BAB III BAHAN DAN METODE

Transkripsi

1 BAB III BAHAN DAN METODE 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni 2013 sampai Desember Tahapan pelaksanaan penelitian meliputi : 1. Pengambilan sampel daun Rhizophora mucronata Lamk. dilakukan di Kawasan Wisata Alam Mangrove Angke Kapuk, Pantai Indah Kapuk, Jakarta Utara. 2. Penelitian ekstraksi, uji fitokimia dan uji in vitro dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran. 3. Penelitian uji tantang (in vivo) dilakukan di Laboratorium Akuakultur Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran Alat dan Bahan Penelitian Alat Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah : 1. Peralatan yang digunakan untuk pengambilan sampel : - Trash bag digunakan untuk membungkus daun Rhizophora mucronata Lamk. - Buku panduan identifikasi mangrove (Kitamura 2003) digunakan untuk mengidentifikasi sampel Rhizophora mucronata Lamk. 2. Peralatan yang digunakan untuk ekstraksi Rhizophora mucronata Lamk. : - Koran bekas digunakan sebagai wadah penjemuran daun Rhizophora mucronata Lamk. - Pisau digunakan untuk memotong daun Rhizophora mucronata Lamk. - Talenan digunakan sebagai wadah daun Rhizophora mucronata Lamk. dipotong. - Blender digunakan untuk menghaluskan sampel daun Rhizophora mucronata Lamk. 23

2 24 - Timbangan analitik digunakan untuk menimbang berat daun Rhizophora mucronata Lamk. serta hasil ekstrak. - Erlenmeyer digunakan sebagai tempat merendam daun Rhizophora mucronata Lamk. dengan pelarut metanol (maserasi). - Corong kaca digunakan untuk membantu proses penyaringan. - Kertas saring digunakan untuk menyaring filtrat hasil ekstraksi. - Gelas ukur digunakan untuk mengukur volume filtrat hasil maserasi. - Rotary evaporator digunakan untuk menguapkan filtrat. - Spatula digunakan untuk mengambil ekstrak pasta dari flask. - Botol vial digunakan untuk menempatkan ekstrak pasta hasil penguapan. - Kertas label digunakan untuk memberi penandaan di botol vial. 3. Peralatan yang digunakan untuk uji fitokimia Rhizophora mucronata Lamk. : - Tabung reaksi digunakan untuk mereaksikan sampel ekstrak dengan reagen indikator fitokimia. - Pipet Pasteur digunakan untuk mengambil reagen indikator fitokimia. 4. Peralatan yang digunakan untuk uji in vitro : - Timbangan analitik digunakan untuk menimbang bubuk media agar. - Erlenmeyer digunakan sebagai wadah media agar. - Hotplate digunakan untuk memanaskan media agar. - Autoclave digunakan untuk mensterilkan alat dan media agar. - Petridisk digunakan sebagai wadah media agar pada uji sensitivitas antibakteri. - Bunsen digunakan untuk aseptisasi lingkungan kerja. - Laminar air flow digunakan sebagai tempat aseptisasi lingkungan kerja. - Mikro pipet digunakan untuk mengambil larutan ekstrak Rhizophora mucronata Lamk. - Jarum ose digunakan untuk membantu inokulasi bakteri ke media agar plate. - L glass digunakan untuk meratakan larutan bakteri pada media agar. - Pinset digunakan untuk meletakkan paper disk ke atas media agar. - Inkubator digunakan untuk tempat inkubasi bakteri.

