PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Transkripsi

1 UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav) TERHADAP KULTUR SEL HeLa SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi Diajukan oleh Francisca Romana Atmaningsih NIM : FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA 2008 i

2 UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav ) TERHADAP KULTUR SEL HeLa SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi Diajukan oleh Francisca Romana Atmaningsih NIM : FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA 2008 ii

3 iii

4 iv

5 HALAMAN PERSEMBAHAN Janganlah kerajinan mu kendor Biarlah roh mu menyala nyala Dan layanilah Tuhan ( Roma 12 : 11 ) Kupersembahkan karya sederhana ini untuk : Bapak... Ibu... Mbak Antik... Dan... Aloysius Alfa Scifo Resa Habel... Kalian adalah bintang bintangku PRAKATA v

6 LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama : Francisca Romana Atmaningsih Nomor Mahasiswa : Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul : Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel HeLa beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me-ngalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 18 Juli 2008 Yang menyatakan ( Francisca Romana Atmaningsih ) vi

7 PRAKATA Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala anugerah-nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah ( Piper crocatum Ruiz & Pav ) Terhadap Kultur Sel HeLa. Skripsi ini dibuat untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Program Studi Farmasi di Universitas Sanata Dharma. Penulisan skripsi ini tidak mungkin terwujud tanpa adanya bimbingan, bantuan dan dukungan dari berbagai pihak, maka pada kesempatan ini, penulis mengucapkan terima kasih kepada: 1. Ibu Rita Suhadi, M.Si., Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 2. Drs. A. Yuswanto S.U., Ph.D., Apt., sebagai dosen pembimbing yang telah banyak meluangkan waktu, tenaga dan atas segala masukan, bimbingan serta sarannya dalam penyusunan skripsi ini. 3. Drs. Mulyono, Apt selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan memberikan masukan dan saran, serta memberikan bimbingan dalam hal statistika dan olah data. 4. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan memberikan banyak masukan dan saran, terutama dalam determinasi tanaman. vii

8 5. Drs. P. Sunu Hardiyanta, S.J., M.Sc. yang telah meluangkan banyak waktu dan tenaga untuk memberikan bimbingan dalam pengolahan data. 6. Jeffry Yulianus, M.Si. yang telah meluangkan waktu dan tenaga untuk berdiskusi dan memberikan berbagai saran serta bimbingan dalam penyusunan skripsi ini. 7. Ign. Y Kristyo B, M.Si., yang telah memberikan banyak masukan dalam identifikasi dan determinasi tumbuhan. 8. Segenap dosen dan karyawan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, terima kasih atas bantuannya selama ini. 9. Mbak Yuli dan segenap karyawan LPPT UGM yang telah banyak membantu dan menemani dalam penelitian skripsi ini. 10. Bapak dan Ibu atas segala dukungan dalam segala hal yang tidak akan pernah bisa aku bayar dan doa yang mengantarku sampai pada hari ini. 11. Mbak Antik yang telah memberikan doa dan dukungan dalam berbagai bentuk. Dan juga Mas Ale yang sering memberi masukan dan saran yang berhubungan dengan penggunaan komputer. 12. Aloysius Alfa Scifo Resa Habel atas segala pengorbanan, pengertian, bantuan, doa, cinta, semangat, dan dukungan selama penyusunan skripsi ini. Terima kasih telah menjadi semangat selama ini. Dan juga semua keluarga atas segala dukungannya. 13. Bapak Gunawan, yang telah memberikan tanaman sirih merah sebagai bahan penelitian skripsi ini. viii

9 14. Ririt, Nur, Meri dan Eva atas semua kebersamaan, kerjasama, suka duka, pengorbanan dan canda selama penelitian dan penyusunan skripsi ini. 15. Ana, Wida, Atin, Rina, Ayu, Manda, Novi, Heny, Risa, Cicil, Fila serta semua teman teman kelompok praktikum D angkatan 2004 atas semua kebersamaan dan kenangan selama kuliah. 16. Semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini. Atas segala bantuan yang telah diberikan selama ini, penulis mengucapkan banyak terima kasih. Penulis juga menyadari sepenuhnya penulisan skripsi ini tidak terlepas dari keterbatasan dan kekurangan penulis. Oleh karena itu, diharapkan kritik dan saran yang membangun demi penyempurnaan skripsi ini. Besar harapan penulis bahwa skripsi ini dapat bermanfaat bagi perbendaharaan dan perkembangan ilmu pengetahuan. Penulis ix

10 x

11 INTISARI Berbagai teknik pengobatan kanker saat ini telah dikembangkan dan banyak dilakukan penelitian-penelitian yang bertujuan untuk mencari cara pengobatan alternatif khususnya pengobatan yang menggunakan bahan-bahan dari alam. Tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) secara empiris dikenal sebagai tanaman obat alami untuk mengobati berbagai penyakit, termasuk penyakit kanker, seperti kanker payudara dan kanker leher rahim. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan sebelumnya, diketahui bahwa daun sirih merah mengandung flavanoid yang memiliki aktivitas sebagai antikanker. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah berpotensi dikembangkan sebagai antikanker. Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah. Uji sitotoksisitas dilakukan dengan memberi perlakuan sel HeLa dengan ekstrak etanolik daun sirih merah. Metode uji sitotoksisitas yang digunakan adalah metode direct counting. Metode perhitungan statistik One way Anova dilakukan untuk menganalisis signifikansi antara perlakuan dan kontrol, sedangkan untuk mengetahui harga LC 50 dilakukan perhitungan secara statistik menggunakan analisis probit. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap sel HeLa. Harga LC 50 yang diperoleh dari ekstrak etanolik daun sirih merah adalah sebesar 1.143,1 μg/ml. Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah berefek sitotoksik serta diperkirakan memiliki aktivitas sebagai antikanker. Kata kunci: daun sirih merah, sel HeLa, sitotoksisitas, LC 50. xi

12 ABSTRACT A lot of medical techniques are increased and many studies have been done to get medical alternative for cancer, especially medical treatment that used natural product. Piper crocatum Ruiz & Pav were used as a natural medicine for many diseases, including cancer, such as breast and cerviks cancer. Previous studies showed that Piper crocatum Ruiz & Pav leaves contains flavanoid which have anticancer activity. The purpose of research was to identify whether etanolic extract of Piper crocatum Ruiz & Pav has anticancer. The study was pure experimental research with complete random and one way design. The cytotoxicity effect was determined using direct counting method. Data were analysed by One Way Anova. And probit analysis is used to determine LC 50 value. The result showed that etanolic extract of Piper crocatum Ruiz & Pav leaves had cytotoxic effect to HeLa cells. The LC 50 value obtained from that etanolic exstract of Piper crocatum Ruiz & Pav leaves was ,1μg/ml. Therefore, etanolic exstract of Piper crocatum Ruiz & Pav leaves have cytotoxicity effect and might have anticancer activity. Keyword : cytotoxicity,piper crocatum Ruiz & Pav, HeLa cell, value of LC 50 xii

