18 3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari sampai Maret 2012. Penelitian dilakukan di Laboratorium Karakterisasi Bahan Baku Hasil Perikanan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Laboratorium Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, dan Laboratorium Terpadu Institut Pertanian Bogor, Bogor. 3.2 Alat dan Bahan Alat yang digunakan pada penelitian ini meliputi cool box, freezer, timbangan digital, pisau, penggaris, botol film, gelas ukur, gelas arloji, cawan porselin, oven, desikator, destilator, vortex, tanur listrik, tabung Kjeltec, labu penyuling, erlenmeyer, bulb, buret, kertas saring Whatman, shaker, kapas bebas lemak, labu lemak, labu kjeldahl, alat ekstraksi Soxhlet, tabung reaksi tertutup, pipet, perangkat GC (Gas Chromatography), dan perangkat AAS (Atomic Absorption Spectrophotometer). Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi bahan utama sampel ikan rawa jenis M. erythrotaenia (ikan Sili), H. fortis (ikan Baung), C. micropeltes (ikan Toman), C. striatus (ikan Haruan), dan C. Lucius (ikan Kehung), serta bahan kimia yang digunakan untuk analisis. Bahan kimia yang digunakan adalah aquades, tablet Kjeltab, NaOH, H2SO4, HCl, heksana, metanol, BF3-metanol, asetonitril 60%, gas Nitrogen (N2) dan gas Hidrogen (H2), amonium hidroksida, amonium molibdat, amonium vanadat, arsenik oksida, asam borat, asam peklorat, asam selenat, asetonitril 60%, buffer posfat 0,1 M, cerium aluminium sulfat, elektrolit besi, es, etanol 95%, gas nitrogen, hidroksil aminasulfat, indikator bromcressol green, kalsium karbonat, lantanun oksida, larutan hidroquinon, metanol, metil merah, momobastik potasium sulfat, natrium asetat, natrium klorida, orto-phenantrolin, pelarut lemak, peroksida, pikoiosianat, potasium iodida, potasium klorat, potasium klorida, sodium bikarbonat anhidrat, sodium sitrat, trietilamin.
19 3.3 Prosedur Penelitian Kegiatan penelitian ini meliputi pengukuran rendemen produksi fillet, analisa proksimat (kadar air, abu, protein, dan lemak), asam lemak dan beberapa logam berat. Preparasi sampel dan pengukuran rendemen produksi fillet dilakukan di Laboratorium Karakterisasi Bahan Baku Hasil Perikanan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Analisa proksimat dilakukan di Laboratorium Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian. Analisa asam lemak dan logam berat dilaksanakan di Laboratorium Terpadu Institut Pertanian Bogor, Bogor. 3.3.1 Rendemen produksi fillet Rendemen produksi fillet dihitung sebagai persentase rasio produk yang dihasilkan (fillet) dengan bobot bahan baku awal. Contoh perhitungan rendemen produksi fillet dapat dilihat pada Lampiran 1 dan rumus perhitungan rendemen produksi fillet disajikan dibawah ini: % Rendemen produksi fillet = x 100% 3.3.2 Analisa proksimat Analisa proksimat merupakan suatu analisa yang dilakukan untuk memprediksi komposisi kimia suatu bahan, termasuk didalamnya kadar air, abu, protein, dan lemak. Analisa proksimat yang dilakukan meliputi uji kadar air dan kadar abu menggunakan metode gravimetric, uji kadar lemak menggunakan metode soxhlet dan uji kadar protein menggunkan metode kjeldahl. (1) Analisa kadar air (SNI 01-2891-1992) Analisis kadar air dilakukan menggunakan metode gravimetric. Prinsipnya adalah menguapkan air yang ada dalam sampel dengan cara pemanasan. Kemudian menimbang sampel sampai didapat bobot konstan yang diasumsikan semua air yang terkandung dalam sampel sudah diuapkan. Selisih bobot sebelum dan sesudah pengeringan adalah banyaknya air yang diuapkan.
