ABSTRAK

Transkripsi

1 UJI AKTIVITAS BIOLOGI SECARA BSLT DAN UJI SITOTOKSIK DENGAN METODE MTT DARI EKSTRAK n-heksana DAN EKSTRAK METANOL DAUN KELADI TIKUS (Typhonium divaricatum (L) Decne) Yunahara Farida 1, Titiek Martati 1, Bernard Edward 1 1 Fakultas Farmasi Universitas Pancasila, Jagakarsa Jakarta yunahara_farida@yahoo.com ABSTRAK Tanaman keladi tikus (Typhonium divaricatum (L) Decne), familia Araceae. merupakan jenis tanaman liar yang belum banyak dikenal oleh masyarakat. Beberapa hasil penelitian menyebutkan bahwa ekstraknya telah dibuktikan dapat menyembuhkan beberapa kasus penyakit antara lain kanker. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak n-heksana dan metanol dari daun keladi tikus mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara T-47D. Penelitian yang dilakukan meliputi penapisan fitokimia, uji aktivitas biologi secara Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dan uji aktivitas sitotoksik dengan metode MTT. Hasil penapisan fitokimia terhadap serbuk dan ekstrak daun menunjukkan adanya flavonoid dan steroid/triterpenoid. Hasil penelitian uji aktivitas biologi secara BSLT menunjukkan bahwa ekstrak metanol yang paling aktif dengan nilai IC 50 = 32,91 µg/ml sedangkan n-heksana =126,21 µg/ml. Hasil uji aktivitas sitotoksik secara MTT, ekstrak n-heksana memiliki aktivitas terhadap sel kanker payudara T-47D yang lebih tinggi dibandingkan ekstrak metanol.dengan nilai IC 50 = 32,50 µg/ml dan ekstrak metanol = 345,40 µg/ml. Apabila dibandingkan dengan cisplatin (IC 50 3,07 µg/ml) maka aktivitas sitotoksik cisplatin terhadap sel kanker payudara T-47 D masih jauh lebih tinggi. Kata kunci: Keladi tikus, Typhonium divaricatum (L) Decne), BSLT, sel kanker payudara T-47 D, MTT. PENDAHULUAN Saat ini pemanfaatan tumbuhan obat untuk mengobati berbagai jenis penyakit semakin disukai masyarakat karena jarang menimbulkan efek samping yang tidak diinginkan, salah satunya adalah untuk terapi kanker. Penyakit kanker dikenal sebagai penyakit yang sukar disembuhkan dan dapat menyebabkan kematian, sehingga hal mi merupakan masalah yang sulit dalam bidang pengobatan. Walaupun telah cukup banyak ditemukan obat kemoterapi untuk terapi kanker. namun hasilnya belum memuaskan, disamping kurang selektif dalam penggunaan obat yang ada, juga ditemukan efek samping yang cukup besar dan obat tersebut. Akibatnya mendorong masyarakat banyak melakukan pengobatan dengan menggunakan bahan alam atau obat tradisional. salah satunya adalah tanaman keladi tikus (Typhonium divaricatum (L) Decne). Tanaman keladi tikus (Typhonium divaricatum (L) Decne), familia Araceae. merupakan salah satu jenis tanaman liar

2 yang belum banyak dikenal oleh masyarakat. Secara empiris, masyarakat Indonesia menggunakannya untuk mengobati penyakit kanker/tumor. Beberapa hasil penelitian menyebutkan bahwa ekstraknya telah dibuktikan dapat menyembuhkan beberapa kasus penyakit antara lain kanker. Selain itu ekstrak etanol dan kloroform dan daun dan umbi keladi tikus ternyata mempunvai aktivitas penghambatan pertumbuhan sel lestari tumor. Mengingat potensi tanaman obat asli Indonesia yang cukup besar maka penelitian terhddap tanaman keladi tikus (Typhonium divaricatum (L) Decne) perlu dikembangkan dengan cara melakukan ekstraksi dan diuji toksisitas, dan aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara. BAHAN DAN METODE BAHAN. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun keladi tikus yang diperoleh dari Balittro, Bogor dan dideterminasi di Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi, LIPI, Bogor. Bahan kimia: n-heksana, metanol, HCl, amil alkohol, eter, asam asetat anhidrat, H 2 SO 4, telur Artemia salina Leach, garam tanpa iodium, DMSO, Sel kanker payudara T-47D, cisplatin, RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, FBS (Fetal Bovine Serum), penisilin-streptomisin, MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5diphenyl-tetrazolium bromide), PBS (Phosphat Bufferd Salina), SDS (Sodium Dodesil Sulfat), biru tripan, tripsin, air suling steril, etanol. Rotary evaporator, Orbital shaker, tempat penetasan telur artemia, Lampu TL, Labu kultur jaringan 25 ml, pelat kultur jaringan 96 sumuran, LAF cabinet (Laminar Air Flow Biological Safety Cabinet), inkubator sel dengan aliran CO 2 5%, tangki nitrogen cair, alat sentrifuge, mikropipet (Eppendorf), timbangan analitik, mikroskop, hemositometer, ELISA plate reader, alat-alat gelas. METODE. Daun keladi tikus dibuat serbuk, kemudian di maserasi menggunakan metanol dan di partisi menggunakan n-heksana sehingga di dapat ekstrak n-heksana. Sisa hasil partisi diuapkan dan didapatkan ekstrak metanol. Penapisan fitokimia dilakukan dengan cara mengidentifikasi senyawa kimia yang terdapat dalam serbuk dan ekstrak. Pengujian aktivitas biologi secara BSLT (Brine Shrimp Lethality Test). Terhadap ekstrak n-heksana dan metanol dilakukan uji toksisitas berdasarkan metode Meyer et.al. (1982) menggunakan telur Artemia salina Leach. Mula-mula telur Artemia salina ditetaskan didalam air laut buatan (38 g garam tanpa iodium dalam 1000 ml air biasa) di bawah lampu TL 18 watt. Media penetasan telur diberi aerasi udara. Setelah 48 jam larva menetas menjadi nauplii dan siap untuk digunakan. Nauplii dimasukkan ke dalam vial yang berisi larutan ekstrak sampel dengan konsentrasi 10,100 dan 1000 bpj dengan 3 kali ulangan. Semua vial di inkubasi pada suhu kamar selama 24 jam di bawah penerangan lampu TL 18 watt. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan melihat jumlah Artemia salina yang mati pada setiap konsentrasi. Penentuan harga LC 50 dalam µg/ml dilakukan menggunakan analisis probit. Hasil uji lethalitas LC 50 selanjutnya digunakan sebagai dasar penentuan konsentrasi untuk pengujian terhadap sel kanker payudara T-47D. Pengujian aktivitas sitotoksik. Pembuatan larutan uji. bahan uji ditimbang sebanyak 10 mg, kemudian dilarutkan dalam 20 µl DMSO dan 80 µl medium RPMI 1640 sehingga diperoleh konsentrasi larutan induk bpj. Dari larutan induk diencerkan hingga diperoleh

3 satu seri konsentrasi 10, 25, 50, 100, 250 dan 500 bpj. Pembuatan larutan kontrol positif. Larutan induk cisplatin ditimbang sebanyak 10 mg, kemudian dilarutkan dalam 20mL medium RPMI 1640 sehingga diperoleh konsentrasi larutan induk 500 bpj. Dari larutan tersebut diencerkan hingga diperoleh satu seri konsentrasi 3, 6, 9, 12, 15 dan 18 bpj, sedangkan kontrol negatif adalah medium RPMI Pembuatan media kultur. media kultur yang digunakan adalah medium RPMI cair untuk sel T-47D yang ditambahkan 10% FBS dan antibiotik penisilin-streptomisin 0,1%. Medium disterilkan secara filtrasi dan disimpan pada suhu C. Pencairan sel kanker (cell thawing). Tabung berisi sel dikeluarkan dari tangki nitrogen cair dan dibenamkan dalam pemanas air bersuhu 37 0 C selama 3 menit. Seluruh