13 DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL..... HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING... HALAMAN PENGESAHAN... HALAMAN PERSEMBAHAN... ii iii iv v HAK CIPTA... vi PRAKATA... PERNYATAAN KEASLIAN KARYA... INTISARI... ABSTRACT... DAFTAR ISI... vii x xi xii xiii DAFTAR TABEL... xvii DAFTAR GAMBAR... xviii DAFTAR LAMPIRAN... xix BAB I PENGANTAR... 1 A. Latar Belakang Rumusan masalah Keaslian penelitian Manfaat penelitian... 3 B. Tujuan Tujuan umum Tujuan khusus. 3 xiii

14 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA... 5 A. Tanaman Sirih Merah ( Piper crocatum Ruiz & Pav ) Sistematika Sinonim Deskripsi Kandungan Kimia Khasiat dan Penggunaan... 6 B. Teknik Penyarian Penyarian 7 2. Maserasi. 7 C. Kanker... 8 D. Kultur Sel E. Uji Sitotoksisitas Penghitungan Sel Tidak Langsung Dengan Metode MTT Metode Direct Counting F. Senyawa Antikanker G. Flavonoid H Alkaloid I. Landasan Teori J. Hipotesis BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional xiv

15 1. Variabel bebas Variabel tergantung Variabel pengacau terkendali Definisi operasional variabel C. Alat dan Bahan Alat Bahan D. Tata Cara Penelitian Determinasi tanaman Pengumpulan dan penyiapan bahan Ekstraksi Sterilisasi Alat dan Bahan Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah pada sel HeLa Uji Sitotoksisitas Dengan Metode MTT Uji Sitotoksisitas Dengan Metode Direct Counting E. Analisis Hasil BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Pengumpulan dan Penyiapan Bahan B. Ekstraksi C. Sterilisasi Alat dan Bahan D. Uji Sitotoksisitas Ekstrak etanolik daun sirih merah Pada Sel HeLa xv

16 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan B. Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN BIOGRAFI PENULIS xvi

17 DAFTAR TABEL Halaman Tabel I. Tabel Nilai Absorbansi Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah pada berbagai Konsentrasi dengan Metode MTT Tabel II. Tabel Persentase Jumlah Sel Yang Mati Pada Berbagai Konsentrasi Tabel III. Nilai Log Konsentrasi dan konversi probit sel HeLa pada berbagai konsentrasi senyawa uji Tabel IV. Tabel nilai r (koefisien korelasi) pada level signifikansi 5% dan 1% xvii

18 DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Reaksi reduksi MTT oleh enzim suksinat dehidrogenase Gambar 2. Grafik Log Konsentrasi vs Nilai Probit pada Replikasi I Gambar 3. Grafik Log Konsentrasi vs Nilai Probit pada Replikasi II Gambar 4. Grafik Log Konsentrasi vs Nilai Probit pada Replikasi III Gambar 6. Gambar Tanaman Sirih Merah Gambar 7. Gambar Perlakuan Ekstrak Sirih Merah pada Sel dalam sumuran 96 well plate Gambar 8. Foto Sel HeLa Tanpa Perlakuan Gambar 9. Foto Sel HeLa dengan Perlakuan Ekstrak Etanolik Sirih Merah Konsentrasi 1000 µg/ml Gambar 10.. Foto Sel HeLa dengan Perlakuan Ekstrak Etanolik Sirih Merah Konsentrasi 1500 µg/ml Gambar 11. Foto Sel HeLa dengan Perlakuan Ekstrak Etanolik Sirih Merah Konsentrasi 1750 µg/ml xviii

19 DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Foto tanaman Sirih Merah ( Piper crocatum Ruiz & Pav ) Lampiran 2. Gambar Perlakuan Ekstrak Sirih Merah pada Sel dalam sumuran 96 well plate Lampiran 3. Foto Sel HeLa Tanpa Perlakuan Lampiran 4. Foto Sel HeLa dengan Perlakuan Ekstrak Etanolik Sirih Merah Konsentrasi 1000 µg/ml Lampiran 5. Foto Sel HeLa dengan Perlakuan Ekstrak Etanolik Sirih Merah Konsentrasi 1500 µg/ml Lampiran 6. Foto Sel HeLa dengan Perlakuan Ekstrak Etanolik Sirih Merah Konsentrasi 1750 µg/ml Lampiran 7. Perhitungan nilai korelasi LC 50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel HeLa pada taraf kepercayaan 95% Lampiran 8. Uji distribusi data dengan Kolmogorov-Smirnov Lampiran 9. Hasil uji signifikansi dengan analisis statistik Lampiran 10. Perhitungan LC50 dengan Analisis Probit Lampiran 11. Tabel Harga Probit Lampiran 12. Hasil Determinasi Tanaman Daun Sirih Merah xix

20 BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Penyakit kanker masih menjadi penyakit yang mematikan di dunia dan jumlahnya terus meningkat dari tahun ke tahun. Sampai sekarang, jumlah penderita kanker di seluruh dunia mencapai 7 juta orang, bahkan UICC (Union Internationale Contre le Cancer) memperkirakan jumlah penderita kanker di negara berkembang pada tahun 2020 bisa mencapai 10 juta orang, dengan 16 kasus baru setiap tahunnya (Anonim, 2006). Apalagi penyakit kanker bisa menyerang siapa saja, tidak mengenal kelas sosial ekonomi, jenis kelamin dan usia penderita. Di Indonesia, penyakit kanker juga menjadi salah satu masalah kesehatan yang cukup penting, karena angka kejadian dan jumlah kematian akibat kanker terus meningkat setiap tahunnya (Anonim, 2006). Kanker serviks atau karsinoma serviks uterus merupakan jenis kanker kedua terbanyak pada perempuan di seluruh dunia setelah kanker payudara. Namun di Indonesia, kanker serviks menduduki peringkat pertama. Kanker serviks yang sudah masuk ke stadium lanjut sering mengakibatkan kematian dalam jangka waktu yang relatif cepat (Andrijono, 2003). Berbagai cara pengobatan telah dilakukan untuk mengobati penyakit kanker, antara lain dengan menggunakan obat sintesis dan radiasi. Teknik-teknik 1

