LABORATORIUM ANALISIS KLINIK PETUNJUK PRAKTIKUM ANALISIS KLINIK BAGIAN KIMIA FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS GADJAH MADA

Transkripsi

1 LABORATORIUM ANALISIS KLINIK PETUNJUK PRAKTIKUM ANALISIS KLINIK BAGIAN KIMIA FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS GADJAH MADA 2010

2 KATA PENGANTAR Puji syukur dipanjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, atas tersusunnya Petunjuk Praktikum Analisis Klinik B yang ditujukan untuk membantu mahasiswa semester IV Program Studi Farmasi Klinik dan Komunitas, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Mata praktikum Analisis Klinik B ini bertujuan untuk mengajarkan kepada mahasiswa bagaimana memilih dan menggunakan/menerapkan metode yang tepat untuk menetapkan kadar senyawaseyawa endogen dalam tubuh yang memiliki makna klinik (berkaitan dengan penyakit tertentu). Petunjuk ini hanya memuat cara singkat bagaimana melakukan analisis beberapa parameter klinik, sedangkan untuk melengkapi pemahaman metode analisis tersebut mahasiswa diwajibkan membaca literatur aslinya yang tertera pada daftar pustaka buku ini. Aplikasi secara klinik dapat diperkaya melalui referensi lain yang terkait. Buku petunjuk ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu, kritik dan saran demi menyempurnakan buku ini di masa mendatang sangat diharapkan. Semoga buku petunjuk yang sangat sederhana ini dapat berguna bagi yang memerlukannya. Yogyakarta, 2010 Pengampu Praktikum Analisis Klinik B: Dr. Edy Meiyanto, M.Si., Apt. (koordinator) Prof. Dr. Sudibyo Martono, MS., Apt Dr. Ediati, SE, Apt. Dr. Arif Nurrochmad, M.Sc., Apt Dr. Tatang Irianti, M.Sc., Apt Arief Rahman Hakim, M.Si., Apt. Muthi' Ikawati, MSc., Apt. Adam Hermawan, M.Sc., Apt 1

3 DAFTAR ISI Hal KATA PENGANTAR... 1 DAFTAR ISI. 2 PENDAHULUAN. 3 I. II. PREPARASI SAMPEL.. PENETAPAN KADAR KREATININ ( sample: plasma dan urin) (Metode: Jaffe/modifikasi, tanpa deproteinisasi) III. PENETAPAN KADAR KOLESTEROL TOTAL (sample: plasma) (Metode : Liebermann Burchard) 10 IV. PENETAPAN KADAR KARBOHIDRAT TOTAL (sample: plasma) (Metode: Anilin). 12 V. PENETAPAN KADAR UREA NITROGEN (sample: urin) (Metode: Berthelot).. 14 VI. PENETAPAN KADAR PROTEIN TOTAL (sample: urin) (Metode: Spektrofotometri dan Biuret).. 18 DAFTAR PUSTAKA 22 2

4 PENDAHULUAN A. DESKRIPSI DAN TUJUAN Praktikum Analisis Klinik B mengajarkan kepada mahasiswa bagaimana memilih dan menggunakan/merapkan metode yang tepat untuk menetapkan kadar senyawa-seyawa endogen dalam tubuh yang memiliki makna klinik (berkaitan dengan penyakit tertentu). Praktikum ini bertujuan memperkenalkan berbagai metode penetapan kadar senyawa endogen dalam tubuh dengan metode enzimatik dan kimiawi untuk penetapan karbohidrat, lipid, protein, urea dan kreatinin. Setelah mengikuti praktikum Analisis Klinik B diharapkan mahasiswa dapat memahami dan mempraktikkan cara-cara penetapan senyawa-senyawa endogen dan mampu mengkaitkan arti senyawa-senyawa tersebut dengan berbagai penyakit. Adapun tujuan pembelajaran khusus setelah mengikuti praktikum ini mahasiswa diharapkan mampu : 1. menjelaskan cara-cara menetapkankadar senyawa endogen dalam tubuh 2. menjelaskan reaksi-reaksi kimia yang terjadi selama praktikum mata acara yang bersangkutan 3. memilih metode yang tepat untuk meneapkan senyawa endogen tertentu 4. menjelaskan arti pentingnya praktikum Analisis Klinik B 5. membekali diri untuk pada waktunya bekerja di laboratorium klinik. B. PELAKSANAAN PEMBELAJARAN 1. Jadual Kegiatan Dua Mingguan (praktikum 2 minggu sekali) Prakt. ke- Topik Prakt. Substansi senyawa dalam Plasma darah Urin Metode penetapan Fasilitas I Preparasi sampel Penetapan kadar kreatinin Spektrofotometri Buku Petunjuk, Pustaka II Penetapan kadar karbohidrat Plasma darah Spektrofotometri Buku Petunjuk, Pustaka III Penetapan kadar kolesterol Plasma darah Spektrofotometri Buku Petunjuk, Pustaka IV Penetapan kadar urea Urin Spektrofotometri Buku Petunjuk, nitrogen Pustaka V Penetapan kadar protein Urin Spektrofotometri Buku Petunjuk, Pustaka VI Responsi Semua materi Ujian tertulis Soal-soal ujian praktikum praktikum 3

