BIOTEKNOLOGI CRISPR/CAS9: CARATERBARUUNTUK MEMUKUL JATUH GEN"

Transkripsi

1 BIOTEKNOLOGI CRISPR/CAS9: CARATERBARUUNTUK MEMUKUL JATUH GEN" SUPATMI Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Jl Raya Bogor Km 46 Cibinong Telp ; Fax Pada satu abad terakhir, kemajuan teknologi di bidang bioteknologi dan biologi molekuler mengalami peningkatan yang luar biasa. Kemajuan tersebut dimulai sejak ditemukannya teknologi PCR (polymerase chain reaction) untuk amplifikasi gen hingga teknologi transgenesisyang mengantarkan berbagai keberhasilan penelitian di bidang biomedik dan pertanian. Namun demikian, transgenesis memiliki keterbatasan. Teknologi transgenesisadalah teknologi rekayasa genetika dengan menyisipkan/mengintroduksi gen asing untuk menciptakan sifatsifat baru yang memiliki nilai agronomis/biomedis tinggi (Hefferon, 2012) atau memodifikasi sifat-sifat yang tidak diinginkan. Penyisipan gen asing tersebut menimbulkan kekhawatiran publik atas produkproduk hasil rekayasa genetika khususnya apabila gen yang diintroduksi memiliki hubungan kekerabatan yangjauh seperti misalnya kita menyisipkan gen tertentu hewan pada tanaman atau manusia. Hal ini tentu saja menghambat transgenesis untuk digunakan secara luas. Selain itu untuk melepaskan produk transgenesis diperlukan beberapa regulasi terkait tentang produkproduk rekayasa genetika (transgenik) seperti uji keamanan pangan dan hayati serta lingkungan dalam rangka untuk mengatasi keselamatan publik dan ini menambah beban biaya produksi yang besar (Todaka et al., 2015). Untuk itu para ahli berusaha mencari inovasi baru untuk mengatasi keterbatasanketerbatasan teknologi transgenesis tersebut. Berbagai penelitian dilakukan untuk mendapatkan metode manipulasi fungsi gen yang lebih effisien, aplikatif dan tepat sasaran. Beberapa usaha tersebut diantaranya adalah homologous recombination dan RNA interference (RNAi). RNAi menjadi Gambar 1. Ilustrasi kartun genome editing, 31

2 iotrends Vol.7 No.2 Tahun 2016 metode yang memungkinkan untuk mengetahuifungsi dari gen yang akurat dan murah, namun demikian, beberapa penelitian menunjukkan bahwa penghambatan fungsi gen ini bersifat sementara dan dimungkinkan menyebabkan penghambatan fungsi gen lain yang bukan merupakan gen target (off-target effects) (Baulcombe, 2004). Saat ini, telah muncul teknologi genome editing yang pendekatannya disinyalir lebih baik dari teknologi manipulasi gen secara transgenesis klasikseperti mengintroduksi sifat baru pada tanaman atau hewan dengan rekombinasi genetik alami dengan cara mengawinkan dengan induk yang lebih baik atau unggul. Genome editing adalah metode perakitan genetik dimana sebuah sekuens DNA bisa disisipkan, diganti dihapus, dan atau dipindahkan dari genom suatu organisme ke organisme laindengan bantuan suatu enzim nuklease yang berfungsi seperti gunting molekuler (Schinkel & Schillberg, 2016). Tujuan dari metode ini tak lain adalah mengedit susunan basa DNA pada genom sehingga ketika diterjemahkan dalam bahasa asam amino bisa merubah sifat dari organisme tersebut. Teknologi genome editing tergolong baru karena baru resmi dipublikasikan pada tahun Beberapa modul teknik genome editing yang telah digunakan diantaranya Zinc Finger Nucleases (ZFNs) dan Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs) (Ledford, 2016). Teknik ini berbeda dengan teknik transgenesis klasik sebab tidak melibatkan pengambilan gen dari spesies lain melainkan mempercepat terjadinya proses mutasi genetik yang secara alami terjadi saatat proses perkawinan /pemuliaan (Sprink et al., 2015). Teknologi ini memungkinkan para peneliti untuk menciptakan mutasi secara permanen, namun demikian, teknik ini sangat mahal dan membutuhkan waktu yang lama serta terbatas untuk digunakan dalam skala luas (Lusser et al., 2012). Untuk itu, para peneliti berusaha untuk menciptakan modul terbaru genome editing yang lebih murah dan memiliki presisi tinggi. Belum lama ini, teknologi tersebut sudah Gambar 2. Prinsip kerja dari CRISPR-Cas9 untuk pengeditan gen. 1) sgrna yang terdiri dari sekuen crrna yang spesifik menyasar DNA target dan tracrrna yang berinteraksi dengan Cas9 protein. 