21 2 pengobatan tersebut dapat menimbulkan efek samping yang pada akhirnya menyebabkan pasien menderita. Atas dasar pertimbangan tersebut maka saat ini banyak dilakukan penelitian-penelitian yang tujuannya mencari cara pengobatan alternatif khususnya pengobatan yang menggunakan bahan-bahan dari alam (Ganiswara dan Nafrialdi, 2003). Daun sirih merah banyak digunakan dalam masyarakat untuk mengobati berbagai jenis penyakit. Secara empiris, ekstrak daun sirih merah dalam pemakaian secara tunggal atau diformulasikan dengan tanaman obat lainnya mampu menyembuhkan beberapa jenis kanker, seperti kanker payudara, kanker rahim dan leukemia (Sudewo, 2005). Oleh karena itu, untuk mengetahui apakah tanaman sirih merah mempunyai khasiat sebagai antikanker, maka perlu dilakukan penelitian. Penelitian ini menggunakan sel HeLa untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah mempunyai efek sitotoksik terhadap sel kanker. Sitotoksistas ekstrak etanolik daun sirih merah ini selanjutnya dapat digunakan sebagai dasar untuk mengembangkan suatu senyawa antikanker terutama pada sel HeLa. 1. Rumusan masalah Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan, maka dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut: a. apakah ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel HeLa? b. berapa besar harga LC 50 dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel HeLa?

22 3 2. Keaslian penelitian Belum pernah dilakukan penelitian mengenai sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel HeLa. 3. Manfaat penelitian a. Manfaat teoritis Penelitian ini dapat memberikan informasi tentang efek sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel HeLa yang dapat menambah kemajuan ilmu pengetahuan terutama bidang ilmu farmasi. b. Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat membuktikan khasiat daun sirih merah sebagai obat kanker. B. Tujuan 1. Tujuan umum : Untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik. 2. Tujuan khusus : a.untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel HeLa. b.untuk mengetahui besar harga LC 50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel HeLa.

23 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA 1. Sistematika A. Piper crocatum Ruiz & Pav Famili Genus Spesies : Piperaceae : Piper : Piper crocatum Ruiz & Pav. (Anonim,2007) 2. Sinonim Piper ornatum N.E.Br 3. Deskripsi Tanaman dengan batang bulat berwarna hijau keunguan dan tidak berbunga. Batangnya beruas dengan jarak buku 5-10 cm. Di setiap buku tumbuh bakal akar. Daun bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, bertepi rata, dan permukaannya mengkilap atau tidak berbulu. Panjang daunnya bisa mencapai cm. Warna daun bagian atas hijau bercorak putih keabuabuan bagian bawah daun berwarna merah hati cerah. Daunnya berlendir, berasa sangat pahit, dan beraroma wangi khas sirih. Sirih merah bisa tumbuh dengan baik di tempat yang teduh dan tidak terlalu banyak terkena sinar matahari. Jika terkena sinar matahari langsung pada siang hari secara terus-menerus warna merah daunnya bisa menjadi pudar, buram dan kurang menarik (Sudewo, 2005). 4

24 5 4. Kandungan Kimia Berdasarkan penelitian, diketahui bahwa bahwa sirih merah mengandung flavanoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan minyak atsiri (Sudewo, 2005). 5. Khasiat dan penggunaan Tumbuhan sirih merah digunakan sebagai obat di masyarakat, antara lain sebagai anti diabetes, jantung koroner, radang prostat, TBC, asam urat dan antikanker (Sudewo, 2005). Secara empiris ekstrak daun sirih merah dalam pemakaian secara tunggal atau diformulasikan dengan tanaman obat lainnya mampu membasmi aneka penyakit. Efek zat aktif yang terkandung dalam daun sirih merah dapat merangsang saraf pusat dan daya pikir. Di samping itu, juga memiliki efek pencegah ejakulasi dini, antikejang, antiseptik, analgetik, antiketombe, pelindung organ hati, antidiare, antikoagulan, mempertahankan kekebalan tubuh, dan penghilang bengkak. Daun sirih merah juga mampu mengatasi penyakit seperti diabetes mellitus, peradangan akut pada organ tertentu, luka yang sulit sembuh, kanker payudara dan kanker rahim, tifus, leukemia, TBC, lemah syahwat, ambeien, batuk, maag kronis, jantung koroner, darah tinggi, dan asam urat (Sudewo, 2005). B. Teknik Penyarian 1. Penyarian Penyarian merupakan kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut dengan pelarut cair sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut.

25 6 Struktur kimia yang berbeda-beda akan mempengaruhi kelarutan serta stabilitas senyawa aktif terhadap pemanasan, udara, cahaya, logam berat dan derajat keasaman. Diketahuinya senyawa aktif yang dikandung akan mempermudah pemilihan pelarut dengan cara ekstraksi yang tepat (Anonim, 2000). Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan cara mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Anonim, 2000) 2. Maserasi Beberapa metode ekstraksi yang sering digunakan antara lain : metode ekstraksi dengan menggunakan pelarut, destilasi uap dan metode ekstraksi lainnya. Maserasi adalah proses ekstraksi simplisia dengan menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur kamar. Secara teknologi, maserasi termasuk ekstraksi dengan prinsip metode pencapaian konsentrasi pada kesetimbangan (Anonim, 2000). Keuntungan cara penyarian dengan maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Maserasi dapat dilakukan modifikasi untuk meningkatkan efektivitas penyarian, seperti pelarut, biaya produksi dan waktu. Bentuk modifikasi yang dilakukan antara lain adalah digesti. Digesti adalah cara maserasi menggunakan pemanasan lemah, yaitu pada suhu 40ºC -50ºC. Keuntungan dari metode digesti yaitu kekentalan pelarut akan

26 7 berkurang dan kemampuan cairan penyari dalam melarutkan zat aktif akan meningkat (Anonim, 1986). C. Kanker Kanker adalah sekumpulan berbagai macam penyakit dengan 3 ciri utama : (1) Pertumbuhan yang tidak terkontrol, (2) Bersifat mengancam jiwa (life threatening), dan (3) Bersifat berbeda dari umumnya sel normal. Meskipun penyebab kanker sangat beragam, definisi klinik kanker yang dapat diterima adalah : sekumpulan penyakit yang dikarakterisasi oleh pertumbuhan sel yang tidak normal yang menyerang jaringan di sekitarnya dan menyebar (metastasis) ke bagian tubuh atau organ lain. Adanya berbagai istilah kadangkala membingungkan antara kanker, tumor dan neoplasma. Penggunaan definisi neoplasma kurang tepat karena neoplasma berarti pertumbuhan sel baru tanpa memperhitungkan sifat asal pertumbuhan, sedangkan istilah tumor dapat diterapkan baik pada pertumbuhan sel yang jinak (benigna) maupun ganas (malignant) (King, 2000). Meski kanker biasanya membentuk suatu tumor, beberapa macam kanker misalnya leukemia, tidak membentuk tumor. Perlu diingat bahwa tidak semua tumor adalah kanker. Tumor jinak (non cancerous) tidak menyebar ke bagian lain dari tubuh (metastasis) dan dengan sangat sedikit pengecualian tidak bersifat life threatening (Anonim, 2005). Karsinogenesis, proses yang menghasilkan kanker, adalah suatu rangkaian mekanisme bertahap yang dihasilkan dari akumulasi kesalahan pada jalur pengaturan vital. Proses ini dimulai dalam suatu sel tunggal yang kemudian membelah dan menghasilkan tambahan perubahan yang memberi kemampuan