3 25 - Jangka sorong digunakan untuk mengukut diameter zona hambat yang terbentuk. 5. Peralatan yang digunakan untuk uji in vivo : - Akuarium digunakan untuk aklimasi larva udang windu. - Keller digunakan untuk tempat uji LC 50 udang windu PL Akuarium digunakan untuk tempat uji in vivo udang windu PL Heater digunakan untuk mempertahankan suhu air. - Selang siphon digunakan untuk membersihkan kotoran pada toples uji. - Aerator digunakan untuk memasok oksigen pada wadah uji. - Plastik trashbag digunakan untuk menutup toples uji Bahan Bahan yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah : - Sampel daun Rhizophora mucronata Lamk. sebanyak 5 kg diambil dari Kawasan Wisata Alam Mangrove Angke Kapuk digunakan sebagai sumber senyawa antibakteri. - Isolat bakteri Vibrio harveyi digunakan sebagai bakteri patogen. - Larva udang windu PL 10 dan PL 15 sebanyak 500 ekor dari PT. Gratema Indramayu digunakan sebagai hewan uji in vivo. - Etil asetat, n-heksan dan butanol digunakan sebagai pelarut fraksinasi. - H 2 SO 4 1% dan BaCl 1% digunakan sebagai pelarut MacFarland. - Media Nutrien Agar (NA) digunakan sebagai media tumbuh bakteri uji. - Kloroform digunakan untuk uji fitokimia. - Aquades steril digunakan untuk sterilisasi. - Alkohol 70% digunakan untuk sterilisasi. - Air laut digunakan sebagai pelarut media agar dan medium tumbuh larva udang windu. - Paper disk digunakan sebagai tempat meletakkan ekstrak pada uji in vitro. - Artemia digunakan sebagai pakan larva udang windu selama uji in vivo. - Pereaksi Dragengorf, Meyer dan Bouchart digunakan sebagai reagen indikator alkaloid.

4 26 - Larutan logam magnesium dan asam klorida digunakan sebagai reagen indikator flavonoid. - Pereaksi Lieberman digunakan sebagai reagen indikator steroid dan triterpenoid Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode eksperimental laboratoris. Rancangan penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) pada uji in vivo. Uji in vivo dirancang menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 5 (lima) perlakuan dan 2 (dua) kali ulangan sebagai berikut: A = tanpa direndam ekstrak butanol Rhizophora mucronata Lamk. (Kontrol) B = direndam dengan ekstrak butanol Rhizophora mucronata Lamk. dengan konsentrasi 25% dari nilai LC 50 C = direndam dengan ekstrak butanol Rhizophora mucronata Lamk. dengan konsentrasi 50% dari nilai LC 50 D = direndam dengan ekstrak butanol Rhizophora mucronata Lamk. dengan konsentrasi 75% dari nilai LC 50 E = direndam dengan ekstrak butanol Rhizophora mucronata Lamk. dengan konsentrasi 100% dari nilai LC Prosedur Penelitian Pengambilan Sampel Sampel daun Rhizophora mucronata Lamk. diambil dari Kawasan Wisata Alam Mangrove Angke Kapuk, Pantai Indah Kapuk, Jakarta Utara. Jenis sampel daun yang diambil merupakan daun tua. Sebanyak 5 kg sampel basah daun Rhizophora mucronata Lamk. diambil kemudian sampel disimpan di dalam trash bag untuk dibawa ke laboratorium. Pengambilan sampel dilakukan melalui purposive random sampling di mana sampel diambil dari lokasi dimana ditemukan adanya komoditas sampel yang diinginkan. Titik koordinatnya dicatat dengan menggunakan GPS. Sampel diambil dari tiga titik lokasi yang berbeda dengan tujuan untuk mewakili