5 2. Metode Pembelajaran dan Bentuk Kegiatan Kegiatan setiap acara praktikum di laboratorium dimulai dengan test singkat materi yang akan dipraktikkan (pretest), kemudian mahasiswa melaksanakan acara praktikum dengan dibimbing asisten dan dosen. Setelah selesai melaksanakan praktikum, mahasiswa diwajibkan membuat laporan praktikum (laporan sementara perkelompok) yang memuat data-data praktikum dan perhitungan kadar. Setelah didiskusikan dalam satu golongan, laporan akhir pergolongan dikumpulkan pada akhir praktikum dalam bentuk softcopy. Diskusi lebih lanjut dilakukan secara on-line melalui situs dan terbuka untuk mahasiswa golongan yang bersangkutan dalam rentang waktu 2 x 24 jam setelah praktikum. Mahasiswa diwajibkan aktif dalam forum diskusi tersebut yang akan selalu dipantau dan dibimbing oleh asisten dan dosen pengampu. Catatan : selama pelaksanaan praktikum, mahasiswa wajib mentaati segala peraturan dan menjaga ketertiban. Mahasiswa yang terlambat > 15 menit dan atau pretest telah selesai dilaksanakan tidak diperkenankan mengikuti praktikum dan wajib melapor pada koordinator praktikum. C. EVALUASI PEMBELAJARAN Aspek penilaian meliputi : 1. Tes pendahuluan 15% 2. Kinerja praktikum 50%(termasuk kinerja di laboratorium (15), laporan (5), serta keaktifan diskusi di laboratorium maupun on-line (25)) 3. Responsi 40% Nilai akhir ditentukan sebagai berikut: A jika nilai B < C < D < 50 E 40 4

6 PREPARASI SAMPEL Sampel darah Preparasi sampel merupakan hal paling penting dalam suatu analisis klinik karena membutuhkan waktu paling lama diantara langkah yang lain. Lebih jauh lagi tidak jarang banyak kesalahan terjadi dalam proses preparasi sampel. Preparasi sampel yang salah dapat menyebabkan kesalahan dalam interpretasi data klinik yang diperoleh. Maka dari itu setiap langkah dalam preparasi urin harus benar-benar diperhatikan. Sampel yang digunakan dalam analisis klinik dapat berasal dari darah maupun urin. Untuk darah dapat dipilih whole blood, serum, ataupun plasma, tergantung dari data yang diinginkan. Secara umum langkah-langkah dalam preparasi sampel terdiri dari : A. Preparasi Pasien dan Koleksi Sampel (Phlebotomy) Sebelum dilakukan koleksi sampel tentunya dilakukan identifikasi pasien. Dalam proses identifikasi ini pasien dicatat nama lengkap, tanggal pengambilan sampel, serta volume sampel yang diperoleh. Hal ini dilakukan untuk mencegah terjadinya kesalahan pelabelan yang dapat berakibat pada kesalahan data. Kemudian data ini ditempelkan pada tabung (tube) untuk koleksi sampel. Setelah itu pasien diberitahukan tentang prosedur pengambilan sampel dan sebaiknya pasien berada dalam keadaan yang nyaman, terutama untuk koleksi sampel darah. Koleksi sampel darah dapat berasal dari kapiler maupun vena. Untuk koleksi darah arteri sangat jarang digunakan kecuali pada kasus khusus seperti pada analisis gas yang terkandung dalam darah. Darah kapiler biasanya diperoleh dari ujung jari dan volumenya sangat kecil sehingga jarang digunakan untuk analisis rutin. Sebelum dilakukan pengambilan ujung jari dibersihkan dengan alkohol 70% atau dengan air hangat. Kemudian oleskan krim hidrofobik untuk menjaga sterilitas daerah yang akan diambil darahnya. Ambil darah dengan menggunakan lancet. Darah akan keluar dengan spontan, kumpulkan dalam tube dan tutup tempat keluarnya darah dengan plester steril. Koleksi sampel darah vena tidak jauh berbeda dengan koleksi darah kapiler. Darah vena biasanya diambil dari lengan karena vena di sini mudah untuk dideteksi. Dalam koleksi sampel darah dari vena, biasanya digunakan tube tertentu tergantung dari kebutuhan analisis. Urin merupakan sampel yang paling mudah didapatkan dalam proses klinik. Sampel urin dapat digunakan untuk mengetahui status fungsi ginjal, kelainan pada saluran kemih, dan kemungkinan dapat memberikan petanda adanya keabnormalan sistemik. Urin dikoleksi dalam 5