2) Terbentuk ikatan komplek antara sgrna dengann protein Cas9 yang mengandung aktivitas DNA endonuclease. 3) Ikatan komplek tersebut akan menyebabkan dsdna target terputus. 4) Situs yang terputus tersebut akan diperbaiki oleh lewat jalur perbaikan DNA non-homologouatau penghapusan dari nukleotida yang menyebabkan rusaknya fungsi gen. Diambil dari end joining (NHEJ), proses ini bisa menyebabkan insersi 32

3 ditemukan dan diberi namacluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-associated protein-9 nuclease (CRISPR-Cas 9). Modul teknologi genome editing ini disebut-disebut sebagai era penemuan baru dan terbesar dalam dunia biologi molekuler (Gambar 1). Lalu, sebenarnya apa pemberi jarak DNA(DNAspacer) dan pengulangan frasa sekuen yang sama (palindromic sequence).karena proses pengulangan singkat sekuen basa DNA tersebut maka disebut dengan istilah CRISPR. Ternyata,pola yang sama hampir dimiliki di 40% bakteria dan 90% serangan beberapa virus Bakteriofage yang berdampak pada kerusakan dari produk makanan yang dihasilkan sehingga menurunkan baik kuantitas dan kualitas produk makanan yang dihasilkan. Karena itulah para ahli berusaha mengatasi hal tersebut. Mereka akhirnya menemukan Gambar 3. Organisme hasil genome editing dengan menggunakan teknik CRISPR.Kanan: Embrio zebrafish yang memiliki kelebihan jaringan ventral berlebih; kiri: lalat buah yang memiliki mata berwarna hitam dengan mengedit gen yang bertanggung jawab terhadap pigmen warna mata pada lalat buah. Diambil dari Pennisi (2013). itu CRISPR-Cas9, bagaimana cara kerjanya dan mengapa teknik ini menjadi buah bibir? Jawabannya dimulai dari penelitian pada tahun 2007 mengenai kekebalan imunitas yang terjadi pada bakteri. Asal Penemuan CRISPR Sebenarnya ide pertama dari teknik CRISPR ini bermula pada tahun 1987, ketika sebuah tim peneliti mengamati fenomena proses pengulangan sekuens yang aneh pada salah satu ujung dari gen bakteri. Satu dekade kemudian para ahli mikroba menemukan pola yang sama di genom mikroba dimana sekuen dari DNA ternyata diikuti oleh sekuen yang polanya hampir mirip seperti pelengkapdari sekuen sebelumnya. Pola sekuen tersebut adalah 30 basa nukleotida yang acak yang disebut sebagai di mikroba dengan lokasi yang berbeda.pada mulanya para ahli menduga bahwa sekuen yang aneh itu hanyalah sampah, tetapi pada tahun 2005,tiga grupahli bioinformatika melaporkan adanya kesesuaian DNAbakteri dengan DNA pada sekuens virus Fage yang mengindikasikan adanya kemungkinan cara kerja CRISPR dalam mekanisme imunitas mikroba (Pennisi, 2013). Dan ini menjadi petunjuk yang menarik dalam perkembangan CRISPR selanjutnya. Pada tahun 2007, para peneliti dari Danisco, yang bergerak dalam industri komposisi makanan yang dimiliki oleh DuPont, melakukan penelitian mengenai bakteri Streptococcus thermophilusyang sangat penting dalam industri pembuatan yoghurt dan keju. Bakteri ini ternyata menjadi bersifat lemah karena adanya 33 cara bagaimana mendorong agar bakteri ini melawan serangan dari virus Fage tersebut. Mirip dengan prinsip vaksinasi, jadi bakteri tersebut diekspose dengan virus tersebut agar melawan serangan virus. Menariknya bakteri tersebut mampu menciptakan kekebalan imun sistem yang memungkinkannya untuk resisten pada serangan virus yang kedua dan seterusnya. Sistem pertahanan yang ditunjukkan oleh bakteri S. thermophilus tersebut menjadi sangat penting tidak hanya bagi para ahli makanan dan mikrobiologi tapi para ahli biologi molekuler lainnya untuk meneliti lebih lanjut. Akhirnya, Danisco dan timberhasil merubah S. thermophilus yang resisten terhadap serangan Fage dengan menambah atau menghapus spacer DNA yang bersesuaian dengan Fage. Pada saat itu para ahli tersebut masih belum