5 27 Rhizophora mucronata Lamk. yang ada pada Kawasan Wisata Alam Angke Kapuk. Pada saat pengambilan sampel dilakukan pengukuran meliputi salinitas, suhu, DO dan ph perairan di Kawasan Wisata Alam Angke Kapuk. Pengukuran dilakukan untuk mengetahui kualitas air di perairan tersebut (Lampiran 1) Pembuatan Serbuk Kering Daun Rhizophora mucronata Lamk. Sebelum dilakukan proses ekstraksi, sampel daun Rhizophora mucronata Lamk. segar yang baru diambil dari Kawasan Wisata Alam Angke Kapuk ditimbang beratnya sebagai berat sampel basah, kemudian sampel dicuci menggunakan air bersih untuk menghilangkan garam serta epifit yang menempel di tubuhnya. Sampel selanjutnya dikeringkan selama 1 bulan tanpa terkena cahaya matahari secara langsung, kemudian ditimbang kembali beratnya setelah pengeringan. Pengeringan adalah suatu cara pengawetan atau pengolahan pada bahan dengan cara mengurangi kadar air, sehingga proses pembusukan dapat terhambat (Yulian 2011). Salah satu tujuan pengeringan ialah untuk memperoleh serbuk yang tidak mudah rusak dan tahan disimpan dalam keadaan terawasi untuk mencegah perubahan kimia yang terlalu banyak. Bahan harus dikeringkan secepat-cepatnya, tanpa menggunakan suhu tinggi, lebih baik dengan aliran udara. Setelah kering, sampel ini dapat disimpan dalam waktu yang lama sebelum dianalisis (Harborne 1987 dalam Yulian 2011). Dari tahap pengeringan sampel daun Rhizophora mucronata Lamk. ini, perbandingan berat sampel daun segar sebelum dilakukan proses pengeringan dengan sampel kering yang telah dijadikan bubuk halus sebesar 5 : 1 (5 kg : 1 kg). Berikut persentase perbandingan berat sampel segar dengan sampel hasil proses pengeringan: Dapat dilihat bahwa sampel daun Rhizophora mucronata Lamk. yang sudah dikering udarakan memiliki persentase kisaran berat sekitar 20% dari berat sampel awal (kondisi segar sebelum proses pengeringan). Batas proses

6 28 pengeringan dilakukan sampai sampel dapat dihaluskan dengan blender kemudian dijadikan serbuk halus dengan cara diayak dengan menggunakan saringan halus. Serbuk kering inilah yang kemudian akan diekstrak untuk proses selanjutnya (Lampiran 2) Prosedur Uji Fitokimia Serbuk Daun Rhizophora mucronata Lamk. Ekstrak daun Rhizophora mucronata Lamk. diuji kandungan fitokimianya meliputi : alkaloid, flavonoid, fenolik, triterpenoid dan steroid, saponin, dan tanin. Pengujian fitokimia ekstrak dilakukan menurut panduan yang dikembangkan oleh Bachtiar et al., (2012) yaitu: a. Uji Alkaloid Sebanyak 1 gram sampel ditimbang, kemudian sampel tersebut dilarutkan dalam 5 ml kloroform dan ditambah 3 tetes ammonia (NH 4 OH) 10% lalu dikocok. Lapisan kloroform diambil kemudian dilarutkan dalam 1 ml H 2 SO 4 2N lalu dikocok sampai homogen. Setelah itu ditambahkan 1 tetes pereaksi Meyer (KI+HgCl 2 ). Hasil positif sampel mengandung alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih. b. Uji Flavonoid Sebanyak 1 gram sampel halus dididihkan dengan 25 ml metanol selama ± 10 menit kemudian disaring dalam keadaan panas dan pelarut diuapkan sampai kering. Selanjutnya ditambahkan kloroform dan air suling (1:1) sebanyak 5 ml kemudian dikocok dan dibiarkan sejenak hingga terbentuk dua lapisan kloroform air (lapisan kloroform di bagian bawah dan lapisan air di bagian atas). Sebagian dari lapisan air diambil dengan pipet ke dalam tabung reaksi. Kemudian 0,1 gram bubuk magnesium dan masing-masing 5 tetes asam klorida pekat dan amil alkohol. Reagen kedua dengan menggunakan H 2 SO 4 2 N sebanyak 2 tetes. Reagen ketiga menggunakan NaOH 10% sebanyak 2 tetes. Hasil positif flavonoid adalah terbentuk warna orange merah.