7 wadah bersih bebas bahan kimia, tidak steril, dan segera dibawa ke laboratorium dalam waktu tak kurang dari 30 menit. Bila tidak segera dianalisis, dapat disimpan dalam refregerator, dan dianalisis dalam waktu tidak lebih 8 jam kemudian. Biasanya sampel urin perlu diberi preservasi untuk menjaga integritas kandungan analit. Dalam proses koleksi sampel ini biasanya terdapat kesalahan kesalahan seperti : Pelabelan salah atau tidak lengkap Jumlah tidak mencukupi untuk analisis Kesalahan dalam memilih tabung Instruksi pada pasien tidak tepat atau kurang lenkap Tutup tidak rapat sehingga menyebabkan tumpah atau terkontaminasi Gagal dalam memisahkan serum dari sel darah merah dalam waktu 60 menit Penjendalan darah tidak berhasil dengan baik Terjadi hemolisis Terjadi lipemia : kekeruhan pada serum yang disebabkan oleh diet. B. Pemrosesan Sampel Setelah dilakukan pengumpulan sampel maka sampel dapat diproses lebih lanjut. Sampel darah biasanya digunakan serum atau plasma, meskipun sebenarnya tidak ada perbedaan yang signifikan pada interpretasi data klinik dalam penggunaan serum maupun plasma. Serum sering digunakan dalam analisis kimia, sedangkan plasma biasa digunakan untuk analisis amonia, studi koagulasi, dan analisis beberapa trace elements. Sampel plasma sering digunakan sebagai ganti serum bila proses penjendalan dirasa lama, namun penggunaan sampel plasma memiliki kelemahan yaitu bila terjadi interaksi antara antikoagulan dengan analit yang akan diperiksa atau reagen pada proses analisis. 1. Preparasi Plasma dari Whole Blood Langkah langkah yang dilakukan adalah : a. Darah diambil dari vena lengan menggunakan spuit steril dan bantuan tourniquet. Bersihkan bagian yang disampling dengan menggunakan kapas beralkohol, tutup dengan plester. b. Koleksi darah ke dalam tabung (tube) yang mengandung antikoagulan (EDTA, heparin) sebanyak 3 ml. c. Tube dibolak-balik 3-5 kali d. Ambil 1 ml darah pindahkan ke Eppendorf e. Sentrifuge pada suhu 4 o C pada 1300 rpm selama 10 menit 6

8 f. Ambil supernatan 250 μl g. Simpan pada suhu C sampai akan digunakan. 2. Preparasi Serum dari Whole Blood Langkah langkah yang dilakukan adalah : a. Darah diambil dari vena lengan menggunakan spuit steril dan bantuan tourniquet. Bersihkan bagian yang disampling dengan menggunakan kapas beralkohol, tutup dengan plester. b. Koleksi darah dalam tabung yang tidak mengandung antikoagulan sebanyak 3 ml c. Disarankan dalam koleksi darah menggunakan tabung serum separator d. Tabung digoyang balik 5 kali e. Diamkan selama menit sampai terjadi penjendalan di bagian atas atau dibiarkan semalaman pada suhu 4 o C f. Sentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit g. Serum ditempatkan dalam wadah plastik bebas antikoagulan maupun preservatif. Sampel yang diperoleh dapat segera dianalisis untuk berbagai keperluan klinik. Daftar Pustaka Rai et al., 2005, Plasma Preparation From Whole Blood, Proteomics, 5: Richterich, R and Colombo, J. P., 1981, Clinical Chemistry, John Wiley & Sons, USA. 7

