BIODISTRIBUSI DAN UJI CLEARANCE 99m Tc-SIPROFLOKSASIN PADA MENCIT (Mus musculus) YANG TERINFEKSI BAKTERI Escherichia coli

Transkripsi

1 BIODISTRIBUSI DAN UJI CLEARANCE SIPROFLOKSASIN PADA MENCIT (Mus musculus) YANG TERINFEKSI BAKTERI Escherichia coli Yana Sumpena, Rizky Juwita Sugiharti, Nurlaila Zainudin Pusat Teknologi Nuklir Bahan Dan Radiometri, BATAN, Jl. Tamansari 71, Bandung ABSTRAK BIODISTRIBUSI DAN UJI CLEARANCE SIPROFLOKSASIN PADA MENCIT (Mus musculus) YANG TERINFEKSI BAKTERI Escherichia coli. Telah dilakukan uji biodistribusi dan clearance radiofarmaka pada mencit putih yang terinfeksi bakteri Escherichia coli. Kepada setiap mencit yang terinfeksi diinjeksikan larutan radiofarmaka dengan aktivitas antara uci, volume 0,1 ml secara intra vena dibagian ekor. Selang waktu 2 jam, 4 jam dan 24 jam pasca injeksi mencit dibunuh secara dislokasi pada bagian leher setelah itu jaringan dan organ seperti darah, hati, ginjal, limpa, lambung,otot paha kanan dan otot paha kiri diambil sebagian sebagai cuplikan. Selanjutnya cuplikan ditimbang dengan timbangan analitik dan dicacah dengan pencacah sintilasi gamma (single channel analyzer). Hasil uji biodistribusi pada 2 jam pasca injeksi memperlihatkan akumulasi pada jaringan dan organ dengan urutan paling tinggi adalah ginjal, darah, hati, paru-paru, lambung, jantung, limpa, otot paha kiri, dan otot paha kanan. Pada 4 jam pasca injeksi urutannya menjadi ginjal, hati, paru-paru, darah, lambung, limpa,jantung, otot paha kiri dan otot paha kanan. Sedang 24 jam pasca injeksi urutan persentase akumulasi adalah ginjal, hati, limpa, lambung, paru-paru, darah, jantung, otot paha kiri dan otot paha kanan. Perbandingan antara otot paha yang terinfeksi (target ) dengan otot paha yang tidak terinfeksi (non target) pada 2 jam pasca injeksi adalah (2,00 ± 0,97)% ; 4 jam pasca injeksi (2,20 ± 1,56)% dan 24 jam pasca injeksi (2,75 ± 2,86)%. Hasil uji clearance darah (blood clearance) radiofarmaka 99m Tcsiprofloksasin menunjukkan konsentrasi tertinggi dicapai 5 menit setelah penyuntikan (94,15 %) dan menurun hampir setengahnya pada menit ke 30 (49,98%) dan pada 4 jam pasca injeksi aktivitas yang tersisa hanya sebesar 4,99 %. Kata kunci : biodistribusi, siprofloksasin, infeksi, 99m Tc. ABSTRACT BIODISTRIBUTION AND CLEARANCE TEST OF CIPROFLOXACIN IN MICE (Mus musculus) INFECTED BY Escherichia coli. Biodistribution and clearance test of radiopharmaceutical ciprofloxacin has been conducted on mice infected by Escherichia coli. Biodistribution of radiopharmaceutical in various organs was studied in mice, after intravenous (i.v) injection of uci of the tracer through the tail. The mice were sacrificed at 2, 4, and 24 hours post injection by cervical dislocation. Various tissues and organs i.e : blood, liver, kidneys, spleen, stomach, infected and non-infected thigh muscle were removed quickly, dried on filter paper, weighed and counted for radioactivity using Single Channel Analyzer. The biodistribution at 2 hours post injection showed that the uptake was found in kidneys, blood, liver, lung, stomach, heart, spleen, infected thigh and non-infected thigh muscle respectively. At 4 hours showed that the uptake was found in kidneys, liver, lung, blood, stomach, spleen, heart, infected thigh muscle and non-infected muscle respectively and at 24 hours showed that uptake was found in kidneys, liver, spleen, stomach, lung, blood, heart, infected thigh muscle and non-infected muscle respectively. Target and non-target ratio were 2.00 ± 0,97 ; 2.20 ± 1.56 and 2.75 ± 2.86 at 2, 4 and 24 hrs post injection respectively. Ninety four percents of ciprofloxacin remain in blood after 5 minutes of injection, cleared from blood within 5 minutes post injection and only 49.98% of injected dose remained in the blood after 30 minutes. 393