27 8 pertahanan hidup lebih daripada sel-sel lain di sekitarnya. Sel yang telah berubah ini menghasilkan jutaan sel yang pada akhirnya menimbulkan kanker (King, 2000). Kanker terjadi ketika sel-sel pada suatu bagian tubuh berkembang secara tidak terkontrol. Sel-sel tubuh normal tumbuh, membelah dan mati dengan suatu pola yang teratur. Selama tahun-tahun awal kehidupan seseorang, sel normal membelah lebih cepat hingga orang tersebut dewasa. Setelah itu, sel-sel pada sebagian besar bagian tubuh membelah hanya untuk menggantikan sel-sel mati dan untuk memperbaiki kerusakan. Karena sel kanker terus menerus tumbuh dan membelah, sel kanker berbeda dari sel normal. Sel kanker hidup lebih lama dari sel normal dan terus membentuk sel abnormal baru. Sel kanker dapat bergerak ke arah bagian tubuh lain dari tempat semula pertumbuhannya dan menggantikan jaringan normal. Proses ini yang disebut metastasis, terjadi ketika sel kanker masuk ke dalam aliran darah atau pembuluh limfe (Anonim, 2005). Sel kanker muncul karena adanya kerusakan pada DNA. DNA adalah substansi yang terdapat dalam setiap sel dan mengatur seluruh aktivitas sel. Saat DNA mengalami kerusakan, tubuh mampu memperbaikinya. Pada sel kanker, kerusakan DNA tidak diperbaiki. Seseorang dapat mewariskan DNA yang rusak ini, yang kemudian kemungkinan menimbulkan kanker yang diwariskan. Diperkirakan seringkali kerusakan DNA pada seseorang terjadi karena adanya paparan dari lingkungan, misalnya karena rokok (Anonim, 2005).

28 9 Proses terjadinya kanker atau karsinogenesis ini terbagi menjadi tiga tahap, yaitu : tahap inisiasi Tahap ini terjadi pada DNA, dimana suatu zat yang bersifat genotoksik yang biasa disebut sebagai inisiator, dan akan mengubah informasi genetik di dalam sel. Hal ini akan menyebabkan sel tersebut berkembang di luar kontrol dari sistem tubuh yang normal. a. tahap promosi Tahap ini meliputi ekspresi mutasi yang bisa menyebabkan perubahan dari fungsi seluler, ekspresi gen, fungsi reseptor, dan pertumbuhan neoplasma. b. tahap progresif Dalam prosesnya secara klinis, neoplasma akan berkembang menjadi ganas. Perkembangan sel tumor berlangsung karena sistem imun tidak mampu mengontrol perkembangan sel tumor sehingga terjadi pembelahan sel tumor secara terus menerus. Selain itu terjadi pula aspek lain dalam tahap ini yaitu vaskularisasi yang dikendalikan oleh suatu faktor angiogenesis, yang kemudian akan diikuti dengan invasi sel tumor ke jaringan limfa maupun ke pembuluh darah. Setelah proses invasi akan diikuti dengan proses metastasis yang akan berkembang setelah sel kanker mengalami diseminasi (pertumbuhan kedua) pada jaringan limfa dan pembuluh darah, dan bila sel kanker memasuki pembuluh darah dalam bentuk emboli yang kecil maka akan mengalami penghancuran

29 10 setelah berinteraksi dengan komponen darah. Apabila terdapat emboli yang tertinggal pada suatu jaringan atau organ maka hal ini akan memicu pembentukan trombus sehingga sel kanker dapat membelah dan terjadi perkembangan mikrometastatik. Mikrometastatik ini akan berkembang dan terus berkembang pada jaringan baru yang memicu proliferasi pembuluh darah yang menyebabkan pertumbuhan yang sangat cepat (van Cauteren et al cit Pusparanti, 2003). D. Kultur Sel Kultur sel HeLa merupakan continous cell line yang tumbuh sebagai sel semi melekat pada epitel. Kultur sel HeLa diturunkan dari sel epitel kanker rahim (cerviks) manusia. Sel ini diisolasi pada tahun 1951 dari seorang wanita penderita kanker rahim bernama Henrietta Lacks, berusia 31 tahun, berasal dari Baltimore, US. Kultur sel HeLa merupakan sel kanker yang timbul akibat infeksi virus HPV (Human Papilloma Virus) 18. Kultur sel HeLa cukup aman dan merupakan sel manusia yang umum digunakan untuk kepentingan kultur sel (Anonim, 2000). E. Uji Sitotoksisitas 1.Penghitungan Sel Tidak Langsung dengan Metode MTT Uji sitotoksik dilakukan dengan metode mikrotitrasi yang merupakan metode uji yang efisien, dalam satu plate terdapat 96 sumuran sehingga lebih banyak data yang didapatkan. Tiap sumuran memiliki luas mm 2 dengan

30 11 kapasitas medium sebanyak 0,1 atau 0,2 ml. Dengan metode uji ini semua populasi sel terpapar sampel uji (Freshney, 2000). Uji sitotoksik metode MTT merupakan uji yang sederhana, cepat dan aman, dengan deteksi secara kolorimetri. Prinsip uji sitotoksik dengan metode MTT adalah kemampuan sel hidup mereduksi garam MTT ( 3-(4,5-dimetil-tiazol- 2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromid ) menjadi kristal formazan. Kemampuan reduksi ini ditunjukkan oleh enzim suksinat dehidrogenase mitokondria pada sel yang viable/sel hidup yang masih melangsungkan proses respirasi. (Chapdelaine, 2006). Senyawa MTT yang larut dalam air dan berwarna kuning setelah direduksi oleh suksinat dehidrogenase akan menjadi formazan yang berwarna biru. (Doyle and Griffiths, 2000). Agen sitotoksik yang diuji, diinkubasikan bersama kultur sel selama waktu tertentu dalam inkubator 5% karbondioksida (Dash, 2001) setelah masa inkubasi, MTT ditambahkan untuk bereaksi dengan sel hidup, MTT dikonversikan menjadi kristal formazan oleh suksinat dehidrogenase (Chapdelaine, 2006). Kristal formazan yang terbentuk tidak larut dalam air (Mossman cit Chapdelaine, 2006). Untuk melarutkan kristal ini digunakan sodium dodesil sulfat (Toda cit Chapdelaine, 2006). Dengan menginkubasikan sel dengan MTT dalam lingkungan yang sesuai, jumlah sel hidup dapat terkuantifikas sesuai dengan formazan yang terbentuk. Sensitivitas metode ini tergantung pada tipe sel, status metabolik serta teknik melarutkan kristal formazan (Chapdelaine, 2006). Kelemahan metode ini tidak dapat diaplikasikan untuk sampel yang berwarna, karena warna sampel juga

