah, G = konstanta (0,07) dan D = kekuatan gel (dyne/cm 2 ) Viskositas (Arnesen & Gildberg 2002) (Modifikasi). Viskositas sampel diukur dengan alat viscometer Brookville. Larutan kolagen dibuat dengan konsentrasi 6,67% w/v (6,67 g sampai aquadest 100 ml) dipanaskan pada suhu ±60 o C hingga partikel kolagen larut secara sempurna. Larutan ekstrak kolagen cair dituang ke dalam mangkuk dan selanjutnya dilakukan pengukuran viskositas. Pengukuran nilai viskositas ekstrak kolagen dilakukan pada suhu kamar (28 o C). Hasil pengukuran dicacat dengan satuan sentipoise (cp). HASIL DAN PEMBAHASAN Rendemen (%) Rendemen pada prinsipnya merupakan jumlah produk yang dihasilkan dari sejumlah bahan baku yang diproses (Giménez et al a ), dan dipengaruhi oleh proses produksi (Kołodziejska et al. 2007, Kasankala et al. 2007). Nilai rendemen yang semakin 5

6 Rendemen (%) besar menunjukkan bahwa proses produksi menjadi semakin efisien. Perbandingan nilai rendemen yang dihasilkan melalui penerapan beberapa kombinasi perlakuan disajikan pada Gambar 1. Berdasarkan hasil analisis sidik ragam data pada Gambar 1 menunjukkan bahwa, perbedaan jenis bahan dan waktu proses demineralisasi tulang dalam tahapan produksi berpengaruh nyata (P<0,05) terhadap nilai rendemen ekstrak kolagen. Seperti terlihat pada Gambar 1, bahwa penggunaan asam kuat sebagai bahan demineralisasi menghasilkan rendemen yang lebih tinggi dibanding penggunaan asam lemah. Peningkatan konsentrasi asam dapat meningkatkan rendemen (Zhou & Joe 2005). Konsentrasi memiliki pengaruh yang sangat besar terhadap kelarutan kolagen. Peningkatan konsentrasi asam menyebabkan terjadinya peningkatan konsentrasi ion H + dalam larutan demineralisasi yang pada akhirnya akan mempercepat terjadinya proses hidrolisis (Anonim 2006). Laju hidrolisis yang semakin cepat cenderung meningkatkan jumlah molekul yang terkonversi menjadi kolagen sehingga berdampak pada meningkatnya nilai rendemen c d a b CH3COOH 1 M, 48 jam CH3COOH 1 M, 96 jam HCl 1 M, 48 jam HCl 1 M, 96 jam Kombinasi Jenis Bahan dan Waktu Demineralisasi Keterangan : a,b ; Superskrip yang berbeda pada setiap diagram menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05) Gambar 1. Grafik perbandingan nilai rendemen (%) ekstrak kolagen yang diproduksi dari beberapa kombinasi perlakuan proses demineralisasi pada tulang ayam broiler 6

7 Kekuatan Gel (g Bloom) Kekuatan Gel (g Bloom) Kekuatan gel merupakan salah satu parameter untuk mengetahui kualitas fisik pada produk kolagen (Kolodziejska et al. 2003). Perbandingan nilai kekuatan gel ekstrak kolagen tulang ayam broiler yang diproduksi menggunakan kombinasi jenis dan waktu proses berbeda selengkapnya disajikan pada Gambar 2. Berdasarkan Gambar 2 terlihat nilai kekuatan gel dari beberapa kombinasi proses cukup bervariasi. Nilai kekuatan gel tertinggi dari produk ekstrak dihasilkan dari kombinasi bahan demineralisasi CH 3 COOH dengan waktu proses 96 jam dan mengalami penurunan pada penggunaan bahan HCl dengan waktu proses 96 jam. Terjadinya penurunan nilai kekuatan gel dapat disebabkan oleh terjadinya proses pemutusan rantai polimer asam amino secara berlebihan dengan meningkatnya konsentrasi asam dalam hal ini penggunaan asam kuat, sehingga ikatan antar molekul-molekul polimer penyusun protein yang terkonversi menjadi kolagen terpecah menjadi rantai monomer yang sangat pendek hingga akhirnya mengalami kerusakan dan menyebabkan proses pembentukan gel menjadi terbatas. Kekuatan gel sangat tergantung pada ikatan hidrogen antara molekul air dengan kelompok hidroksil bebas dari kelompok asam amino, ukuran rantai protein, konsentrasi serta distribusi berat molekul (Arnesen & Gildberg 2002, Bhat & Karim 2008) CH3COOH 1 M, 48 jam CH3COOH 1 M, 96 jam HCl 1 M, 48 jam HCl 1 M, 96 jam Kombinasi Jenis Bahan dan Waktu Demineralisasi Gambar 2. Grafik perbandingan nilai kekuatan gel (g Bloom) ekstrak kolagen yang diproduksi dari beberapa kombinasi perlakuan proses demineralisasi pada tulang ayam broiler 7