7 29 c. Uji Fenolik Sebanyak 1 ml lapisan air hasil uji flavonoid dimasukkan ke dalam plat tetes atau kaca arloji dan kemudian ditambahkan pereaksi FeCl 3 1%. Adanya kandungan senyawa fenolik ditandai dengan terbentuknya warna biru ungu. d. Uji Triterpenoid dan Steroid Sebanyak 3 tetes lapisan kloroform dari uji flavonoid diteteskan ke plat tetes dan dibiarkan sampai kering. Kemudian ditambahkan 1 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat (Pereaksi Liebermann Burchard). Pada uji triterpenoid dan steroid, apabila terbentuknya warna merah artinya adalah positif triterpenoid dan terbentuknya warna biru atau ungu merupakan tanda positif steroid. e. Uji Saponin Sebanyak 1 gram sampel dimasukkan ke dalam beaker glass dan ditambahkan 20 ml akuades kemudian dipanaskan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas kemudian filtrat tersebut diambil sebanyak 10 ml dan dikocok dengan kuat secara vertikal selama 10 detik. Hasil positif saponin, akan terbentuk busa yang stabil tidak kurang dari 1-10 cm dan tidak hilan pada penambahan 1 tetes HCl 2 N. f. Uji Tanin Sebanyak 2 ml filtrat hasil penyaringan pada uji saponin dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi FeCl 3 1%. Hasil positif mengandung tanin terlihat dengan terjadinya warna biru tua atau hijau kehitaman.

8 Prosedur Ekstraksi Daun Rhizophora mucronata Lamk. Ekstraksi bertingkat daun Rhizophora mucronata Lamk. dilakukan dengan metode maserasi. Pada penelitian ini ekstraksi dilakukan secara berturut-turut dengan menggunakan tiga pelarut berbeda untuk memisahkan senyawa berdasarkan tingkat kepolarannya yaitu pelarut non-polar dengan menggunakan pelarut n-heksan, pelarut semi polar menggunakan pelarut etil asetat dan pelarut polar menggunakan butanol. Serbuk sampel kering sebanyak 500 gram yang telah dihaluskan direndam ke dalam larutan berdasarkan tingkat kepolarannya, yaitu dengan pelarut non polar (n-heksan) terlebih dahulu sebanyak 2000 ml dalam maserator hingga seluruh bagian sampel terendam (perbandingan 1:4). Maserasi dilakukan selama 1 x 24 jam dengan tiga kali pengulangan. Setelah tiga kali pengulangan, sampel kemudian direndam dengan larutan kedua, yaitu pelarut semi polar (etil asetat), dilakukan perendaman dengan perlakuan yang sama. Terakhir sampel dilakukan perendaman dengan pelarut polar yaitu butanol dengan jumlah volume (1:4) serta perlakuan yang sama (3 kali pengulangan). Setelah 1 x 24 jam maserasi, rendaman disaring dengan menggunakan kertas saring, kemudian filtrat ditampung dalam erlenmeyer dan diukur volumenya. Filtrat yang sudah dipisahkan kemudian diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 40ºC hingga terbentuk ekstrak kasar dalam bentuk pasta di dinding flask (Lampiran 3). Ekstrak kasar (pasta) yang didapat kemudian ditimbang beratnya dan ditempatkan di dalam botol vial Uji Fitokimia Hasil Ekstraksi Ketiga ekstrak kasar (pasta) hasil ekstraksi yang telah diuapkan dengan rotary evaporator, kemudian dilakukan pengujian fitokimia kembali untuk memastikan senyawa metabolit sekunder yang terkandung pada masing-masing ekstrak pasta hasil maserasi berdasarkan tingkat kepolarannya tersebut.