cairan sel dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi dan ditambahkan 5 ml medium RPMI 1640 lalu disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 3-5 menit. setelah itu supernatant dibuang dan pelet yang diperoleh disuspensikan dalam 6 ml yang mengandung 20% FBS. suspensi sel dipipet dan dimasukkan kedalam labu kultur lalu diinkubasi pada suhu 37 0 C dalam inkubator sel 5% CO 2 sampai 80% di inkubasi selama 3 hari yaitu sampai sel tumbuh di hampir seluruh permukaan labu kultur. Sub kultur. Labu kultur berisi sel yang telah diinkubasi selama 3 hari dikeluarkan dari inkubator sel. Seluruh medium dalam labu kultur dipipet dan dibuang, kultur sel dicuci sebanyak 2 kali, dengan 5 ml PBS. Ke dalam labu kultur ditambahkan 2 ml tripsin, kemudian sel didiamkan selama 5 menit dalam inkubator, Ditambahkan 3 ml RPMI 1640 yang mengandung 10% FBS, cairan sel dipipet dan dipindahkan ke dalam tabung sentrifugasi lalu disentrifugasi pada kecepatan 1000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet yang diperoleh disuspensikan dalam 12 ml RPMI 1640 yang mengandung 10% FBS. Suspensi sel dibagi menjadi dua bagian, masing-masing dipipet sebanyak 6 ml dan dimasukkan ke dalam 2 buah labu kultur baru kemudian diinkubasi pada 37 0 C dalam inkubator sel. Sel diperiksa setiap hari dibawah mikroskop untuk memeriksa kemungkinan pencemaran oleh jamur atau bakteri. Apabila medium kultur telah berubah warna maka diganti dengan medium RPMI yang mengandung serum baru. Perhitungan kepadatan sel T-47D. Kultur yang telah diinkubasi selama 3 hari diamati dengan mikroskop untuk mengetahui tingkat kepadatannya. Jika tumbuh baik maka sel dapat digunakan dan jika tidak maka sel harus diinkubasi kembali hingga kepadatannya optimal. Medium dalam labu kultur dipipet dan dibuang, kultur sel dicuci sebanyak 2 kali, masing-masing dengan 5 ml PBS. Ke dalam labu kultur ditambahkan 2 ml tripsin dan sel didiamkan selama 5 menit dalam inkubator, kemudian dikeluarkan dari inkubator dan dilihat dibawah mikroskop untuk memastikan sel sudah tidak melekat pada dasar labu. Ditambahkan 1 ml RPMI, dipipet cairan sel dan dipindahkan ke dalam tabung sentrifugasi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet yang diperoleh disuspensikan dalam 1 ml RPMI. Suspensi dipipet sebanyak 10 µl dan ditambahkan 90 µl biru tripan 0,4%. Kepadatan sel dihitung menggunakan hemositometer yaitu lebih kurang 20 µl dari suspensi sel dalam larutan biru tripan dipipet lalu ujung pipet disentuhkan dengan sudut 30 0 pada permukaan hemositometer dibiarkan terisi perlahan

4 dengan daya kapilaritas. Kepadatan sel dihitung dari jumlah sel rata-rata dalam keempat bidang besar dikalikan faktor pengenceran dan dibagi dengan volume satu bidang besar Kepadatan sel atau jumlah sel per ml = n/4 x 2 x 10 4 n = jumlah rata-rata sel dalam keempat bidang besar Penyiapan kultur kanker (T-47D). Setelah kepadatan sel diketahui, sisa suspensi sel yang tidak digunakan dalam perhitungan kepadatan sel, yaitu sebanyak 990 µl digunakan untuk pengujian sitotoksisitas dan diencerkan dengan medium RPMI 1640 yang mengandung 10% FBS dengan perhitungan sebagai berikut : P 1 V 1 = P 2 V 2 P 1 adalah kepadatan hasil penghitungan, V 1 adalah volume suspensi sel yang dibutuhkan untuk pengenceran, P 2 adalah kepadatan sel yang dikehendaki dalam sumur uji dan V 2 adalah total suspensi sel yang akan diisikan kedalam