4 memikirkan bahwa teknologi tersebut adalah cara kerja CRISPR dan potensi CRISPR sebagai teknologi genom editingdalam skala yang lebih besar. Kemudian ahli dari Jerman, Doudna dan Emmanuelle Charpentier (2007)meneliti lebih jauh dari sistem CRISPR ini dengan mengaitkannya dengan proteinprotein lain untuk mengetahui bagaimanas. thermophilus ini menggunakan DNA spacers dalam sistem pertahanan imun mereka. Kedua ahli ini fokus menggunakan sistem CRISPR ini dengan protein yang disebut Cas9 untuk menyederhanakan sistem CRISPR dibandingkan dengan yang lain (Pennisi, 2013). Lalu bagaimana, cara kerja dari CRISPR-Cas9 ini hingga mampu mengedit DNA dari genom organisme?. Cara kerja CRISPR/Cas9 Ada dua komponen utama dalam sistem CRISPR-Cas9 yaitu protein Cas dan single guide RNA (sgrna). Dalam sistem CRISPR-Cas tipe II, Cas 9 ini merupakan protein penting yang menjadi karakteristik utama dan sistem ini yang paling banyak digunakan dalam penelitian. Hal ini karena CRISPR- Cas tipe II ini memiliki komponen yang lebih sederhana yaitu 3 komponen (Cas9, crrna dan trrna) yang lebih mudah diadaptasi dibandingkan CRISPR- Cas tipe I, III dan IV. Cas 9 berfungsi sebagai enzim yang memotong DNA target di sekuen yang posisinya dekat dengan situs protospacer adjacent motif (PAM). Sekuen di situs PAM ini biasanya ditandai dengan 3 basa nukleotida (NGG, dengan N adalah basa nukleotida yang bisa berupa A: Adenin; T: Timin; C: Cytocine; G: Guanin). Protein cas9 ini memiliki Streptococcus thermophilusyang sangat penting dalam industri pembuatan yoghurt dan keju. Bakteri ini ternyata menjadi bersifat lemah karena adanya serangan beberapa virus Bakteriofage yang berdampak pada kerusakan dari produk makanan yang dihasilkan sehingga menurunkan baik kuantitas dan kualitas produk makanan yang dihasilkan. bakteri ini melawan serangan dari virus Fage tersebut 2 situs homolog yaitu RuvC dan HNH, yang masing-masing memotong satu dari untai ganda DNA, yang menghasilkan potongan tumpul (blunt cut) pada sekuen DNA target. Selanjutnya, sgrna yang merupakan RNA buatan gabungan dari dua noncoding RNA yaitu crrna yang berfungsi sebagai guide yang bisa menyesuaikan dengan sekuen dari DNA target dan tracrrnayang berfungsi sebagai scaffold. Sekuen sgrna ini digunakan untuk mentarget lokus genom tanaman/hewan yang secara 34ector34us panjangnya 19-22bp, dengan penambahan 3 bp sekuen PAM (NGG). Cas9 dan sgrna dapat dikonstruk dalam satu vektor atau bisa menggunakan dua vektor yang terpisah dengan mengkombinasikan dengan jenis promotor dan sekuen dari enzim restriksi lainnya tergantung dari karakter genom yang ditargetkan. Metode pengeditan dari CRISPR ini, sama dengan dua teknologi sebelumnya yaitu adanya mekanisme reparasi akibat terpotongnya sekuen DNA target. Mekanisme reparasi tersebut bisa terjadi secara alami yang bergabung dengan Nonhomologous end joining (NHEJ) maupun dengan menggunakan cetakan eksternal yang diinginkan seperti homology directed repair (HDR). Dari mekanisme perbaikan ini maka akan terjadi insersi basa atau penghapusan nukleotida baru yang menyebabkan terjadinya disfungsi gen (Gambar 2).(Sprink et al., 2015). 34