20 Cawan yang akan digunakan dioven terlebih dahulu selama 30 menit pada suhu 100-105 o C, kemudian didinginkan dalam desikator untuk menghilangkan uap air dan ditimbang (A). Sampel ditimbang sebanyak 2 g dalam cawan yang sudah dikeringkan (B), kemudian dioven pada suhu 100-105 o C selama 6 jam lalu didinginkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang (C). Tahap ini diulangi hingga dicapai bobot konstan. Diagram alir metode analisis kadar air dapat dilihat di Lampiran 2. Kadar air dihitung dengan rumus : % kadar air = x 100% (2) Analisa kadar abu (SNI 01-2891-1992) Analisis kadar abu dilakukan menggunakan metode gravimetric. Prinsipnya adalah pembakaran atau pengabuan bahan-bahan organik yang diuraikan menjadi air (H 2 O) dan karbondioksida (CO 2 ) tetapi zat anorganik tidak terbakar. Zat anorganik ini yang disebut abu. Cawan yang akan digunakan dioven terlebih dahulu selama 30 menit pada suhu 100-105 o C, kemudian didinginkan dalam desikator untuk menghilangkan uap air dan ditimbang (A). Sampel ditimbang sebanyak 2 g dalam cawan yang sudah dikeringkan (B), kemudian dibakar diatas nyala pembakar sampai tidak berasap dan dilanjutkan dengan pengabuan di dalam tanur bersuhu 550-600 o C sampai pengabuan sempurna (sesekali pintu tanur dibuka sedikit agar oksigen masuk). Sampel yang sudah diabukan didinginkan dalam desikator dan ditimbang (C). Tahap pembakaran dalam tanur diulangi sampai didapat bobot yang konstan. Daigram alir metode analisis abu dapat dilihat di Lampiran 3. Kadar abu dihitung dengan rumus : % kadar abu = x 100%
21 (3) Analisa kadar lemak (SNI 01-2891-1992) Analisis kadar lemak dilakukan menggunakan metode hidrolisis soxhlet. Prinsipnya adalah lemak yang terdapat dalam sampel diekstrak dengan menggunakan pelarut lemak nonpolar. Labu lemak yang akan digunakan dioven selama 30 menit pada suhu 100-105 o C, kemudian didinginkan dalam desikator untuk menghilangkan uap air dan ditimbang (A). Sampel ditimbang sebanyak 2 g (B) lalu dibungkus dengan kertas saring, ditutup dengan kapas bebas lemak dan dimasukkan ke dalam alat ekstraksi soxhlet yang telah dihubungkan dengan labu lemak yang telah dioven dan diketahui bobotnya. Pelarut heksana atau pelarut lemak lain dituangkan sampai sampel terendam dan dilakukan refluks atau ekstraksi lemak selama 5-6 jam atau sampai pelarut lemak yang turun ke labu lemak berwarna jernih. Pelarut lemak yang telah digunakan, disuling dan ditampung, setelah itu ekstrak lemak yang ada dalam labu lemak dikeringkan dalam oven bersuhu 100-105 o C selama satu jam, lalu labu lemak didinginkan dalam desikator dan ditimbang (C). Tahap pengeringan labu lemak diulangi sampai didapat bobot yang konstan. Diagram alir metode analisis kadar lemak dapat dilihat di Lampiran 4. Kadar lemak dihitung dengan rumus : % kadar lemak = x 100% (4) Analisa kadar protein (AOAC 1995) Analisis kadar protein dilakukan menggunakan metode mikro kjeldahl. Prinsipnya adalah oksidasi bahan-bahan berkarbon dan konversi nitrogen menjadi amonia oleh asam sulfat, selanjutnya amonia bereaksi dengan kelebihan asam membentuk amonium sulfat. Amonium sulfat yang terbentuk diuraikan dan larutan dijadikan basa dengan NaOH. Amonia yang diuapkan, akan diikat dengan asam borat. Nitrogen yang terkandung dalam larutan ditentukan jumlahnya dengan titrasi menggunakan larutan baku asam. Sampel ditimbang sebanyak 0,1-0,5 g, dimasukkan ke dalam labu kjeldahl 100 ml, ditambahkan dengan 10-25 ml H 2 SO 4 dan 2 g campuran selen (2,5 g serbuk SeO 2, 100 gr K 2 SO 4, dan 20 gr CuSO 4.5H 2 O) atau ¼ buah tablet