sumur uji. Pengujian sitotoksisitas ekstrak terhadap sel T-47D. Kedalam pelat kultur jaringan 96 sumuran dimasukkan suspensi sel sebanyak 100 µl kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator sel pada suhu 37 0 C. Setelah 24 jam, ke dalam masing-masing sumur ditambahkan 100 µl masing-masing ekstrak dengan berbagai konsentrasi untuk kontrol negatif ditambah 100 µl medium kultur sel RPMI Kemudian pelat kultur jaringan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0 C dalam inkubator sel. Pada akhir periode inkubasi, ke dalam setiap sumur ditambahkan 100 µl MTT (50mg MTT dalam 10ml PBS steril), kemudian diinkubasi kembali dalam inkubator CO 2 selama 4 jam pada 37 0 C. Kemudian ditambahkan 100 µl SDS dicampur secara merata, kemudian isi tiap-tiap sumur dan ukur serapannya menggunakan ELISA plate reader pada 570 nm. Perhitungan persentase kematian sel. Untuk mengetahui berapa besar persentase penghambatan proliferasi sel T-47D, dihitung menggunakan rumus berikut : Serapan perlakuan Persen Proliferasi Sel = x 100% Serapan kontrol Persen penghambatan prolifersi = 100 persen proliferasi sel Data persentase penghambatan proliferasi sel diolah menggunakan analisis regresi linier untuk mendapatkan nilai IC 50. Suatu ekstrak dinyatakan aktif atau memiliki potensi sebagai anti kanker bila nilai IC µg/ml. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil penapisan fitokimia menunjukkan bahwa serbuk dan ekstrak metanol mengandung flavonoid dan steroid/ triterpenoid sedangkan ekstrak n-heksana mengandung steroid/ triterpenoid. Golongan senyawa ini berpotensi mempunyai aktivitas farmakologi. Oleh karena itu dilanjutkan dengan uji toksisitas secara BSLT sebagai uji pendahuluan. Hasil uji toksisitas secara BSLT menunjukkan bahwa ekstrak metanol 1 (hasil maserasi) memberikan nilai LC 50 32,91 µg/ml dan ekstrak metanol 2 (hasil partisi) 38,91 µg/ml sedangkan n-heksana 126,21 µg/ml (Tabel 1). Berdasarkan Tabel 1, suatu senyawa termasuk dalam kategori sangat aktif apabila memiliki nilai LC 50 < 30 bpj (McLaughlin & Roger, 1998). suatu tanaman dikatakan toksik apabila nilai LC 50 -nya lebih kecil dari 1000 bpj

5 (Meyer, 1982). Dari hasil uji menunjukkan bahwa ekstrak daun keladi tikus berpotensi sebagai anti tumor atau anti kanker. metanol dalam uji BSLT ternyata lebih aktif dibandingkan dengan ekstrak n- heksana. Tabel 1.Hasil uji toksisitas dari ekstrak n- heksana dan ekstrak metanol secara BSLT Sampel Log konsent % kematian Probit LC50 (µg/ml) metanol 1 3,003 2,003 96,66 60,0 6,88 5,25 32,91 n-heksana metanol 2 1,003 3,002 2,002 1,002 3,004 2,004 1,004 33,33 93,33 33,33 6,66 96,66 50,00 33,33 4,56 6,48 4,56 3,52 6,88 5,00 4,56 126,21 38,91 Hasil pengamatan terhadap aktivitas sel kanker payudara T-47D adalah dengan melihat aktivitas ekstrak n-heksana maupun metanol terhadap sel kanker T- 47 D diperlihatkan dengan nilai IC 50, dimana penetapan nilai IC 50 dilakukan menggunakan regresi linier. Dari data nilai IC 50 (Tabel 2) terlihat bahwa ekstrak n- heksana menunjukkan aktivitas penghambatan proliferasi galur sel kanker payudara T-47D lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak metanol. Grafik hubungan antara konsentrasi dan penghambatan proliferasi dapat dilihat pada Gambar 1. Tabel 2. Aktivitas inhibisi ekstrak daun keladi tikus terhadap strain sel T-47D Sampel b a y x IC 50 (µg/ml) metanol 1 1,0753 2, , ,06 n-heksana 0,909 