2 Four hours after injection only 4.99 % of ciprofloxacin remained in blood. Key words : biodistribution, ciprofloxacin, infected, 99m Tc. 1. PENDAHULUAN Penyakit infeksi merupakan penyakit yang masih banyak diderita oleh masyarakat dan menjadi penyebab kematian nomor satu di Indonesia. Salah satu metode yang dapat dipakai untuk mendeteksi adanya penyakit ini adalah teknik nuklir menggunakan radio-farmaka sebagai perunut. Infeksi merupakan reaksi mikrosirkulasi yang ditandai dengan perpindahan cairan dan sel darah putih dari darah kedalam jaringan ektraseluler. Infeksi timbul akibat dari berbagai rangsangan yang disebabkan mikroorganisme seperti bakteri. Radiofarmaka merupakan sediaan radiofarmasi antibiotik dengan nama kimia 1-siklopropil-6-fluor-1,4 dihidro-4-okso-7 (piperazine)-3-kuinolin asam karboksilat. Radiofarmaka di bidang kedokteran nuklir digunakan sebagai perunut (tracer) untuk diagnosis infeksi atau inflamasi. Siprofloksasin merupakan senyawa antibiotik yang termasuk golongan kuinolin yang biasanya digunakan untuk mengobati infeksi pada saluran kencing, penyakit kelamin yang disebabkan oleh bakteri (N.gonorrhoeae), infeksi pada gastrointestinal dan abdominal, infeksi pada saluran pernafasan dan infeksi lain yang disebabkan oleh bakteri. Antibiotik kuinolin membunuh mikroba dengan menyerang DNA gyrase atau topoisomerase IV pada bakteri [1.3]. Siprofloksasin kebanyakan digunakan untuk membunuh bakteri gram negatip seperti bakteri Escherichia coli, N.gonorrhoeae, Salmonella sp dan Shigella sp. Antibiotik bersifat bakterisida (membunuh bakteri) dan berdasarkan sifat ini maka antibiotik bertanda radioaktif dapat terakumulasi pada daerah infeksi yang disebabkan oleh bakteri. Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah Escherichia coli merupakan mikroorganisme fekal, dapat berupa patogen penyebab infeksi usus seperti penyakit disentri basiler, demam tifoid, demam paratifoid dan kolera. Karakteristik bakteri ini antara lain bersifat gram negatif, berbentuk batang (basil), tidak berspora, memfermentasi laktosa, menghasilkan asam dan gas yang dapat diketahui setelah masa inkubasi 24 jam pada temperatur 37 0 Celcius [ 2 ]. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui akumulasi radiofarmaka pada berbagai jaringan dan organ mencit putih terinfeksi bakteri Escherichia coli khususnya jaringan otot paha yang terinfeksi sebagai target pada penelitian ini. Sebagai hasil akhir diharapkan radiofarmaka ini dapat digunakan dalam bidang kedokteran nuklir khususnya untuk mendeteksi infeksi yang disebabkan oleh bakteri gram negatif, seperti Escherichia coli. 2. TATA KERJA 2.1. Bahan dan peralatan Sediaan radiofarmasi untuk penelitian diproduksi oleh kelompok Sintetis Senyawa Bertanda PTNBR BATAN. Bahan yang digunakan adalah bakteri Escherichia coli hasil biakan Biofarma, media kultur, nutrien agar, Mac Conkey dan hewan percobaan mencit putih jantan galur Swiss dengan berat rata-rata 37 gram. Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah pencacah sintilasi gamma (Single Channel Analyzer) dengan detector NaI-TI, Dose calibrator, laminar air flow, Kamera Gamma (Infinia SPECT-CT) di Kedokteran Nuklir RSHS. Peralatan lain yang digunakan adalah timbangan analitik, timbangan teknis, beaker glass, tabung reaksi, syringe dan peralatan bedah Pembuatan medium Medium kultur, nutrient agar dan Mac Conkey ditimbang dalam berat tertentu dan masing-masing dilarutkan kedalam akuades kemudian dipanaskan untuk meningkatkan kelarutan, setelah cukup larut, medium disterilisasi di dalam autoklaf pada suhu C selama 15 menit. Medium yang telah disterilisasi dimasukkan dalam cawan petri secara aseptis dan didinginkan Inokulasi bakteri Kawat ose dicelupkan ke dalam alkohol dan 394