31 12 akan menyerap sinar visibel sehingga absorbansi yang diperoleh menjadi lebih besar dari yang seharusnya dan hasil pengamatan uji sitotoksisitas menjadi tidak valid (Elly, 2002). 2. Metode Direct Counting Metode yang paling umum dilakukan untuk penghitungan sel yang akurat dan efisien adalah dengan menggunakan haemocytometer. Dalam metode ini digunakan suatu bilik hitung dengan kedalaman 0,1 mm dan persegi untuk mempermudah penghitungan. Menggunakan zat warna seperti Trypan Blue, penghitungan sel yang hidup (viable) dan sel yang tidak hidup (non viable) dapat dilakukan. Seratus sel dengan kepadatan 1,5 x 10 4 sel / 100 μl didistribusikan ke dalam sumuran sumuran 96 well plate dan diinkubasi selama 24 jam pada inkubator suhu 37ºC, CO 2 5%. Kemudian ditambah 100 μl seri konsentrasi senyawa uji ke dalam tiap sumuran berisi sel tersebut, lalu diinkubasi lagi selama 24 jam. Setelah inkubasi, jumlah sel yang hidup dihitung dengan mikroskop dengan bantuan haemocytometer. Lima puluh μl Trypan blue dimasukkan ke tiap sumuran kemudian dihomogenkan dan diambil 10 μl dipipetkan ke haemocytometer lalu dihitung dengan mikroskop jumlah sel yang hidup. Sel yang mati akan berwarna biru sedangkan yang hidup akan berwarna bening. Sampling yang akurat, pengenceran dan pengisian bilik secara tepat sangat penting. Pengisian yang berlebihan, adanya gelembung udara dan bilik hitung yang kurang bersih menyebabkan kesalahan penghitungan. Kesalahan statistik dapat dikurangi dengan menghitung cukup sel dengan replikasi yang tetap.

32 13 Penghitungan dengan haemocytometer adalah metode yang paling sederhana dan versatile (viable dan non viable) dengan keuntungan yaitu memberikan pengukuran langsung (aktual sel) (Doyle and Griffiths, 2000). F. Senyawa Antikanker Menurut National Cancer Institute, senyawa baru yang akan dikembangkan sebagai antikanker harus mempunyai nilai LC 50 kurang dari 20 µg/ml (Suffness cit, Puspitasari, Sukardiman, Widyawaruyanti, 2003) G. Flavonoid Flavonoid merupakan suatu senyawa polifenol yang strukturnya merupakan turunan dari inti aromatik flavon atau 2-fenilbenzopiran. Golongan flavonoid dapat digambarkan sebagai deretan senyawa C 6 -C 3 -C 6. Artinya kerangka karbonnya terdiri atas dua gugus C 6 (cincin benzena tersubstitusi) disambungkan oleh rantai alifatik tiga karbon (Robinson, 1995). Aktivitas antioksidan dimiliki oleh sebagian besar flavonoid disebabkan oleh adanya gugus hidroksi fenolik dalam struktur molekulnya. Ketika senyawasenyawa ini bereaksi dengan radikal bebas, mereka membentuk radikal baru yang distabilisasi oleh efek resonansi inti aromatik. Dengan demikian, fase propagasi yang meliputi reaksi radikal berantai dapat dihambat (Cuvelier, 1991). Aktivitas flavonoid yang bermanfaat untuk kesehatan antara lain efek antioksidan, antikarsinogenik, antiproliferatif, antiangiogenik, antiinflamasi dan antiestrogenik dengan tidak ada atau sedikit efek samping atau toksik.

33 14 Berdasarkan sifat di atas, banyak suplemen makanan atau produk herbal yang mengandung flavonoid dapat diterima secara komersial pada saat ini (Zhang dan Morris, 2003). Ekstraksi flavonoid dari dalam simplisia tumbuhan dapat dilakukan dengan menggunakan pelarut polar, semi polar, maupun non polar sesuai dengan kelarutan flavonoid yang diekstraksi. Kelarutan flavonoid berbeda-beda sesuai dengan golongan dan substitusinya (Robinson, 1995). Pelarut yang kurang polar digunakan untuk mengekstraksi aglikon flavonoid, sedangkan pelarut yang lebih polar digunakan untuk glikosida flavonoid atau antosianin. Flavonoid merupakan senyawa polar karena mempunyai sejumlah gugus hidroksi yang tidak tersubstitusi, atau suatu gula. Oleh karena itu, umumnya flavonoid cukup larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetilsulfoksida, dimetilformamid dan air (Markham, 1988). H. Alkaloid Istilah alkaloid pada umumnya mencakup senyawa bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen, biasanya dalam gabungan, sebagai bagian dari sistem siklik (Harborne, 1987). Alkaloid sebagai golongan dibedakan dari sebagian besar komponen tumbuhan lain berdasarkan sifat basanya (kation). Senyawa ini biasanya terdapat dalam tumbuhan sebagai garam berbagai asam organik (Robinson, 1995).