3, , ,50 metanol 2 3,0396-2, , ,40 Penghambatan Proliferasi (%) Konsentrasi (ug/ml) metanol 1 n-heksana metanol 2 Gambar 1. Grafik huungan antara konsentrasi (µg/ml) dan penghambatan proliferasi (%) dari ekstrak metanol dan ekstrak n-heksana KESIMPULAN Dari penapisan fitokimia menunjukkan di dalam serbuk dan ekstrak daun keladi tikus mengandung flavonoid dan steroid triterpenoid. metanol dan n- heksana daun keladi tikus memiliki toksisitas terhadap larva udang Artemia salina Leach. Dari hasil uji sitotoksik, ekstrak n-heksana memiliki aktivitas terhadap sel kanker payudara T-47D yang lebih tinggi dibandingkan ekstrak metanol dengan nilai IC 50 32,50 µg/ml. Ucapan Terima kasih Terima kasih kepada DP2M, Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Depdiknas, yang telah mendanai penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA 1. McLaughlin, J.L.and Rogers, L.L. The use of biological assay to evaluate botanicals.drug Information Journal, 1998, 32: Meyer BN. Brine shrimp: a convinient general bioassay for active plant constituent. Planta Medica , 45: 31-4 cisplatin 0,9467 4, ,4874 3,07

6 3. Aryanti. Isolasi senyawa anti kanker dari tanaman keladi tikus (Typhonium divaricatum (L). Decne). Jurnal Bahan Alam Indonesia 2002;1(1): Zheng G.Q. Cytotxic terpenoid and flavonoids Artemisia annua. Planta Medica (1994) 60: Kamuhabwa,A, Nshima, C. & de Witte, P. Cytotoxicity of some medicinal plant extracts used in Tanzanian traditional medicine. J.Ethnopharmacol : Wilson, AP. Cytotoxicity and viability assays. In: Masters JRW, Editor. Animal cell culture: A Parctical Approach. 3 rd ed. Oxford University Press, New York. 2000, 263-4; MTT cell proliferation assay instruction catalog number k, ATCC[serial online] 2001; diambil dari http// 8. McLaughlin, JL, Anderson JE. A blind comparation of single benzsch-top bioassay and human tumor cell. Cytotoxicities studies as Anti tumor prescreens. Phytochemical Analysis. Volume 2; Sugianto. Aktivitas antikarsinogenik senyawa yang berasal dari tumbuhan. Majalah Farmasi Indonesia 2003;14(3): Harborne JB. Metode Fitokimia. Penuntun cara modern menganalisis tumbuhan. Terbitan kedua. Terjemahan Padmawinata K, Soediro I. Bandung: ITB; hal Orech, et.al. Potential toxicity of some traditional lefy vegetables consumed in nyah oma division, western Kenya. African Journal of Food and Nutritional Sciences: 2005, Volume 5 No Tri Dewi, Yuliyanah. Uji aktivitas penghambatan pertumbuhan sel lestari tumor dari ekstrak etanol keladi tikus (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Bl.) secara in vitro Krishnaraju, A.V. et.al. Assestment of bioactivity of Inddian medicinal plants using brine shrimps (Artemia salina) lethality assay, International Journal of Applied Science and Engineering, ,2: Ayo, R.G, Audu, O.T, and Amupitan, J.O, Physico-chemical characterization and cytotoxicity studies of seed extracts Khaya senegalensis (Desr.) AJuss. African Journal of Biotechnology, 2007, Vol. 6 (7), pp Krishnaraju, A.V. et.al. Biological Screening of Medicinal Plants Collected from Eastern Ghats of India Using Artemia salina(brine Shrimp Test), Int. J. Appl. Sci. Eng., , 2: Choo, C.Y., Chan, K.L., Tayeka,K., Itokawa, H., Cytotoxic Activity of Typhonium flagelliforme (Araceae). Phytother.Rea.2001;15(3): Sugianto. Aktivitas antikarsinogenik senyawa yang berasal dari tumbuhan. Majalah Farmasi Indonesia, 2003;14(3):132.