9 Kultur Isolat Bakteri Vibrio harveyi Bakteri Vibrio harveyi diinokulasikan pada media Nutrien Agar (NA) dalam cawan petri yang telah diberi label. Stok bakteri Vibrio harveyi awal diambil dengan menggunakan ose (1-2 ose) dan dioleskan ke media NA dalam cawan petri kemudian cawan petri diinkubasi selama 1-2 hari ke dalam inkubator dengan temperatur 37º C sedangkan stok bakteri Vibrio harveyi dimasukkan ke dalam lemari es. Pembiakan berhasil dapat dilihat dari permukaan media berwarna putih. Pembiakan siap digunakan dan apabila belum dipakai masukkan ke dalam lemari es. Semua dilakukan dalam ruang laminar dan menggunakan bunsen agar perlakuan tetap aseptik (Yulian 2011). Pembuatan larutan bakteri Vibrio harveyi kepadatan 10 7 CFU/ml bakteri dilakukan dengan cara mengambil isolat bakteri uji dengan kepadatan 10 7 CFU/ml bakteri yang telah dikultur dengan menggunakan jarum ose (2-3 ose) kemudian dilarutkan ke dalam larutan NaCl fisiologis. Lalu dibandingkan dengan larutan bakteri yang telah dilakukan dengan larutan McFarland (Yulian 2011). Larutan McFarland 0,5 digunakan sebagai pembanding kekeruhan biakan bakteri dalam medium cair dengan kepadatan antara antara 1 x 10 7 CFU/ml 1 x 10 8 CFU/ml. Urutan kerja pembuatan larutan McFarland 0,5 menurut Nurhayati (2007) dalam Mufidah (2011) adalah sebagai berikut: sebanyak 0,05 ml BaCl 2 1% dalam akuades ditambahkan 9,95 H 2 SO 4 1%. Kemudian disimpan di tempat yang terhindar dari cahaya matahari langsung Prosedur Uji in vitro (Uji Sensitivitas Antibakteri) Uji in vitro pada penelitian ini menggunakan metode Difusi Lempeng Agar (Agar Disk-Diffusion Assay) yang mengacu pada prosedur yang dilakukan oleh Laboratorium Hama dan Penyakit BBPBAP Jepara dalam Hidayat (2011) dengan 5 (lima) variasi konsentrasi ekstrak uji yaitu 10 ppm, 100 ppm, 1000 ppm dan ppm untuk ekstrak daun Rhizophora mucronata Lamk. dan dengan uji kontrol pelarut menggunakan antibiotik kloramfenikol. Adapun pengulangan dilakukan sebanyak 3 (tiga) kali. Prosedur uji sensitivitas antibakterinya yaitu sebagai berikut :

10 32 1. Isolat bakteri uji dengan kepadatan 10 7 CFU/ml bakteri yang telah dikultur dioleskan di permukaan media NA (Nutrien Agar) pada cawan petri dengan menggunakan jarum ose. 2. Paper disk direndam pada masing-masing konsentrasi ekstrak, selanjutnya paper disk yang telah mengandung ekstrak diletakkan pada permukaan media inokulasi dengan menggunakan pinset. 3. Bakteri kemudian diinokulasi selama 24 jam pada suhu inkubator 37º C. 4. Diameter zona hambatan yang terbentuk diukur dengan menggunakan jangka sorong. 5. Semua proses dilaksanakan secara aseptis Prosedur Uji LC 50 Toleransi Udang Windu PL 10 terhadap Ekstrak Butanol Daun Rhizophora mucronata Lamk. Metode uji LC 50 mengacu pada prosedur yang dilakukan Meyer et al. (1982) dalam Yulian (2011), yaitu sebagai berikut : 1. Penyiapan udang windu PL 10 yang dilakukan dengan aklimatisasi selama 5 hari. 2. Ke dalam keller yang telah diisi air laut, dimasukkan sebanyak 6 ekor udang windu PL Ekstrak butanol daun Rhizophora mucronata Lamk. dengan variasi konsentrasi masing-masing sebesar 0 ppm (kontrol), 10 ppm, 100 ppm, 1000 ppm dan ppm dipaparkan. 4. Pengamatan mortalitas dilakukan selama 48 jam dengan selang pengamatan 15 menit, 30 menit, 1 jam, 2 jam, 4 jam, 8 jam, 16 jam, 24 jam dan 48 jam. 5. Nilai LC 50 dihitung dengan menggunakan program EPA Probit.