9 PENETAPAN KADAR KREATININ (Sampel: plasma dan urin) (Metode: Jaffe/modifikasi, tanpa deproteinisasi) Prinsip: Metode ini sederhana, untuk penentuan kreatinin dengan bantuan larutan pikrat-basa, tanpa deproteinisasi. Pereaksi: a. Larutan bufer = 6,26 g NaOH dan 0,89 g Na 2 HPO 4 dalam akuades ad ml. b. Asam pikrat = 2,0 g dalam akuades ad 1000,0 ml. c. Larutan kreatinin baku = 1 mg dalam akuades ad 100,0 ml d. Asam klorida = 0,83 ml HCL pekat dalam akuades ad 1000,0 ml. (HCl pekat : 36,5 %; bj = 1,18) Kondisi pengukuran Larutan bufer dan asam pikrat direaksikan pada suhu ºC (bufer dan larutan asam pikrat sebelumnya dibiarkan hingga mencapai suhu kamar). Suhu analisis untuk sampel dan baku harus mirip. Panjang gelombang (λ) = 492 nm, tebal kurvet 1 cm. Konsentrasi dalam campuran reaksi akhir adalah sebagai berikut : Larutan bufer NaOH = 125,2 mmol/l dan Na 2 HPO4 = 5 mmol/l; As. Pikrat = 3,5 mmol/l Prosedur : Sampel (ml) Baku (ml) Plasma atau Urin 0,5 - (diencerkan 1 :100) Baku - 0,5 Asam pikrat 1,0 1,0 Campurkan dan biarkan selama 5 menit Larutan bufer 1,0 1,0 8

10 Campurkan dan ukur absorban (tidak lebih dari 1 menit) pada λ = 492 nm, tebal kurvet 1 cm A 1. Selanjutnya, ukur absorban larutan tersebut tepat 5 menit sesudah pengukuran pertama ( ). Pada suhu > 30ºC, A harus diukur tidak lebih dari 30 detik. A2 1 Metode tersebut menunjukkan linieritas hingga konsentrasi:5 mg/100ml(422 μmol/l) Untuk konsentrasi > 5 mg/100 ml, plasma dan urin yang telah diencerkan 100 kali tadi, harus diencerkan dalam 1 : 6 larutan NaCl, dan sesudah pengulangan penentuan, hasil dikalikan dengan 6. KonsentrasiKreatinin = Perhitungan : KonsentrasiKreatinin = A2 ( sampel) A1 ( sampel) x88,4 μmol A ( baku) A ( Baku) L 2 A2 ( sampel) A1 ( sampel) x1 mg A ( baku) A ( Baku) 100mL Soal Latihan: 1. Apakah kepentingan penetapan kadar kreatinin dalam analisis klinik? 2. Bagaimanakah metobolisme kreatinin, dan dimana terdapat? 3. Tuliskan pembentukan kreatinin pikrat? 4. Gangguan apa saja yang dapat timbul pada penetapan kadar kreatini dalam plasma dengan metode pikrat-alkali? 5. Apakah kelebihan metode Jaffe yang dimodifikasi tersebut? 6. Bagaimana cara mengatasi problema yang ada pada nomer 4 tersebut? 7. Pelajarilah metode metode lain untuk penetapan kadar kreatinin! 9

11 PENETAPAN KADAR KOLESTEROL TOTAL (Sampel: plasma) ( Metode : Liebermann Burchard ) Prinsip : Bila kolesterol direaksikan dengan asam asetat anhidrid dan asam sulfat pekat dalam lingkungan bebas air, maka akan terbentuk warna hijau-biru yang intens akibat pembentukan polimer hidrokarbon tan jenuh. Pereaksi : a. Pereaksi kolesterol. Mula-mula pereaksi cair didinginkan hingga 4ºC, kemudian ditambahkan dalam wadah ( yang didinginkan dalam ice-bath) sambil diaduk (magnetik) dengan urutan penambahan sebagai berikut : Asam asetat glasial (30mL), asam asetat anhidrid (60 ml), dan terakhir asam sulfat pekat (10 ml). Ke dalam campuran tersebut, tambahkan natrium sulfat anhidrat (2 g) dan asam 2,5- dimetilbenzensulfonat. (Catatan : Larutan tersebut dalam botol gelap pada 4ºC stabil hingga 2 bulan. Perubahan warna menjadi sedikit kuning tidak mengganggu reaksi). b. Baku kolesterol. Timbang 250 mg kolesterol, masukkan ke dalam labu takar 100 ml. Larutkan dengan asam asetat glasial (10 ml), selanjutnya tambahkan asam asetat glasial hingga 100 ml. Larutan ini stabil dalam jangka waktu tak terbatas. Prosedur : Kerjakan dalam tabung reaksi volume 10 ml : Water-bath 37 ºC Sampel (ml) Blanko pereaksi (ml) Baku (ml) Plasma atau serum 0, Air demineral - 0,04 - Larutan baku - - 0,04 Pereaksi kolesterol 2,0 2,0 2,0 0