3 dipanaskan dalam lampu spirtus sampai membara. Setelah dingin kawat ose digunakan untuk mengambil bakteri Escherichia coli di dalam kultur. Bakteri yang berada pada kawat ose selanjutnya dipindahkan ke dalam medium Nutrient Agar dan Mac Conkey selanjutnya diinkubasi dalam inkubator pada temperatur 37 0 C selama 3 x 24 jam Infeksi bakteri Bakteri hasil kultur diambil dan dilarutkan untuk memperoleh suspensi dengan turbiditas yang mengandung 1,2x10 8 mikroorganisme/ml. Untuk menentukan jumlah bakteri dihitung berdasarkan kekeruhan suspensi bakteri dengan metoda Mc Farland. Sekelompok mencit jantan dengan berat rata-rata 37 gram, diinjeksi dengan 0,10 ml suspensi bakteri pada otot paha kiri secara intramuscular. Terjadinya dan perkembangan infeksi /inflamasi pada hewan percobaan yang telah diinjeksi dapat dilihat dengan adanya tandatanda infeksi/inflamasi berupa pembengkakan (benjolan) pada area bekas injeksi setelah waktu 24 jam Pencitraan dengan menggunakan kamera gamma Sebanyak 0,5mL sediaan siprofloksasin dengan aktivitas 2 mci disuntikkan melalui vena pada bagian ekor mencit putih. Selang waktu tertentu dilakukan pencitraan pada tikus dengan kamera gamma setelah mencit tersebut dibius menggunakan ketamine HCl (dosis 0,16 ml/200 g berat badan) dan xylazyne 2% (dosis 0,06 ml/200g berat badan) Uji pencucian dari darah (blood clearance) Penentuan uji pencucian siprofloksasin dari darah dilakukan dengan menyuntikan 0,1 ml sediaan dengan aktivitas 400 μci ke tubuh tikus, kemudian darahnya diambil setelah 5, 25, 30, 45, 60, 90, 120, 180 dan 240 menit setelah penyuntikan. Jaringan darah tersebut masing-masing ditimbang dan dicacah selanjutnya diplotkan dalam bentuk grafik antara waktu terhadap persentase radioaktivitas di dalam darah Uji Biodistribusi radiofarmaka siprofloksasin Hewan percobaan yang digunakan adalah mencit putih (Mus musculus) jantan yang diinfeksi terlebih dahulu oleh bakteri Escherichia coli dengan jumlah bakteri 1,2 x 10 8 per mencit pada bagian paha kiri. Sebanyak 18 ekor mencit dengan tiap interval waktu pengamatan terdiri dari 6 ekor mencit. Kepada setiap mencit terifeksi diinjeksikan larutan sediaan dengan aktivitas μci, volume 0,1 ml secara intra vena bagian ekor. Selang waktu 2 jam, 4 jam dan 24 jam pasca injeksi mencit dibunuh secara dislokasi pada bagian leher setelah itu organ/jaringan darah, hati, ginjal, limpa, lambung, paru-paru, jantung, otot paha kanan dan otot paha kiri (terinfeksi) diambil sebagian sebagai cuplikan. Selanjutnya organ atau jaringan tersebut ditimbang dengan timbangan analitik dan dicacah dengan pencacah sintilasi gamma (single channel analyzer).tingkat radioaktivitas organ atau jaringan dihitung berdasarkan % radioaktivitas per gram jaringan atau organ. 