5 Aplikasi CRISPR-Cas 9 Sejak awal kemunculannya, teknologi CRISPR ini telah membawa angina segar dalam dunia genome editing. Aplikasinya yang sederhana dan relatif murah telah banyak diterapkan di sel eukariotik, tikus, nematode dan tanaman. Sebagai contoh nyata Pennisi (2013) melaporkan bahwa 8 bulan sejak kemunculannya di tahun 2007, teknologi CRISPR ini mampu menciptakan varietas baru dari lalat buah yang memiliki mata berwarna hitam dengan mengedit gen yang bertanggung jawab terhadap pigmen warna mata pada lalat buah (Gambar 3). Dalam dunia industri dan therapeutik, penggunaan CRISPR sangat gencar dilakukan, terbukti dengan dana penelitian yang dikeluarkan mencapai hamper 89 juta dollar pada tahun 2013.Menariknya, publikasipublikasi ilmiah yang membahas tentang aplikasi teknik CRISPR ini dalam dunia medis meningkat tajamsepertipenggunaan CRISPR- Cas 9 untuk terapi gen secara in vivo(ledford, 2015). Menariknya, publikasi-publikasi tersebut tercatat sebagai terbesar kedua setelah teknologi induced pluripotent stem sel (ips) dan diikuti oleh Zinc fingers dan Talens (Ledford, 2015). Penerapan teknologi CRISPR ini juga menjadi buah bibir dalam dunia pertanian. Setidaknya pada tahun 2013, ada delapan publikasi ilmiah yang menerapkan teknik ini pada genom tanaman yaitu di Arabidopsis, tembakau, padi, gandum dan sorgum (Belhaj et al., 2013). Teknik CRISPR ini diuji dengan assay ekspresi sementara dengan menggunakan transformasi dari protoplas tanaman serta agroinfiltrasi di jaringan daun. Sebagai contoh pada tahun 2014, Shan dan koleganya menemukan metode untuk menciptakan mutasi pada padi dan gandum dengan menggunakan teknik CRISPR ini dengan menggunakan transformasi dari protoplas dengan masa regenerasi mutan yang relatif cepat selama minggu. Menariknya, pada bulan April 2015, para peneliti melaporkan bahwa mereka berhasil mengedit embrio manusia dengan menggunakan teknik CRISPR ini. Meskipun hal ini memunculkan perdebatan di kalangan masyarakat dunia mengenai etis atau tidak etisnya teknologi CRISPR ini digunakan untuk penelitian pada manusia (Jiang et al., 2013; Ledford et al., 2015). Dari beberapa contoh aplikasi dan trend dari penggunaan teknologi CRISPR yang cenderung meningkat dalam dunia penelitian baik biomedis dan pertanian merupakan bukti nyata bahwa teknik ini merupakan gebrakan baru dalam dunia genome editing dan biologi molekuler yang tentu saja menimbulkan status pro dan kontra mengenai status produk yang dihasilkannya di masa depan. Status dan Masa Depan CRISPR- Cas 9 Mudah dan efisiennya penggunaan teknologi CRISPR ini bukan berarti tanpa hambatan. Sejak kemunculannya, banyak para peneliti yang memperdebatkan tentang siapa yang berhak mendapatkan paten dari teknologi ini karena banyaknya pengajuan klaim atas teknologi ini.selain itu para peneliti internasional juga mulai memperdebatkan mengenai apakah produk yang dihasilkan dengan teknologi CRISPR ini masih tergolong sebagai GMO. Mereka menilai bahwa teknologi genome editing bukan termasuk dalam kategori produk GMO, karena tidak adanya DNA asing yang dimasukkan dan tidak melibatkan penggunaan bakteri Agrobacterium yang bersifat pathogen dalam perakitannya (Puchta & Fauser, 2013; Araki & Ishii, 2015). Dengan kata lain teknik ini meniru proses alami dari sel dan tidak menyebabkan transformasi gen secara keseluruhan yang merupakan isu sensitif dari produk GMO. Karena itulah, para peneliti-peneliti internasional berdebat mengenai terminologi GMO yang dirasa regulasinya tidak lagi valid untuk produk-produk hasil dari teknik genome editing karena organisme yang dihasilkan lebih disebut sebagai Genetically edited organism (GEO) (Qaim& Zilberman, 2003). Menariknya, baru baru ini US Department of Agriculture (USDA) meloloskan jamur hasil dari teknologi CRISPR ini dari regulasi sebagai produk GMO yang merupakan lampu hijau dari produk hasil genome editing(waltz, 2016). Meskipun begitu, kekhawatirankekhawatiran mengenai modifikasi genom hasil dari teknik genome editing ini, yang dimungkinkan tidak bisa dibedakan dengan mutasi alami yang terjadi di alam dan hasil pemuliaan konvensional seperti pada tanaman atau mutagenesis kimia atau fisik yang terjadi. Hal ini menimbulkan kekhawatiran adanya pencemaran plasma nutfah dari alam dan kekhawatiran akan kestabilan dari gen yang diturunkan ke generasi selanjutnya. Karena itulah regulasi mengenai GEO ini menjadi topik yang panas di kalangan pakar 35

6 peneliti internasional sampai saat ini. Evaluasi mengenai produkproduk baru dan akhir yang dihasilkan dari teknik genome editing ini mungkin perlu menjadi perhatian yang serius kedepannya oleh para ahli, agar masyarakat ter-edukasi dan mampu menentukan pilihan dan sikap yang benar terhadap produkproduk dari GMO/GEO ini. Namun demikian, terlepas dari adanya kontroversi terkait regulasi GMO maupun GEO, teknologi CRISPR- Cas9 ini memberikan angin segar bagi para peneliti, industri dan masyarakat pada umumnya. Karena pada akhirnya, inovasi dan perkembangan bioteknologi hewan dan tanaman yang dulu sukar diprediksi akan tercerahkan kedepannya, terutama dengan maraknya isu-isu mengenai pemanasan global dan climate change yang sekarang banyak diperbincangkan. Daftar Pustaka Araki M & Ishii T. (2015): Towards social acceptance of plant breeding by genome editing. Trends in plant science, 20(3), Baulcombe D. (2004) : RNA silencing in plants. Nature431, Belhaj K, Chaparro-Garcia A, Kamoun S, Nekrasov V. (2013): Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods 9, 39. Hartung F, Schiemann J. (2014): Precise plant breeding using new genome editing techniques: opportunities, safety and regulation in the EU. The Plant Journal 78, Hefferon KL. (2012): Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins. Virology, 433(1), bcgetattachment.jsp?citemi d= mei /13/crispr-is-coming-withbig-implications-for-foodfarmers-consumers-andnature/. 13 Maret 2016 Ledford, H. (2015): CRISPR, the disruptor. Nature, 522(7554), Ledford, H. (2016): Riding the CRISPR Wave. Nature, 531(7593), Lusser M, Parisi C, Plan D, Rodriguez-Cerezo E. (2012): Deployment of new biotechnologies in plant breeding. Nat Biotech 30, Pennisi, E. (2013): The CRISPR craze. Science, 341(6148), Puchta H, Fauser F. (2013): Gene targeting in plants: 25 years later. The International Journal of Developmental Biology 57, Qaim, M, & Zilberman, D. (2003): Yield effects of genetically modified crops in developing countries. Science, 299(5608), Jiang, W, Bikard, D, Cox, D, Zhang, F, & Marraffini, LA. (2013): RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology, 31(3), Shan Q, Wang Y, Li J, Gao C. (2014): Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system. Nat Protocols 9, Sprink T, Metje J, Hartung F. (2015): Plant genome editing by novel tools: TALEN and other sequence specific nucleases. Current Opinion in Biotechnology 32, Todaka D, Shinozaki K, & Yamaguchi-Shinozaki K. (2015): Recent advances in the dissection of droughtstress regulatory networks and strategies for development of droughttolerant transgenic rice plants. Frontiers in plant science, 6, 84. Schinkel H & Schillberg S. (2016): Genome editing: intellectual property and product development in plant biotechnology. Plant cell reports, 1-5. Waltz E. (2016): Gene-edited CRISPR mushroom escapes US regulation. Nature News, 532,