8 Viskositas (cp) Berdasarkan standar Gelatin Manufacturers Institute of America (GMIA) (Anonim 2001), sifat fisik berupa kekuatan gel yang dihasilkan pada penggunaan bahan demineralisasi dari asam masih memenuhi standar yang dipersyaratkan yakni gram Bloom, sedangkan Ockerman & Hansen (2000) mempersyaratkan gram Bloom. Kekuatan gel dipengaruhi oleh ikatan hidrogen antara molekul air dengan kelompok hidroksil bebas dari kelompok asam amino, ukuran rantai protein, konsentrasi serta distribusi berat molekul (Arnesen & Gildberg 2002, Bhat & Karim 2008). Penggunaan konsentrasi bahan yang tinggi dalam proses produksi kolagen dapat menyebabkan nilai kekuatan gel meningkat maupun menurun (Ockerman & Hansen 2000) sedangkan kualitas kolagen yang dihasilkan dari suatu proses produksi sangat tergantung pada proses ekstraksi yang dilakukan pada molekul protein (Kasankala et al. 2007). Viskositas (cp) Viskositas pada prinsipnya adalah kemampuan menahan dari suatu zat cair untuk mengalir. Proses alir dari suatu zat cair dipengaruhi oleh viskositas yang terjadi akibat adanya adsorbsi dan pengembangan koloid (Schrieber & Gareis 2007). Perbandingan nilai viskositas dari kombinasi perlakuan selengkapnya disajikan pada Gambar CH3COOH 1 M, 48 jam CH3COOH 1 M, 96 jam HCl 1 M, 48 jam HCl 1 M, 96 jam Kombinasi Jenis Bahan dan Waktu Demineralisasi Gambar 3. Grafik perbandingan nilai viskositas (cp) ekstrak kolagen yang diproduksi dari beberapa kombinasi perlakuan proses demineralisasi tulang ayam broiler Data yang dihasilkan pada Tabel 3 diperoleh hasil uji statistik yang menunjukkan bahwa, perbedaan jenis bahan dan waktu proses demineralisasi pada tulang ayam broiler 8

9 tidak menunjukkan pengaruh yang nyata (P>0,05) terhadap nilai viskositas kolagen. Hal ini dapat disebabkan karena waktu proses yang diterapkan dalam proses produksi belum mampu menghidrolisis dan memecah struktur ikatan peptida pada protein kulit secara maksimal. Peningkatan nilai viskositas pada dasarnya dipengaruhi oleh struktur molekul asam amino yang menyusun protein. Susunan asam amino yang semakin panjang akan meningkatkan nilai viskositas kolagen (Leiner 2002). Secara deskriptif dapat dilihat pada Gambar 3, bahwa penggunaan bahan demineralisasi berupa asam kuat dengan penambahan waktu proses ternyata dapat meningkatkan viskositas produk. Peningkatan konsentrasi bahan dapat meningkatkan nilai viskositas apabila bahan tersebut mampu memecah ikatan peptida pada ikatan yang tepat dengan molekul yang lebih panjang. KESIMPULAN Penerapan jenis bahan dan waktu proses demineralisasi dalam proses produksi ekstrak kolagen berbahan baku tulang ayam ras pedaging (broiler) berpengaruh nyata (P<0,05) terhadap nilai rendemen produk, namun tidak berpengaruh (P>0,05) terhadap nilai kekuatan gel maupun viskositas. Penggunaan HCl 1M (asam kuat) dalam proses demineralisasi memberikan nilai rendemen ekstrak kolagen rata-rata lebih tinggi dibanding CH 3 COOH 1M (asam lemah) pada penggunaan waktu proses 48 jam dan 96 jam. UCAPAN TERIMA KASIH Tim peneliti dengan ini mengucapkan banyak terima kasih khususnya kepada Ditlitabmas, Ditjen Dikti, Kemendikbud RI atas dukungan pembiayaan yang telah diberikan dalam penelitian ini melalui skim Hibah Penelitian Strategi Nasional beserta adik-adik mahasiswa (Sinta Karangan, Dewi Ramadhani, A.Abd.Malik Wahid, Nirwana dan M.Lukman Hakim) yang telah banyak membantu dalam aktivitas penelitian di laboratorium. DAFTAR PUSTAKA Anonim Gelatin. Gelatin Manufacturers Institute of America (GMIA). Anonim Gelatin.org Market Data Gelatine Manufacturers of Europe. Anonim Gelatin Kapsul. Jurnal Halal. Arnesen JA, Gildberg A Preparation and characterization of gelatine from the skin of harp seal (Phoca groendlandica). Bioresource Technology. 82:

10 Bhat R, Karim AA Ultraviolet irradiation improves gel strength of fish gelatin. Food Chemistry. 113: Giménez B, Gómez-Guillén MC, Montero P a. The role of salt washing of fish skins in chemical and rheological properties of gelatin extracted. Food Hydrocolloids. 19: Giménez B, Gómez-Guillén MC, Montero P b. Storage of dried fish skins on quality characteristics of extracted gelatin. Food Hydrocolloids. 19: Hidaka S, Liu SY Effect of gelatins on calcium phosphate precipitation : a possible application for distinguishing bovine bone gelatin from porcine skin gelatin. J.Food Composition and Analysis. 16: Junqueira LC, Corneiro J, Kelly RO Alih Bahasa Tambayong, J. Histologi Dasar. EGC. Penerbit Buku Kedokteran, Jakarta. Kasankala LM, Xue Y, Weilong Y, Hong SD, He Q Optimization of gelatine extraction from grass carp (Catenopharyngodon idella) fish skin by response surface methodology. Bioresource Tech. 98: Kolodziejska I, Kaczorowski K, Piotrowska B, Sadowska M Modification of the properties of gelatin from skins of Baltic cod (Gadus morhua) with transglutaminase. Food Chemistry. 86: Kołodziejska I, Skierka E, Sadowska M, Kołodziejski W, Niecikowska C Effect of extracting time and temperature on yield of gelatin from different fish offal. Food Chem. 107 (2): Leiner PB The Physical and Chemical Properties of Gelatin. Liu HY, Han J, Guo SD Extraction and properties of gelatin from channel catfish (Ietalurus punetaus) skin. Food Sci and Tech. 41 (3): Muyonga JH, Cole CGB, Duodu KG Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopic study of acid soluble collagen and gelatin from skins and bones of young and adult Nile perch (Lates niloticus). Food Chemistry. 86: Muyonga JH, Cole CGB, Duodu KG Extraction and physico-chemical characterization of Nile perch (Lates niloticus) skin and bone gelatin. Food Hydrocolloids. (18): Nagai T, Suzuki N, Nagashima T Collagen from common minke whale (Balaenoptera acutorostrata) unesu. Food Chem. 111 (2): Ockerman HW, Hansen CL Animal By Product Processing and Utilization. CRC Press, USA. Rogart JN, Barrach HJ, Chichester CO Articular collagen degradation in the hulthtelhag model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 7(6): (Abstract). Said MI, Wahab AW,Yuliati FN Aplikasi Teknologi Formulasi Senyawa Bioaktif Kolagen Dari Limbah Tulang Sapi Dalam Pakan Ternak Mencit Melalui Teknik SLD Untuk Keperluan Rekayasa Pengembangan Makanan Suplemen Anti- Osteoporosis. Laporan Penelitian. Hibah Insentif SINas Riset Terapan. Kemenristek RI. Lembaga Penelitian Unhas. Schrieber R, Gareis H Gelatine Handbook, Wiley-VCH GmbH & Co, Weinhem Shuster S, Black MM, Vitie EM The influence of age and sex on skin thickness, skin collagen and density. British J. of Dermatology. 93 (6): (Abstract). Sompie M, Triatmojo S, Pertiwiningrum A, Pranoto Y The Effect of Animal Age and Acetat Acid Concentration of Pig Skin Gelatin Characteristics. J. Indonesian Trop.Anim.Agric. 37 (3): Steel RGD, Torrie JH Principle and Procedure of Statistics. 2 nd.ed. International Book Company, Tokyo. 10

11 Tian Y, Peng Z, Gorton D,Xiao Y, Ketheesan N Immunohistochemical analysis of structural changes in collagen for the assessment of osteoarthritis. Proc. Inst. Mech. Eng H. 225(7): (Abstract). Zeugolis DI, Khew ST, Yew ESY, Ekaputra AK, Tong YW,Yung LL, Hutmacher DW, Sheppard C, Michael Electro-spinning of pure collagen nano-fibres Just an expensive way to make gelatin?. Biomaterials (15): Zhang Y, Liu W, Li G, Shi B, Miao Y and Wu X Isolation and partial characterization of pepsin-soluble collagen from the skin of grass carp (Ctenopharyngodon idella). Food Chem. (103): Zhou P, Joe MR Effect of alkaline and acid pretreatments on alaska pollock skin gelatin extraction. J. Food Sci (70):