12 Campurkan segera dan biarkan dalam water-bath pada 37ºC selama tepat 10 menit. Kemudian campurkan dan baca absorban pada λ = 570 nm terhadap blangko pereaksi dalam waktu tidak lebih dari 5 menit. Perhitungan : KonsentrasiKolesterol = Absorban( sampel) Absorban( blangko) x250 mg Absorban( baku) Absorban( blangko) 100mL Lakukan replikasi sebanyak : 3 kali. Soal Latihan: 1. Apakah kepentingan penetapan kadar kolesterol pada analisis klinik? 2. Bagaimana struktur kolesterol? Apa yang dimaksud dengan kolesterol total? 3. Apa kelebihan metode Liebermann-Burchard pada penetapan kolesterol? 4. Tuliskan reaksi yang terjadi pada nomer 3! 5. Mengapa absorban dibaca pada λ 560 nm? 6. Apa fungsi masing-masing pereaksi pada metode Liebermann-Burchard? 7. Apa kelemahan metode Liebermann-Burchard? 1

13 PENETAPAN KADAR KARBOHIDRAT TOTAL (Sampel: plasma) (Metode: Anilin ) Prinsip: Bila aldose dan ketose dipanaskan dengan anilin dalam asam asetat glasial, akan terjadi reaksi dan menghasilkan senyawa berwarna dengan panjang gelombang maks. 340 nm. Pereaksi: a. Pereaksi asam triklorasetat (10%). Larutan 10 g asam triklorasetat dalam air demineral hingga 100,0 ml. Larutan ini stabil pada suhu kamar. b. Pereaksi anilin Larutan 6,0 g anilin (pro analisis) dalam asam asetat glasial hingga 100,0 ml. Larutan ini stabil untuk beberapa bulan. Perubahan menjadi sedikit kuning tidak menimbulkan gangguan. c. Baku glukose Larutan 110 mg glukose monohidrat dalam larutan jenuh, dingin asam benzoat dalam air demineral hingga 100,0 ml. Larutan ini stabil dalam jangka waktu tak terbatas. Prosedur : Kerjakan dalam tabung reaksi 10 ml: Water-bath 37ºC Sampel (ml) Blangko pereaksi(ml) Baku (ml) Asam triklor asetat 1,0 1,0 1,0 Darah, plasma, serum 0,1 - - Air demineral - 0,1 - Baku glukose - - 0,1 Biarkan beberapa saat, kemudian lakukan sentrifugasi dengan kuat. Pisahkan supernatan Pereaksi anilin 5,0 5,0 5,0 Supernatan 0,5 0,5 0,5 2

14 Panaskan masing-masing tabung reaksi tepat 10 menit dalam water-bath mendidih. Angkat tabung reaksi, dinginkan dengan air mengalir (air kran) dan baca absorban pada panjang gelombang nm, dengan blangko air demineral. Warna tersebut stabil selama 3 jam. Perhitungan : KonsentrasiKarbohidratTotal = Absorban( sampel) AbsorbanblangkoPer ( eaksi) x100 mg Absorbanbaku ( ) Absorban( BlangkoPereaksi) 100mL Kadar glukose normal dalam plasma = mg/100 ml. Soal Latihan : 1. Apakah kepentingan penetapan kadar karbohidrat total pada analisis klinik? 2. Pelajarilah metabolisme karbohidrat/glukose dan penyakit yang terkait? 3. Apakah dasar penetapan kadar karbohidrat total dengan metade Anilin? Tuliskan reaksinya! 4. Apakah guna asam triklorasetat tersebut? Tuliskan reaksinya! Bahan lain apakah yang dapat menggantikan fungsi asam triklorasetat tersebut? 5. Apakah kerugian/ kelemahan metode Anilin untuk penetapan kadar karbohidrat total? 6. Pelajarilah metode lain untuk penetapan karbohidrat total! 7. Apakah makna hasil penetapan kadar karbohidrat total, terkait dengan penyakit/kepentingan diagnose? 3