34 15 I. Landasan teori Dalam pengobatan di masyarakat, daun sirih merah banyak digunakan untuk menyembuhkan beberapa jenis kanker, antara lain kanker payudara, kanker rahim dan leukemia. Berdasarkan penelitian, diketahui bahwa daun sirih merah mengandung flavanoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan minyak atsiri. Flavanoid merupakan suatu senyawa polifenol yang strukturnya merupakan turunan dari inti aromatik flavon atau 2-fenilbenzopiran dan memiliki aktivitas sebagai antioksidan, antikarsinogenik, antiproliferatif, antiangiogenik, antiinflamasi dan antiestrogenik dengan tidak ada atau sedikit efek samping atau toksik. Flavonoid umumnya cukup larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetilsulfoksida, dimetilformamid dan air Hal tersebut yang mendasari dilakukannya penelitian dengan mengekstraksi daun sirih merah dengan menggunakan etanol 70% terhadap kultur sel HeLa ini, untuk melihat seberapa besar sitotoksisitas yang dihasilkan pada masing-masing konsentrasi dan mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah berpotensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker. kultur sel HeLa. J. Hipotesis Ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap

35 BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Berdasarkan atas proses bagaimana cara pengendalian variabel pengacau, randomisasi, sampel dan cara variabel penelitian diamati maka penelitian sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel HeLa ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah. B. Variabel penelitian dan Definisi operasional 1.Variabel bebas Kadar ekstrak etanolik daun sirih merah yang ditambahkan pada biakan sel HeLa yaitu kadar 1000 µg/ml; 1250 µg/ml; 1500 µg/ml; 1750 µg/ml; 2000 µg/ml 2.Variabel tergantung Aktivitas sitotoksik yang ditunjukkan dengan persen kematian sel HeLa oleh ekstrak etanolik daun sirih merah. 3. Variabel pengacau terkendali a. Medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI 1640-serum b. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun sirih merah dikendalikan dengan memanen daun pada tempat dan waktu yang sama. 16

36 17 3. Definisi operasional variabel a. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel HeLa. b. Ekstrak etanolik daun sirih merah adalah ekstrak yang diperoleh dengan cara mengekstraksi daun sirih merah secara maserasi menggunakan larutan penyari etanol 70 %. c. Sel HeLa Sel HeLa merupakan continous cell line yang tumbuh sebagai sel semi melekat pada epitel dan diturunkan dari sel epitel kanker leher rahim (cerviks) manusia. d. LC 50 ialah konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih yang mampu membunuh atau menyebabkan kematian sejumlah 50% sel HeLa dan dinyatakan dalam µg/ml. C. Alat dan Bahan 1. Alat Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas, stamper, mortir, timbangan analitik (Metler Toledo), alumunium foil, magnetic stirrer, oven, blender, ayakan, autoklaf, tissue culture flas (Nunc), tabung conical (Nunc), sentrifuge (DS instrument,inc), inkubator (Memmer), mikropipet, lemari pendingin (Sharp), cell counter (Nunc), 96-well plate (Nunc), ELISA reader (SLT 340 ATC), laminar air flow (Labconco), mikroskop (Olympus IMT-2), haemocytometer (Nebauer), kain monel, tisu, sarung tangan dan masker.

37 18 2. Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah : a. Daun sirih merah segar b. Kultur sel HeLa yang diambil dari stok di Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. c. Pereaksi-peraksi yang digunakan untuk preparasi ekstrak daun sirih merah 1) Larutan etanol 70 % d. Pereaksi-pereaksi untuk uji sitotoksisitas 1) Media pencuci: RPMI 1640 (Sigma), natrium bikarbonat, Hepes Media penumbuh: RPMI 1640, FBS (Foetal Bovine Serum) 10%, Penisilin-Streptomisin 1% (Gibco), dan Fungison 0,5% (Gibco). 2) Reagen Stopper : SDS (sodium dodeksil sulfat) dalam HCl 0,01 N (Merck) 3) MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) (Sigma) 4) tripsin 0,5% 5) pewarna trypan blue ( Sigma ) 6) aquabides 7) DMSO ( Dimetil Sulfoksidase )

38 19 D. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu daun sirih merah segar, telah dideterminasi terlebih dahulu di laboratorium Biologi Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta dengan merujuk acuan baku. 2. Pengumpulan dan penyiapan bahan Bahan yang digunakan berupa daun sirih merah, diambil dari tanaman sirih merah di Desa Mantenan, Kecamatan Mertoyudan, Kabupaten Magelang, Jawa Tengah. Daun tersebut dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang melekat, kemudian ditiriskan sampai sisa-sisa air menghilang. Daun kemudian dikeringkan dalam oven dengan suhu C. Setelah kering, lalu diserbuk dengan blender sampai halus dan diayak dengan ayakan 0,75 mm. 3. Ekstraksi Serbuk simplisia diekstrak secara maserasi memakai etanol 70%. Untuk tiap 100 gram serbuk digunakan 700 ml etanol 70%. Maserasi yang digunakan adalah secara remaserasi, yakni dengan menambahkan 100 gram serbuk simplisia dengan 500 ml etanol 70% dalam erlenmeyer, kemudian ditutup dan dibiarkan selama 24 jam terlindung dari cahaya matahari untuk mencegah reaksi yang dikatalisis oleh cahaya atau perubahan warna. Setelah 24 jam sari diserkai, disaring, ampas diperas. Ampas yang diperoleh kemudian ditambah cairan penyari sebanyak 200 ml, diaduk dan diserkai. Bejana ditutup, dibiarkan di tempat sejuk, terlindung dari cahaya, selama 2 hari kemudian endapan dipisahkan. Rendaman

39 20 harus dikocok berulang-ulang (kira-kira 3 x sehari). Setelah 2 hari maserat disaring dengan kertas saring, kemudian ditampung. Maserat yang terkumpul kemudian dipekatkan di atas waterbath dengan suhu o C, dibantu dengan kipas angin sampai kental. 4. Sterilisasi alat dan bahan Untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh organisme, maka alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan terlebih dahulu. Alat-alat tersebut dicuci bersih dan dikeringkan, setelah itu dibungkus dengan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit pada suhu C dan tekanan 2,05 abs bar (Hagman, 2005). 5. Uji sitotoksisitas ekstrak daun sirih pada sel HeLa a. Uji Sitotoksisitas dengan Metode MTT Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 μl ekstrak etanolik daun sirih merah dengan kadar 1000 µg/ml, 1250 µg/ml, 1500 µg/ml, 1750 µg/ml, dan 2000 µg/ml dimasukkan ke dalam 100 μl suspensi sel HeLa dengan kepadatan 2x10 4 /100 μl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate yang berbeda. Sebagai kontrol, 100 µl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5 mm ph 7,2. Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37 o C, dalam inkubator dengan aliran 5% CO 2. Pada akhir inkubasi, ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 10 μl MTT 5 μg/ml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan semalam pada suhu 37 o C, dalam inkubator dengan aliran CO 2 5%. Sel hidup akan bereaksi dengan