22 kjeltab, kemudian dilakukan dekstruksi (pemanasan dalam keadaan mendidih) sampai larutan menjadi hijau jernih dan SO 4 hilang. Larutan dibiarkan dingin dan dipindahkan ke labu pengencer 50 ml dan diencerkan dengan aquades sampai tanda tera, dimasukkan ke dalam alat destilasi, ditambahkan dengan 5-10 ml NaOH 30-33% dan dilakukan destilasi. Hasil destilasi ditampung dalam larutan 10 ml asam borat 3% dan beberapa tetes indikator (larutan bromcresol green 0,1% dan larutan metil merah 0,1% dalam alcohol 95% secara terpisah dan dicampurkan antara 10 ml larutan bromcresol green dengan 2 ml metal merah) kemudian dititrasi dengan larutan HCl 0,02 N sampai larutan berubah warnanya menjadi merah muda. Diagram alir metode analisis kadar protein dapat dilihat di Lampiran 5. Kadar protein dihitung dengan rumus : % kadar nitrogen = ( ) % kadar protein = % kadar nitrogen X FK Keterangan : A : Volume HCl untuk titrasi blanko B : Volume HCl untuk titrasi sampel (ml) C : Normalitas HCl yang digunakan (0,02374 N) D : Bobot sampel (mg) FK : Faktor Konversi (6,25 untuk produk perikanan) 3.3.3 Analisa asam lemak (AOAC 1984) Metode analisa yang digunakan memiliki prinsip mengubah asam lemak menjadi turunannya, yaitu metil ester sehingga dapat terdeteksi oleh alat kromatografi. Analisis dengan kromatografi gas didasarkan pada partisi komponen-komponen dari suatu cairan diantara fase gerak berupa gas dan fase diam berupa zat padat atau cairan yang tidak mudah menguap yang melekat pada bahan pendukung inert. Komponen-komponen yang dipisahkan harus mudah menguap pada suhu pemisahan yang dilakukan, sehingga suhu operasi biasanya lebih tinggi dari suhu kamar dan biasanya dilakukan derivatisasi untuk contoh yang sulit menguap.
23 Sampel lemak atau minyak dihidrolisis menjadi asam lemak, kemudian ditransformasi menjadi bentuk esternya yang bersifat lebih mudah menguap. Transformasi dilakukan dengan cara metilasi sehingga diperoleh metil ester asam lemak (Fatty Acid Metil Ester / FAME). Selanjutnya FAME dianalisis dengan alat kromatografi gas. Alat kromatografi gas yang digunakan adalah kromatografi gas merk Shimadzu GC-2010 Plus. Identifikasi tiap komponen asam lemak dilakukan dengan membandingkan waktu retensinya dengan waktu retensi standar pada kondisi analisis yang sama. Waktu retensi dihitung pada kertas rekorder sebagai jarak dari garis pada saat muncul pelarut sampai ke tengah puncak komponen yang dipertimbangkan. Luas puncak dari masing-masing komponen adalah berbanding lurus dengan jumlah komponen tersebut dalam contoh. Proses analisa asam lemak terdiri dari tiga tahapan, yaitu tahap ekstraksi, pembentukkan metil ester (metilasi), dan identifikasi asam lemak. (1) Tahap ekstraksi Terlebih dahulu diperoleh asam lemak dengan metode hidrolisis soxhlet. Pada tahap ini akan diperoleh lemak dalam bentuk minyak. Sampel tersebut ditimbang sebanyak 20-30 mg lemak untuk dilanjutkan pada tahap metilasi. (2) Pembentukkan metil ester (metilasi) Tahap metilasi dimaksudkan untuk membentuk senyawa turuanan dari asam lemak menjadi metil esternya. Asam-asam lemak diubah menjadi ester-ester metil atau alkil yang lainnya sebelum disuntikkan ke dalam kromatografi gas. Metilasi dilakukan dengan merefluks lemak di atas penangas air dengan pereaksi berturut-turut NaOH-metanol 0,5 N, BF 3 20%, NaCl jenuh dan isooktan. Sebanyak 20-30 mg lemak dari sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup teflon dan ditambahkan 1 ml NaOH 0,5 N dalam methanol lalu dipanaskan dalam penangas air selama 20 menit pada suhu 80 o C. Kemudian larutan didinginkan. Sebanyak 2 ml BF 3 20% ditambahkan ke dalam tabung lalu tabung dipanaskan kembali pada waterbath dengan suhu 80 o C selam 20 menit dan didinginkan. Kemudian ditambahkan 2 ml NaCl jenuh dan 1 ml isooktan, dikocok dengan baik. Lapisan isooktan bagian atas larutan, dipindahkan