15 PENETAPAN KADAR UREA NITROGEN (Sampel: urin) (Metode : Berthelot) Prinsip: Urea dipecah menjadi amonia dan karbon dioksida dengan pemberian urease. Amonia yang dibebaskan ditentukan dengan metode Bethelot. Urea merupakan senyawa hasil metabolisme nitrogen. Pengukuran kadar urea nitrogen dapat dilakukan di dalam cairan tubuh, yaitu serum/plasma dan urin, dimana prinsip pengukurannya didasarkan pada salah satu dari metode-metode berikut : 1. Reaksi urea dengan α-diketon dan senyawa -oksim Metode ini dapat menggunakan reagen diacetil, diasetil monoksim, diasetil dioksim, fenilpropanadion, fenilpropanadion monoksim, α-isonitrosopropiofenon, heptoksim, nioksim, dan diasetil monoksim glukuronolakton. Akan tetapi metode ini kurang spesifik karena digunakan juga dalam penetapan kadar sitrulin, alantoin, kreatinin, arginin, protein, dan lainlain. Kelemahan lain yang dimiliki metode ini adalah produk warna yang dihasilkan kurang stabil, tidak memenuhi hukum Lambert-Beer, serta memerlukan deproteinasi dan pemanasan sampai 100 o C. 2. Pengukuran kadar amonia yang dihasilkan dari reaksi urea dengan urease Pada metode ini, urea dipecah dengan enzim urease enghasilkan CO 2 dan amonia. Selanjutnya amonia yang dibebaskan ditetapkan kadarnya dengan reagen Berthelot. Belum diketahui adanya senyawa lain dalam tubuh yang mengalami pemecahan yang sama dengan urea, oleh karena itu metode ini mempunyai spesifitas yang tinggi terhadap urea. 3. Pengukuran dengan elektroda ion selektif Metode ini memanfaatkan urease yang dilekatkan pada membran dan pengukuran amonia yang dihasilkan dengan elektrode ion spesifik, tetapi metode ini masih dalam tahap pengembangan. 4. Pengukuran urea dengan optical test, menggunakan urease dan glutamat dehidrogenase Metode ini paling memuaskan karena penggunaan urease dikombinasikan dengan glutamat dehidrogenase. 4. Metode fotometri lain, yaitu menggunakan p-dimetilaminobenzaldehid atau xantidrol, akan tetapi tidak spesifik dan belum banyak diketahui. Selain metode tersebut, urea dapat 4

16 diukur dengan mikrodifusi, gasometri atau metode elektrokimia, tetapi sulit diterapkan untuk pekerjaan rutin. Diantara metode tersebut, metode pemecahan dengan urease dilanjutkan dengan pengukuran amonia dengan metode Berthelot paling sering digunakan. Prinsip dari metode ini sebagai berikut : NH 2 urease C O + H 2 O 2 NH 3 + CO 2 NH 2 Amonia yang dihasilkan ditetapkan kadarnya dengan metode Berthelot. Reaksi yang terjadi sebagai berikut : I. NH 3 + HOCl H 2 NCl + H 2 O (ph > 7,5) As. hipoklorit Kloramin [Fe(CN) 5 NO] OH - [Fe(CN) 5 NO 2 ] 4- + H 2 O [Fe(CN) 5 H 2 O] NO 2 Nitroprusid nitritopentasianoferat aquapentasianoferat II. [Fe(CN) 5 H 2 O] 3- + H 2 NCl kompleks + fenol R R O N O (dalam medium basa) *pembentukan monokloramin berlangsung paling cepat pada ph 10.5, sedangkan pada ph > 11.5 berjalan sangat lambat dan pada ph < 10.5 produk monokloramin yang terbentuk cepat terdekomposisi. Oleh karena itureaksi hendaknya dilakukan pada ph *sensitifitas reaksi dapat ditingkatkan mensubstitusi posisi 2 dari cincin fenol dengan donor elektron. Senyawa yang direkomendasikan adalah 2-klorofenol. Untuk tujuan klinik, salisilat terbukti cukup sensitif. Pengukuran kadar amonia dengan metode Berthelot sangat sensitif dan mempunyai koefisien ekstingsi molar (ε) sebesar Selain itu metode ini memiliki spesifisitas yang tinggi terhadap ion amonium. Reaksi berjalan lambat tapi dapat ditingkatkan dengan penambahan agen pengkopling, seperti Na-nitroprusid. 5