40 21 MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 100 μl reagen stopper pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu kamar. Serapan setiap sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Besarnya serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup. b. Uji Sitotosisitas dengan Metode Direct Counting Sel dengan kepadatan 2 x 10 4 sel / 100 μl media diinkubasikan dalam sumuran bersama dengan ekstrak uji sesuai dengan seri kadar yang dibuat yaitu 1000 μg / ml, 1250 μg / ml, 1500 μg / ml, 1750 μg / ml, 2000 μg / ml serta media RPMI 1640 dan sel sebagai kontrol. Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada suhu 37 o C dan dialiri 5% CO2. Pada akhir masa inkubasi, tiap sumuran sel diresuspensi, dimasukkan dalam haemocytometer kemudian dihitung jumlah sel nya dengan metode pewarnaan biru tripan dan dibaca di bawah mikroskop. 6. Analisis Hasil a. Metode Direct Counting Apabila tidak didapatkan hasil dengan metode MTT (data fluktuatif), maka dilakukan perhitungan langsung dengan menggunakan haemocytometer. Jumlah sel hidup yang telah dihitung pada masing-masing kadar ekstrak etanolik daun sirih merah digunakan untuk menentukan presentase kematian dengan rumus % Kematian sel = ( (A-B) / A ) x 100 % Keterangan : A = Jumlah sel hidup pada sumuran kontrol media B =Jumlah sel yang hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan ekstrak etanolik daun sirih merah.

41 22 Dari data % tersebut, dibuat persamaan regresi linear antara log konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah vs harga probit. Dari persamaan regresi tersebut maka harga LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah dapat dihitung.

42 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Pengumpulan dan Penyiapan Bahan Daun sirih merah yang digunakan pada penelitian ini diambil dari tanaman yang tumbuh di daerah Desa Mantenan, Kecamatan Mertoyudan, Kabupaten Magelang, Jawa Tengah, pada bulan September Pengambilan bahan dari satu tanaman dan dalam sekali waktu pemanenan saja untuk menghindari adanya perbedaan kualitas kandungan kimia dalam daun. Dipilih daun yang tidak terlalu muda atau terlalu tua, sehingga diharapkan mempunyai kandungan senyawa aktif yang optimal. Daun yang dikumpulkan dibersihkan dari debu, serangga, serta benda asing yang terbawa saat pengumpulan daun sirih merah. Daun yang sudah bersih kemudian dikeringkan dengan menggunakan oven. Tujuan pengeringan di oven adalah untuk mengurangi kadar air dan menghentikan reaksi enzimatik sehingga dapat mencegah kerusakan sampel. Daun sirih merah yang telah kering kemudian diserbuk dengan menggunakan alat blender. Hal ini bertujuan untuk memperkecil ukuran partikel. Apabila dalam bentuk serbuk, maka luas permukaan partikel daun menjadi lebih besar sehingga dapat mempengaruhi proses ekstraksi. Ukuran serbuk yang optimal akan memberikan hasil ekstraksi yang baik. 23

43 24 B. Ekstraksi Serbuk daun sirih merah seberat 100 gram dimaserasi dengan etanol 70%. Pertimbangan dari penggunaan pelarut etanol karena etanol merupakan pelarut universal sehingga hampir semua kandungan kimia dapat terambil. Penyarian simplisia daun sirih merah menggunakan metode maserasi karena metode ini memiliki beberapa kelebihan dibandingkan dengan metode ekstraksi yang lain. Selain itu metode maserasi tidak menggunakan pemanasan sehingga rusaknya senyawa-senyawa yang tidak tahan panas tinggi dapat dihindari. Metode ini sangat sederhana, mudah dilakukan dan cepat dalam pelaksanaannya. Maserasi dilakukan dalam bejana tertutup agar etanol tidak menguap karena etanol mudah menguap pada suhu kamar. Di samping itu juga untuk mencegah masuknya kontaminan dari luar dan menjaga supaya kedap udara karena ada senyawa-senyawa tertentu yang mudah teroksidasi oleh oksigen dari udara. Bejana maserasi diletakkan di tempat gelap atau dibungkus dengan plastik hitam agar tidak terkena cahaya dan sinar matahari. Hal ini dilakukan untuk mencegah terjadinya reaksi senyawa-senyawa tertentu oleh adanya cahaya dan dan rusaknya senyawa-senyawa aktif oleh ultraviolet matahari. Pada proses maserasi, serbuk daun sirih merah direndam selama 24 jam sambil sesekali diaduk. Perendaman dimaksudkan agar susunan sel sampel akan dapat larut dalam pelarut. Sedangkan pengadukan bertujuan agar pelarut dapat mengalir secara berulang-ulang ke dalam serbuk halus sehingga memungkinkan adanya interaksi antara pelarut dengan serbuk. Pada umumnya larutnya zat aktif

44 25 akan terjadi apabila pelarut menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang berisi zat aktif yang dapat larut dalam pelarut. Zat aktif dapat keluar dari rongga sel karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam dan di luar sel. C. Sterilisasi Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian disterilkan terlebih dahulu untuk menghilangkan adanya pengotor dan mencegah terjadinya kontaminasi oleh mikroorganisme yang akan mengganggu proses penelitian Alat-alat tersebut dicuci bersih, dikeringkan dan dibungkus dengan alumunium foil kemudian disterilisasi dilakukan selama kurang lebih 20 menit dengan suhu C, tekanan 2,05 abs bar, menggunakan alat autoklaf. Prinsip sterilisasi yang digunakan ialah sterilisasi dengan uap bertekanan yaitu dengan menaikkan tekanan hingga suhu tinggi sehingga terbentuk uap air panas. Uap air panas tersebut akan membunuh mikroorganisme dengan menyebabkan terjadinya proses koagulasi dan denaturasi protein pada mikroorganisme. Medium dan pereaksi yang akan digunakan juga disterilkan dengan menggunakan membran filter dengan pori-pori berukuran 0,22 μm. Pengotor dan kontaminan yang kemungkinan ada akan tersaring dan tertahan pada membran filter ini, sehingga medium dan pereaksi benar-benar bebas dari kontaminasi. D. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah Terhadap Sel HeLa Uji sitotoksisitas yang dilakukan pada awalnya adalah dengan menggunakan metode MTT. Prinsip uji sitotoksik dengan metode MTT adalah

45 26 kemampuan sel hidup mereduksi garam MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromide) menjadi kristal formazan. Kemampuan reduksi ini ditunjukkan oleh enzim suksinat dehidrogenase mitokondria pada sel yang viable/sel hidup yang masih melangsungkan proses respirasi. Reaksi reduksi MTT oleh enzim suksinat dehidrogenase ditunjukkan dengan gambar berikut Gambar 1. Reaksi reduksi MTT oleh enzim suksinat dehidrogenase Senyawa MTT yang larut dalam air dan berwarna kuning setelah direduksi oleh suksinat dehidrogenase akan menjadi formazan yang berwarna biru. Intensitas warna yang terbentuk kemudian ditetapkan absorbansinya dengan pembacaan ELISA reader. Absorbansi yang terbaca ini berkorelasi langsung dengan jumlah sel yang hidup. Semakin besar absorbansi berarti semakin banyak sel hidup yang aktif melakukan metabolisme dan sebaliknya, semakin kecil absorbansi yang terbaca menunjukkan semakin sedikit sel yang hidup. Metode ini dipilih dengan pertimbangan bahwa metode ini cukup baik, mudah, cepat, akurat, tidak menggunakan bahan radioaktif, dan sensitif karena mampu menghitung jumlah sel yang sedikit.