11 Prosedur Uji in vivo Prosedur uji tantang udang windu PL 15 diawali dengan aklimatisasi udang selama 5 (lima) hari. Aklimatisasi bertujuan untuk penyesuaian diri udang windu dengan kondisi baru. Hewan uji yang digunakan adalah udang windu Post Larva (PL) 15 yang berasal dari PT Gratema Indramayu. Udang windu Post Larva (PL) 15 dipilih, karena pada umur tersebut udang windu rentan terhadap berbagai penyakit (Yulian 2011). Selama proses aklimatisasi udang diberi pakan sebanyak 4 kali sekali dengan selang waktu 6 jam sekali dengan menggunakan artemia. Penyiponan dilakukan setiap hari dengan pergantian air sebanyai 30-50% (Maryani 2003). Setelah udang teradaptasi dengan lingkungan uji, kemudian dilakukan proses penginfeksian bakteri Vibrio harveyi terhadap udang windu PL 15 yang dilakukan melalui perendaman dengan kepadatan bakteri 10 6 CFU/ml. Udang windu yang telah diaklimatisasikan diambil dari wadah stok sebanyak 30 ekor/akuarium, untuk kemudian direndam dalam media larutan bakteri dengan kepadatan 10 6 CFU/ml selama 15 menit kemudian dikembalikan ke akuarium penampungan, tunggu selama 3 jam hingga tampak gejala klinis serangan vibriosis, meliputi: tubuh udang tampak kusam dan kotor, nafsu makan menurun, kerusakan pada kaki dan insang, atau insang berwarna kecoklatan, kondisi tubuh lemah, berenang lambat, bagian kaki renang (pleopoda) dan kaki jalan (pereiopoda) menunjukkan melanisasi. Dan udang yang sekarat sering berenang ke permukaan atau pinggir akuarium. Setelah muncul gejala klinis vibriosis, percobaan pencegahan terhadap infeksi bakteri Vibrio harveyi pada udang windu dilakukan dengan perendaman dalam media ekstrak butanol daun Rhizophora mucronata Lamk. pada masingmasing keller ukuran 3 liter, dengan konsentrasi sebesar 0% (kontrol), 25%, 50%, 75% dan 100% dari nilai LC 50 toleransi udang terhadap ekstrak. Setelah 15 menit perendaman ekstrak butanol, udang windu dikembalikan ke akuarium pemeliharaan dan dilakukan pengamatan nilai Kelangsungan Hidup/Survival Rate (SR) udang windu PL 15 selama 7 hari.

12 Parameter yang Diamati Hasil Uji Fitokimia Pada uji fitokimia, kandungan metabolit sekunder yang diamati adalah reaksi perubahan warna, timbulnya busa dan pengendapan yang dilakukan di laboratorium (Tania 2011). Tabel 1. Parameter Uji Fitokimia Uji Fitokimia Parameter yang diamati + jika terbentuk endapan putih Uji Alkaloid kekuningan/cokelat Uji Flavonoid + jika terbentuk warna orange/merah Uji Fenolik + jika terbentuknya warna biru ungu Uji Steroid/Triterpenoid + jika terbentuk warna merah/biru/ungu Uji Saponin + jika terbentuk busa stabil 1-10 cm Uji Tanin + jika terbentuk warna biru/hijau kehitaman Rendemen Ekstrak Pada ekstraksi daun Rhizophora mucronata Lamk. ini dilakukan perhitungan nilai rendemen. Rendemen adalah perbandingan berat ekstrak yang terkandung dalam suatu bahan simplisia dengan berat awalnya. Berikut perhitungan nilai rendemen menurut (SNI dalam Prabowo 2009): Diameter Zona Hambat Diameter zona hambatan didapatkan dari hasil uji in vitro (uji sensitivitas bakteri) yang merupakan gambaran penghambatan pertumbuhan bakteri oleh aktivitas antibakteri yang terkandung dalam ekstrak Rhizophora mucronata Lamk. Semakin besar zona hambatan yang terbentuk mengindikasikan semakin besar kemampuan ekstrak Rhizophora mucronata Lamk. menghambat pertumbuhan