17 Pereaksi : a. Larutan nitroprusid-salisilat. Larutan 3 g natrium salisilat dan 60 mg natrium nitroprusid dalam air demineral hingga 100,0 ml. (Larutan ini dapat disimpan selama 6 bulan pada 4 ºC dalam ruang gelap atau 1 bulan pada suhu kamar). b. Larutan stok hipoklorit (NaOCl dalam akuades hingga 100,0 ml. Larutan tersebut dapat disimpan selama 1 bulan pada suhu kamar. c. Larutan natrium hidroksida (12,5 mol/l). Larutan 50 g NaOH dalam akuades hingga 100,0 ml. d. Larutan NaOH-hipoklorit (NaOC1 550 mmol/l; NaOH 6,25 mol/l). Campurkan dengan jumlah yang sama larutan stok hipoklorit (1,1 mol/l) dengan larutan NaOH (12,5 mol/l). (larutan ini dapat disimpan selama 6 bulan pada 4ºC dalam ruang gelap atau 1 bulan pada suhu kamar). e. Larutan urea-nitrogen baku (20 mg/100 ml atau 7,13 mmol/l). Larutan 42,8 mg urea dalam larutan jenuh, dingin asam benzoat dalam air demineral dan encerkan hingga 100,0 ml dengan larutan asam benzoat yang sama. Larutan ini stabil dalam jangka waktu tak terbatas. f. Bufer EDTA (27 mmol/l, ph 6,5). Larutan 1 g Na2EDTA. 2H 2O.2H20 dalam 99 ml air demineral, atur ph larutan hingga tepat 6,5 menggunakan larutan NaOH, encerkan dengan air demineral hingga 100,0 ml. Larutan ini stabil dalam jangka waktu tak terbatas. g. Larutan 25 mg urease dalam buffer EDTA dan encerkan hingga 50,0 ml denngan buffer tersebut. Larutan stabil selama beberapa minggu pada 4 ºC Prosedur : Sampel (ml) Blangko sample (ml) Baku (ml) Blangko baku (ml) Larutan urease 0,1-0,1 - Serum, plasma 0,02 0, Larutan baku - - 0,02 0,02 Inkubasi pada 37ºC selama 20 menit atau pada suhu kamar selama 30 menit Larutan salisilas 2,5 2,5 2,5 2,5 6

18 Larutan urease - 0,1-0,1 Larutan hipoklorit 2,5 2,5 2,5 2,5 Biarkan masing-masing larutan selama 10 menit pada suhu kamar, kemudian baca absorban terhadap blangko air demineral pada λ = 546 nm ( nm). Perhitungan : KonsentrasiUreaNitrogen = Absorban( sampel) Absorban( blangkosampel) x20 mg Absorban( baku) Absorban( BlangkoBaku ) 100mL KonsentrasiUrea = Absorban( sampel) Absorban( blangkosampel) x42,8 mg Absorban( baku) Absorban( BlangkoBaku ) 100mL Kondisi normal :Dewasa, n= 347. Urea nitrogen Urea = 7,8 21,4 mg/100 ml. = 16,7 45,9 mg/100 ml. Soal Latihan : 1. Apakah kepentingan penetapan kadar urea-nitrogen dalam analisis klinik? 2. Tuliskan reaksi yang terjadi pada penetapan kadar urea-nitrogen dengan metode Betherlot! 3. Apakah kelebihan metode Berthelot pada penetapan kadar urea-nitrogen? 4. Mengapa digunakan air demineral? Bagaimana cara membuat air demineral? 5. Apakah fungsi EDTA pada penetapan kadar urea-nitrogen tersebut? 6. Apakah manfaat pada penetapan kadar urea-nitrogen tersebut, terkait dengan kepentingan diagnose? 7. Pelajarilah metode lain untuk penetapan kadar urea-nitrogen! 7