3. HASIL DAN PEMBAHASAN Radiofarmaka yang digunakan pada penelitian semuanya memenuhi persyaratan kemurnian radiokimia yang telah ditentukan, tidak toksik dan mempunyai daya bakterisida terhadap bakteri cukup baik. Hasil uji biodistribusi dan uji blood clearance radiofarmaka pada berbagai interval waktu dapat dilihat Tabel 1 dan Grafik 1, Tabel 2 dan Gambar 2. Perlu dijelaskan bahwa persentase radioaktivitas yang ditimbun pada setiap jaringan atau organ pada penelitian ini ditentukan dengan menghitung radioaktivitas penimbunan per gram jaringan atau organ terhadap radioaktivitas yang disuntikkan. Hal ini dilakukan dengan maksud agar diperoleh gambaran akumulasi di dalam setiap jaringan/organ, tanpa dipengaruhi oleh ukuran besar/kecil suatu jaringan/organ. Hasil uji biodistribusi akumulasi tertinggi terdapat pada organ ginjal berturut-turut (1,29±0,014) %; (0,94±0,007) % dan (0,54±0,04) % pada 2 jam, 4 jam dan 24 jam pasca injeksi yang menunjukkan bahwa rute eksresi radiofarmaka paling besar melalui organ ginjal.akumulasi tinggi terlihat pula pada organ hati sebesar 395

4 (0,39±0,003) % pada 2 jam kemudian turun (0,31±0,002) % pada 4 jam dan (0,23±0,001) % untuk 24 jam pasca injeksi. Tabel 1. Persentase radioaktivitas per gram jaringan atau organ mencit yang diinfeksi E coli No Organ 2 Jam 4 Jam 24 Jam % % % 1 Otot kanan 0,08± 0,001 0,007±0,000 0,04± 0,000 2 Otot kiri 0,16± 0,001 0,13± 0,000 0,08± 0,001 3 Darah 0,62± 0,008 0,26± 0,002 0,08± 0,000 4 Lambung 0,23± 0,0002 0,18± 0,001 0,14± 0,001 5 Hati 0,39± 0,003 0,31± 0,002 0,23± 0,001 6 Limpa 0,20± 0,001 0,17± 0,001 0,15± 0,001 7 Ginjal 1,29± 0,014 0,94± 0,007 0,54± 0,004 8 Jantung 0,21± 0,001 0,13± 0,001 0,05± 0,000 9 Paru-paru 0,33± 0,002 0,30± 0,002 0,11± 0,000 Grafik Biodistribusi Tc-CIP pada Mencit yang diinfeksi dengan E. coli % 1.20% % ID/ g 1.00% 0.80% 0.60% 0.40% 0.20% % Aktivitas % Otot Paha Otot Paha kanan kiri Darah Lambung Hati Lympa Ginjal Jantung Paru-paru Organ 2 jam 4 jam 24 jam waktu (jam) Gambar 1. Persentase radioaktivitsas siprofloksasin pada jaringan dan organ mencit yang diinfeksi dengan Escherichia coli. Gambar 2. Pencucian darah (blood clearance) radiofarmaka pada mencit putih selang waktu tertentu. Jaringan otot paha kiri (terinfeksi) merupakan fokus penelitian ini dengan ratio target 2 jam pasca injeksi (2,00 ± 0,97), 4 jam pasca injeksi ( 2,2 ±1,56 ) dan 24 jam pasca injeksi (2,75±2,86) dan waktu pengamatan 4 jam setelah penyuntikan akumulasi radiofarmaka paling baik. Hasil ini hampir sama dengan yang dilaporkan oleh para peneliti sebelumnya [1]. Target adalah bagian dari otot paha yang terinfeksi (otot paha kiri) dan non target bagian dari otot paha yang tidak dinfeksi (otot paha kanan). Perhitungan rasio target/non target adalah perbandingan persentase radioaktivitas per gram otot paha yang terinfeksi (otot paha kiri) dengan persentase radioaktivitas per gram otot paha yang tidak terinfeksi (otot paha kanan). Untuk organ dan jaringan yang lain seperti lambung, limpa, jantung dan paru-paru setiap interval waktu terjadi penurunan persentase radioaktivitas sesuai dengan sifat peluruhan dari suatu radionuklida. Tabel 2. Hasil perhitungan rasio target/non target pada beberapa interval waktu pengamatan. Rasio Target (paha kiri)/non Target (paha kanan waktu rasio T/NT 2 jam 2 + 0,97 4 jam 2,2 + 1,56 24 jam 2,75 + 2,86 Tabel 2 dan Gambar 2 menunjukkan persentase radioaktivitas dari jaringan darah pada hewan uji dengan mengambil 7 % dari berat badan mencit sebagai berat darah diseluruh tubuh mencit. 396