13 35 bakteri. Diameter zona hambatan dinyatakan dalam milimeter (mm). Menurut Davis Stout (1971) dalam Hardiningtyas (2009): - daerah hambatan dengan diameter >20 mm : potensi sangat kuat - daerah hambatan dengan diameter mm : potensi antibakteri kuat - daerah hambatan dengan diameter 5-10 mm : potensi antibakteri sedang - daerah hambatan dengan diameter < 5 mm : potensi antibakteri lemah Pengamatan Visual Abnormalitas Hewan Uji Pengamatan secara visual dilakukan untuk mengamati tingkah laku yang terjadi pada larva udang uji. Pengamatan dilakukan setelah larva diinfeksi bakteri melalui perendaman pada media pemeliharaan. Pengamatan yang dilakukan meliputi perubahan warna tubuh, perpendaran (menyala) pada tubuh udang windu PL 15 yang terinfeksi bakteri, nafsu makan, dan pergerakan udang. Hasil pengamatan dilakukan untuk mengetahui gejala klinis udang windu yang terinfeksi bakteri Vibri harveyi secara visual (Yulian 2011). Pada pengamatan pemberian pakan dilihat dari sisa pakan yang tidak dimakan dan diklasifikasikan sebagai berikut : 1. Sangat responsif (++++) = tidak ada sisa pakan 2. Responsif (+++) = sisa pakan sebanyak 10% 3. Kurang responsif (++) = sisa pakan sebanyak 50% 4. Tidak responsif (+) = sisa pakan sebanyak % Pada pengamatan pergerakan udang windu PL 15 pasca infeksi diklasifikasikan sebagai berikut : 1. Berenang normal (+++) = udang windu berenang di dinding kolom air 2. Berenang tanpa arah (++) = udang windu berenang tidak beraturan 3. Berenang lemah di dasar (+) = sebagian besar udang windu berenang di dasar

14 Kelangsungan Hidup Pengamatan kelangsungan hidup dilakukan setelah udang windu PL 15 diinfeksi Vibrio harveyi dengan cara menghitung jumlah udang windu PL 15 yang mati setiap hari, kemudian menghitung tingkat kelangsungan hidupnya (SR) dengan menggunakan rumus sebagai berikut : SR = Nt 100% (Effendi 1979) No Keterangan : SR = Survival Rate / Kelangsungan Hidup (KH) (%) Nt = Jumlah udang windu PL 15 yang hidup pada akhir pengamatan (ekor) No = Jumlah udang windu PL 15 pada awal pengamatan (ekor) Pengamatan kelangsungan hidup udang windu PL 15 yang diinfeksi bakteri Vibrio harveyi klinis dilakukan setiap hari hingga akhir pengamatan yang berlangsung selama 7 hari periode pemeliharaan Kualitas Air Parameter kualitas air yang diamati antara lain suhu, ph, dan DO yang diukur pada saat awal, tengah dan akhir masa pemeliharaan. a. Pengukuran suhu dengan menggunakan termometer dilakukan pada pagi dan sore hari. Caranya yaitu memasukkan termometer ke dalam air dan kemudian dicatat suhunya. b. Derajat Keasaman (ph) diukur dengan menggunakan ph meter pada awal, tengah dan akhir penelitian dengan mencelupkan ph meter ke dalam media pemeliharaan larva udang windu. c. Pengukuran kualitas air berupa oksigen terlarut (DO) dilakukan pada awal, tengah dan akhir penelitian dengan menggunakan DO meter. d. Pengukuran salinitas dilakukan setiap hari dengan menggunakan refraktometer.

15 Analisis Data Kandungan fitokimia, rendemen ekstrak, data zona hambatan pertumbuhan bakteri pada uji in vitro, gejala klinis dan data kelangsungan hidup (SR) larva udang windu pada uji in vivo yang diperoleh dianalisis secara deskriptif dalam bentuk tabel dan gambar.