19 PENETAPAN KADAR PROTEIN TOTAL (Sampel: Urin) A. METODE : SPEKTROFOTOMETRI Prinsip : Warburg dan Cristian adalah orang yang pertama kali memperkenalkan bahwa dengan menggunakan persamaan sederhana atau monogram, dapat dieveakuasi konsentrasi protein dan asam nukleat dari absorban larutan sample pada λ = 280 dan 260 nm. Penentuan tersebut menggunakan prinsip pengukuran absolut. Pereaksi : Larutan matrium klorida 0,9 %. Larutan 0,9 g NaCl dalam akuades hingga 100,0 ml. Prosedur : Absorban larutan sampel yang ditentukan konsentrasi proteinnya diukur pada λ 260 dan 280 nm terhadap blangko larutan NaCl. Perhitungan : Konsentrasi protein = [1,55 x Abs. pada 280 nm] [0,76 x Abs.pada 260 nm] mg/ml. Selanjutnya hasil tersebut dibaca pada Nomogram. Soal Latihan : 1. Apakah kepentingan penetapan kadar protein dalam analisis klinik? 2. Apakah dasar penetapan kadar protein secara spektrofotometri UV? 3. Apakah syarat metode tersebut dapat digunakan? 4. Gangguan apakah yang ada pada metode spektrofotometri UV tersebut? 5. Pakah kelemahan spektrofotometri UV penetapan kadar protein? 6. Pelajarilah cara lain untuk penetapan kadar protein! 8

20 Calculation According to Layne. 8 Concentration = [ 1.55 E(280)] [0.76E(260)] mg 1 ml Reading the result straight from the monogram (Fig.105). 9

21 B. METODE : BIURET Prinsip : Senyawa dengan dua atau lebih ikatan peptida apabila direaksikan dengan garam kupri dalam suasana basah akan membentuk warna violet. Pereaksi : a. Pereaksi basa. Larutan 36 g urea dalam larutan NaOH ( 20 g/250ml akuades) dan encerkan hingga 100,0 ml dengan larutan NaOH yang sama. b. Pereaksi Biuret. Larutkan 4,25 g CuSO 4 dalam lebih kurang 25 ml air demineral. Larutkan 1,8 g KI dalam lebih kurang 25 ml air demineral. Larutkan 43,5 g natrium sitrat dan 25 g Na 2 CO 3 dalam lebih kurang 250 ml air demineral. Sambil diaduk/digoyang, tambahkan larutan CuSO 4 tersebut di atas, dan terakhir tambahkan larutan KI. Masukkan 180 g urea ke dalam larutan terakhir tersebut dengan pengadukan tetap, selanjutnya encerkan dengan air demineral hingga 500,0 ml. c. Larutan Biuret. Untuk penggunaan dalam analisis, campurkan sama banyak volume (1 bagian pereaksi basa dan 1 bagian pereaksi Biuret). d. Larutan albumin baku (tahan selama beberapa bulan pada suhu 4ºC). Larutkan 7 g albumin baku dalam larutan KCl (373 mg/250 ml dalam akuades) yang telah diatur phnya hingga 6,5 6,8 menggunakan larutan natrium karbonat, selanjutnya encerkan hingga 100,0 ml dengan larutan KCl tersebut. Prosedur : Sampel (ml) Blangko pereaksi (ml) Plasma, serum 0,04 - Air demineral - 0,04 Larutan Biuret 2,0 2,0 Campurkan homogen, biarkan beberapa saat. 0

22 Baca absorban terhadap blangko air demineral antara menit ke 30 dan 40 sesudah pencampuran. Konsentrasi Pr otein = Absorban( sampel) Absorban( blangkopereaksi) xkons.pr otein g Absorban( baku) Absorban( BlangkoPereaksi) 100mL Soal Latihan ; 1. Apakah kelebihan penetapan kadar protein cara Biuret dibanding metode spektrofotometri UV? 2. Apakah dasar penetapan kadar protein cara Biuret? 3. Tuliskan reaksi yang terjadi pada penetapan kadar protein cara Biuret? Jelaskan mengapa terbentuk warna? 4. Apakah kelebihan penggunaan albumin sebagai standar pada penetapan kadar protein? 5. Apakah gangguan yang ada pada penetapan kadar protein cara Biuret? 6. Apakah senyawa pengganti albumin sebagai standar pada penetapan kadar protein? 1

23 DAFTAR PUSTAKA Christian, G.D., 1994, Analytical Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., New York. Lewandrowski, K., (Editor) 2002, Clinical Chemistry, Laboratory management and clinical correlations, LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS, A Wolters Kluwer Company, Philadelphia. Richterich, R. and Colombo, J.P., 1981, Clinical Chemistry, Theory, Practice, and Interpretation, John Wiley & Sons, Chichester. Smith, R.V. and Stewart, J.T., 1981, Textbook of Biopharmaceutic Analysis, A description of methods for the determination of drug in biological fluids, Lea & Febiger, Philadelphia. Stryer, L., 1995, Biochemistry, Fourth Edition, W.H. Freeman and Company, New York. 2