46 27 Namun pada penelitian, ternyata ELISA reader tidak mampu membaca dengan tepat intensitas warna ungu formazan yang terbentuk akibat reaksi MTT dengan sel. Hal ini kemungkinan disebabkan karena ekstrak etanolik daun sirih merah yang digunakan sebagai senyawa uji memiliki warna coklat. Warna coklat ini dapat berpengaruh pada nilai absorbansi yang dihasilkan karena dimungkinkan terjadi penambahan intensitas warna sehingga absorbansi yang terbaca dapat menjadi lebih besar daripada nilai yang sebenarnya. Pada penelitian ini dilakukan pengukuran absorbansi dari perlakuan dan kontrol pada masing-masing konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah. Perlakuan adalah sel HeLa dengan perlakuan ekstrak etanolik daun sirih merah. dan kontrol adalah sel HeLa tanpa ada perlakuan. Hasil yang diperoleh antara pembacaan absorbansi dengan ELISA reader ternyata tidak signifikan dengan hasil gambar sel. ELISA reader memberikan absorbansi yang rendah namun pada foto terlihat bahwa sel HeLa pada semua seri konsentrasi justru masih hidup. Padahal seharusnya apabila sel banyak yang hidup maka absorbansi yang diberikannya adalah tinggi. Metode uji sitotoksisitas lain dapat dilakukan untuk mengatasi ekstrak etanolik daun sirih merah yang berwarna coklat ini seperti metode Tripan Blue yang tidak dipengaruhi oleh warna dari ekstrak Pada metode ini, penghitungan dilakukan secara manual terhadap sel hidup setelah sebelumnya sel diwarnai dengan reagen Tripan Blue. Sel yang mati akan menyerap reagen sehingga warnanya lebih gelap daripada sel hidup dan ekstrak yang berwarna tidak akan terlalu berpengaruh pada penghitungan sel.

47 28 Nilai absorbansi hasil uji sitotoksisitas dengan metode MTT pada inkubasi selama 24 jam dapat dilihat pada tabel berikut: Tabel I. Tabel Nilai Absorbansi Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah pada Berbagai Konsentrasi dengan Metode MTT Replikasi Konsentrasi I II III (µg/ml) Absorbansi Absorbansi Absorbansi Kontrol 1,394 1,293 1, ,798 0,875 0, ,679 0,679 0, ,734 0,731 0, ,778 0,727 0, ,119 1,037 0, ,973 0,921 0, ,329 1,367 1, ,655 1,674 1, ,496 1,530 1,440 Dari hasil uji sitotoksisitas dengan metode MTT didapatkan data absorbansi sampel yang lebih besar daripada absorbansi kontrol, dimana seharusnya absorbansi sampel lebih kecil daripada absorbansi kontrol. Hal itu disebabkan karena ekstrak etanolik daun sirih merah yang digunakan berwarna sehingga juga memberikan absorbansi dan menyebabkan absorbansi sampel meningkat. Oleh karena itu,maka selanjutnya uji sitotoksisitas dilakukan dengan menggunakan metode penghitungan langsung (direct counting) Metode yang digunakan untuk menguji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah adalah metode penghitungan langsung (direct counting). Pada prinsipnya, sel yang masih hidup setelah pemaparan dengan senyawa uji dihitung secara langsung menggunakan mikroskop dengan bantuan haemocytometer. Untuk membedakan sel yang hidup dan mati digunakan Tripan blue sebagai pewarna. Sel yang mati akan berwarna biru tua karena menyerap Tripan blue

48 29 sedangkan sel yang hidup tetap bening dan bercahaya. Hal ini terjadi karena sel yang mati kehilangan integritas membrannya sehingga Tripan blue dapat masuk ke dalam sel dan berikatan dengan protein-protein sel. Sel yang hidup tampak bulat,bening dan bercahaya karena membran sel masih utuh sehingga Tripan blue tidak dapat berikatan dengan protein-protein sel. Sel yang masih hidup tampak bercahaya karena sitoplasmanya masih utuh. Kelemahan dari metode penghitungan langsung adalah subyektivitasnya yang tinggi dan membutuhkan waktu penghitungan yang lama. Untuk mengurangi subyektivitas, penghitungan diulang minimal 3 kali dan pengamatan bentuk sel yang hidup dan mati harus konsisten. Pemaparan sel dengan Tripan blue yang terlalu lama dapat menyebabkan sel yang hidup juga menyerap Tripan blue dan lama kelamaan sel dapat mati karena Tripan blue. Untuk mengatasi hal ini maka penambahan Tripan blue ke dalam sumuran tidak dilakukan secara serempak namun satu persatu tiap sumuran ditambah Tripan blue, dihomogenkan kemudian langsung dibaca. Media yang digunakan banyak mengandung protein dimana dimana protein-protein serum dalm media juga memiliki afinitas terhadap Tripan blue. Hal ini juga dapat mempengaruhi pengamatan karena akan mempengaruhi bidang pandang, yaitu saat pengamatan akan terlihat gelap dan kotor sehingga menyulitkan pengamatan sel hidup. Penghitungan secara langsung membutuhkan waktu yang cukup lama. Hal ini dapat berpengaruh pda stabilitas sel karena sel berada di suhu penyimpanan dengan suhu dan aliran CO2 yang berbeda.

49 30 E. Analisis Hasil Data yang diperoleh dari uji sitotoksisitas dengan metode direct counting ini berupa data jumlah sel yang hidup dari tiap perlakuan dengan pemberian ekstrak etanolik daun sirih merah dengan berbagai konsentrasi. Dari data jumlah sel yang hidup tersebut ditentukan persentase kematian sel. Berikut ini adalah Persentase Jumlah Sel HeLa yang mati pada berbagai konsentrasi Tabel II. Tabel Persentase Jumlah Sel Yang Mati Pada Berbagai Konsentrasi Konsentrasi Rata rata % kematian Ekstrak etanolik daun sirih merah Replikasi % Kematian Sel HeLa (μg/ml) 1 88, ,68 88, , ,36 77, , , ,20 63, , , , , , , , ,20 54,71 46,22