5 Tabel 3. Hasil persentase keradioaktifan dalam darah terhadap waktu setelah penyuntikan. Waktu (menit) % penimbunan dalam darah 5 94, , , , , , , , ,99 Hasil uji clearance (blood clearance) radiofarmaka, menunjukkan konsentrasi tertinggi dicapai 5 menit setelah penyuntikan (94,15 %) dan persen aktivitas menurun setengahnya mulai pada menit ke 30 (49,98%), pada 1 jam setelah penyuntikan hanya 37,39% aktivitas yang tersisa dalam darah, kemudian menurun pada 3 jam berikutnya sebanyak 20,76%, dan pada 4 jam pasca injeksi aktivitas yang tersisa hanya sebesar 4,99 % (Tabel 2). Penurunan persentase dalam darah ini disebabkan karena sebagian kompleks sudah terekskresikan dan sebagian lainnya terdistribusi ke organ seperti hati, paru, ginjal, lambung dan jaringan lain termasuk juga ke organ target (otot yang terinfeksi). Pada gambar scanning dengan gamma camera (Infinia SPECT-CT) yang dilakukan di bagian kedokteran nuklir RSHS Bandung pada 1 dan 2 jam setelah penyuntikan, terlihat adanya akumulasi radiofarmaka pada jaringan yang terinfeksi yaitu pada otot paha kiri hewan uji. 4. KESIMPULAN Hasil penelitian uji biodistribusi radiofarmaka pada mencit yang terinfeksi bakteri Escherichia coli menunjukkan bahwa terjadi akumulasi pada 2 jam pasca injeksi dari urutan akumulasi paling tinggi pada organ/jaringan ginjal, darah, hati, paru-paru, lambung, jantung, limpa, otot paha kiri, dan otot paha kanan. Pada 4 jam pasca injeksi urutan akumulasinya adalah organ/jaringan ginjal, hati, paru-paru, darah, lambung, limpa,jantung, otot paha kiri dan otot paha kanan dan 24 jam pasca injeksi adalah organ/jaringan ginjal, hati, limpa, lambung, paru-paru, darah, jantung, otot paha kiri dan otot paha kanan. Ratiotarget antara otot paha terinfeksi (paha kiri) dengan otot paha yang tidak terinfeksi (paha kanan) 2 jam pasca injeksi adalah (2,00 ± 0,97) %; 4 jam pasca injeksi (2,2 ± 1,56) % dan 24 jam pasca injeksi (2,75 ± 2,86) %. Hasil uji clearance darah menunjukkan radiofarmaka waktu paruh dalam darah dicapai pada menit ke 30 setelah penyuntikan dengan persentase radioaktivitas sebesar 49,98%. Gambar 3. Hasil pencitraan radiofarmaka 99m Tcsiprofloksasin pada mencit terinfeksi E.coli menggunakan kamera gamma. 5. UCAPAN TERIMA KASIH Penulis mengucapkan terima kasih banyak kepada : Iswahyudi, Yetti Suryati, Rukmini Iljas dan Achmad Sidik yang telah banyak membantu 397

6 dalam pelaksanaan penelitian ini sampai makalah ini dibuat. 6. DAFTAR PUSTAKA 1. GANO, L., PATRICIO, L.,. CANTINHO, G., PENA, H., MARTINS, T., MARQUES,E., Ciprofloxacin In Imaging Of Infective Versus Sterile Inflammation. IAEA TECDC 1029 August 1998 : Modern Trends in Radiopharmaceuticals for Diagnosis and Therapy. Proceeding of a Symposium held in Lisbon, Portugal 30 March 3 April DAS S.S., BRITTON K.E., Bacterial Infection Imaging, World Journal of Nuclear Medicine, Volume 2, Number 3, July GNANASEGARAN G., CROASDALE J., BUSCOMBE JR., Nuclear Medicine in Imaging Infection and Inflamation : Part-I. Radiopharmaceutical, World Journal of Nuclear Medicine, Volume 3, Number 2, April DISKUSI Poppy I T PTNBR BATAN : Nilai rasio target / nontarget digunakan untuk menjelaskan apa? Berapa batas nilai rasio target / nontarget yang dianggap baik untuk suatu radiofarmaka? Yana Sumpena : Nilai rasio target lebih besar berarti radiofarmaka tersebut mempunyai daya akumulasi tinggi terhadap infeksi oleh bakteri. Jadi nilai rasio target / nontarget tidak ada batas, tergantung dari ligan radiofarmakanya. Maria Lina- PATIR BATAN : 1. Alasan digunakan E. Coli? apakah hanya digunakan sebagai model? strain E. Coli apa yang digunakan? 2. Siprofloksasin adalah antibiotik untuk salmonela thypi. Mengapa tidak digunakn bakteri tersebut? Yana Sumpena : 1. Penelitian ini diarahkan ke infeksi bakteri gram (-) seperti E. Coli. Tahap selanjutnya kepada bakteri gram (+). Strain E. Coli perlu dikonfirmasi dulu ke perum Biofarma, Bandung. 2. Siprofloksasin adalah antibiotik untuk membunuh bakteri gram (+) maupun gram (-). Jadi tidak spesifik untuk salmonela thypi (gram (-)). 398