24 dengan bantuan pipet tetes ke dalam tabung reaksi yang berisi 0,1 gram Na 2 SO 4 anhidrat, didiamkan selama 15 menit. Larutan disaring dengan mikrofilter untuk memisahkan fase cairnya sebelum diinjeksikan ke dalam Gas Chromatography. Asam lemak yang ada dalam metil ester akan diidentifikasi oleh Flame Ionization Detector (FID) atau detektor ionisasi nyala dan respon yang ada akan tercatat melalui kromatogram (peak). (3) Identifikasi asam lemak Identifikasi asam lemak dilakukan dengan menginjeksikan metil ester pada alat kromatografi gas Shimadzu GC-2010 Plus. Gas yang digunakan sebagai fase gerak adalah gas nitrogen dengan aliran bertekanan 20 ml/menit dan oksigen dengan aliran 200-250 ml/menit. Kolom yang digunakan adalah kolom kapiler (capillary column) yang panjangnya 60 m dan diameter dalam 0,25 mm dengan tebal lapisan film 0,25 µm. Suhu injektor sebesar 220 o C dan suhu detektor sebesar 240 o C. Temperatur terprogram yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 1 dan alat kromatografi gas merk Shimadzu GC-2010 Plus yang digunakan pada penelitian ini. Tabel 1 Kolom temperatur terprogram pada alat GC Rate ( o C/menit) Temperatur ( o C) Hold Time (menit) - 125 5 10 185 5 5 205 10 3 225 7 Larutan yang telah disaring untuk dipisahkan dengan fase cairnya, diambil sebanyak 1 µl untuk diinjeksikan ke kromatografi gas. Kecepatan linear (linear velocity) larutan yang diinjeksikan pada kolom kapiler (capillary column) sebesar 23,6 cm/detik. Diagram alir metode analisis kadar protein dapat dilihat di Lampiran 6. Selanjutnya identifikasi tiap komponen asam lemak dilakukan dengan membandingkan waktu retensinya dengan waktu retensi standar pada kondisi analisis yang sama. Kandungan asam lemak dalam sampel dapat dihitung dengan mengunakan rumus :
25 ( ) % kadar nitrogen = x 100% Keterangan : Ax As Cstandar Vcontoh : Area sampel : Area standar : Konsentrasi Standar : Volume contoh (1 ml isooktan) 3.3.4 Analisa logam berat (Pb dan Cd) (SNI 01-2896-1998) Prinsip penetapan logam berat (Pb dan Cd) yaitu sesudah penghilangan bahan-bahan organik dengan pengabuan kering atau basah, residu dilarutkan dalam asam encer (sampel yang dicampurkan dengan larutan magnesium nitrat dalam etanol kemudian dikeringkan dan diabukan). Larutan disebarkan dalam nyala api yang ada di dalam alat Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS) sehingga absorpsi atau emisi logam dapat dianalisis dan diukur pada panjang gelombang tertentu. Sampel ditimbang sebanyak 5 g lalu dimasukkan ke dalam cawan porselen atau gelas piala pyrex 100 ml. Larutan magnesium nitrat 10% dalam etanol ditambahkan sebanyak 10 ml dengan menggunakan pipet, diaduk dengan batang pengaduk. Batang pengaduk diangkat dan dibilas dengan etanol 95%. Etanol pada sampel diuapkan di atas penangas air sambil sesekali diaduk, kemudian dipanaskan di atas penangas listrik dengan gelas piala ditutup dengan gelas arloji. Gelas piala dipindahkan ke dalam tanur bersuhu 200 o C dan suhu dinaikkan secara bertahap sampai 500 o C selama 2 jam dan sampel diabukan sepanjang malam dengan suhu 450-500 o C. Gelas piala diangkat dari tanur dan dibiarkan dingin. Apabila masih terdapat sisa karbon, setelah dingin sampel ditambahkan dengan 1 ml air dan 2 ml HNO 3 pekat dan keringkan di atas penangas air. Lalu sampel dipanaskan kembali di dalam tanur pada suhu 500 o C selama 1 jam. Perlakuan ulangi sampai didapat abu berwarna putih. Larutan campuran HCl dan HNO 3 ditambahkan sebanyak 5 ml melalui dinding gelas piala dan dipanaskan di atas penangas air sampai abu larut. Larutan
26 dipindahkan ke dalam labu ukur 100 ml dan disaring dengan kertas saring whatman No. 54 dan diencerkan sampai dengan volume 50 ml. Blanko dikerjakan dengan menggunakan pereaksi yang sama dengan sampel. Absorbansi diukur dengan menggunakan Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS) merk Shimadzu AA-6300 pada panjang gelombang 283,3 nm untuk timbal dan 228,8 nm untuk kadmium. Alat Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS) merk Shimadzu AA-6300. Diagram alir metode analisis logam berat dapat dilihat pada Lampiran 7. Kandungan logam dalam sampel dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut: % kadar mineral (ppm) = Keterangan : Abs : Absorbansi yang terbaca pada AAS V : Volume pengenceran Slope : Slope regresi kurva standar dari masing- masing mineral W : Bobot sampel (g)