BAHAN DAN METODE Penelitian di Lapang Materi dan Waktu Penelitian di Lapang Penelitian di lapang meliputi pengamatan aktivitas terbang harian, mencari polen, pengumpulan sampel polen dari tungkai A. cerana, sampel bunga di sekitar sarang, dan pengambilan foto sarang. Penelitian di lapang dilakukan pada bulan Juli sampai dengan Agustus 2008. Studi Lokasi Penelitian Penelitian dilakukan di dua desa di sekitar hutan Bali Barat. Kedua desa terletak di pesisir pantai. Lokasi pertama di Desa Sumber Klampok (SK), Kecamatan Gerogak, Kabupaten Buleleng (08 10 44 S, 114 28 934 E) dengan ketinggian 24 m dpl (Gambar 13). Berdasarkan Depdagri (2003 a ) tentang Data Monografi Desa, Desa SK mempunyai luas wilayah 100 704 Ha. Curah hujan di SK tiap tahun hanya 78.5 mm dengan suhu rata-rata minimal 19-28 o C dan maksimum 23-29 o C. Desa SK sangat kering pada musim panas. Desa SK merupakan salah satu desa di dalam TNBB (enclave). Desa SK berbatasan langsung dengan hutan di sebelah utara, selatan dan barat, sedangkan di sebelah timur berbatasan dengan Desa Pajarakan. Di Desa SK terdapat perkebunan kapuk (Ceiba petandra) dan pertanian tadah hujan. Masyarakat di SK banyak yang bergantung pada hasil hutan, salah satunya adalah madu dari peternakan A. cerana. Lokasi kedua di Desa Melaya (ML), Kecamatan Melaya, Kabupaten Jembrana (08 15 006 S, 114 29 069 E) dengan ketinggian 43 m dpl. Berdasarkan Depdagri (2003 b ), Desa ML mempunyai luas 1 649 500 Ha, dengan curah 172.42 mm. Desa ML berbatasan dengan hutan di sebelah utara dan barat. Mata pencaharian masyarakat Desa ML sebagian besar berdagang dan berkebun. Perkebunan yang dominan di ML adalah kelapa (C. nucifera), coklat (T. cacao) dan tanaman buah seperti rambutan (N. laplaceum) dan mangga (M. indica).
Persiapan Koloni A. cerana Koloni A. cerana yang digunakan dalam penelitian berasal dari perlebahan tradisional di SK dan ML. Koloni A. cerana berada di dalam kotak dengan ukuran 20x20x40 cm dan 25x25x50 cm. Koloni A. cerana di Desa SK sebelum pengamatan digantung pada pohon sawo kecik (M. kauki) pada ketinggian 7-8 m, sedangkan di Desa ML digantung pada pohon coklat (T. cacao) dengan ketinggian 2-3 m. Satu minggu sebelum pengamatan kotak A. cerana diturunkan dari pohon dan ditempatkan pada ketinggian 1-1,5 m. Pada tiap lokasi dipilih empat koloni. Pengamatan Aktivitas Terbang Harian dan Mencari Polen A. cerana Pengamatan aktivitas terbang harian dan mencari polen A. cerana dimulai pada pukul 05.20-18.30 (WITA). Tiap pengamatan dilakukan selama 10 menit dengan interval 20 menit. Aktivitas A. cerana selama pengamatan direkam dengan handycam (Sony Digital HDD DCRSR80) (Gambar 14). Saat cahaya belum cukup untuk pengamatan, aktivitas harian mencari polen A. cerana direkam dengan bantuan sinar infra merah dari handycam. Jumlah A. cerana yang masuk ke sarang dan masuk membawa polen dihitung menggunakan counter (modifikasi Pierrot & Schlindwein 2003). A. cerana yang mencari polen terlihat membawa polen pada tungkai belakang, sedangkan A. cerana tanpa polen di tungkai diduga membawa nektar, air atau resin. Setiap koloni A. cerana diamati dua kali. Faktor-faktor lingkungan seperti cahaya, kelembaban, suhu di luar sarang dan suhu di dalam sarang diukur tiap kisaran satu jam. Data matahari terbit, terbenam, kecepatan angin, dan curah hujan diperoleh dari Stasiun Klimatologi di Negara Bali. Pengumpulan Polen Pengumpulan polen di SK dan ML dilakukan setelah pengamatan aktivitas terbang harian dan mencari polen pada tiap koloni. Pengumpulan polen menggunakan pollen trap (Gambar 15). Polen yang jatuh dari pollen trap disimpan dalam amplop (Gamban 16). Pengumpulan polen dilakukan tiga kali dalam satu hari yaitu pukul 06.00-10.00, 11.00-13.00, dan 14.00-16.00 (WITA).
Pengumpulan polen juga dilakukan dari bunga yang mekar disekitar sarang dalam radius satu kilometer di SK dan ML. Polen bunga dari sekitar sarang digunakan sebagai bahan rujukan dari polen yang dibawa oleh A. cerana. Posisi tumbuhan yang mekar di sekitar sarang diukur menggunakan Global Positioning System (GPS), untuk dapat dipetakan. Pengambilan Gambar Sarang Gambar sarang koloni A. cerana diambil setelah pengumpulan sampel polen. Tiap koloni A. cerana diambil tiga sisir sarang untuk pengambilan gambar sarang. Gambar sarang yang diambil harus mempunyai skala agar dapat dianalisis (Gambar 17). Pengambilan gambar menggunakan jarak dan perbesaran yang tetap. Tiap sisir sarang dilakukan dua kali pengambilan gambar, yaitu sisi A dan sisi B. Gambar diambil dengan kamera Sony Digital HDD DCRSR80. Penelitian di Laboratorium Waktu dan Tempat Analisis Analisis aktivitas terbang harian dan mencari polen A. cerana, analisis sarang, dan analisis polen dilakukan pada bulan September 2008 sampai dengan April 2009. Analisis aktivitas terbang harian dan mencari polen A. cerana dilakukan di bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan, sedangkan analisis polen dilakukan di bagian Ekologi dan Sumberdaya Hayati Tumbuhan, Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA), Institut Pertanian Bogor. Analisis Polen dari Tungkai A. cerana dan Bunga Analisis polen dari tungkai A. cerana dan bunga menggunakan metode acetolysis (Erdtman 1972). Tahapan-tahapan acetolysis secara singkat (Gambar 18) adalah sampel polen pada tiap amplop dimasukkan ke tabung cupsidal dan diberi KOH 10%, didiamkan selama lima menit kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit. Pemberian KOH berfungsi untuk menghilangkan zat organik seperti karbohidrat dan protein. Setelah sentrifugasi, supernatan dibuang kemudian polen ditambah akuades 1 mm dan disentrifugasi.
Pencucian polen dengan akuades dilakukan dua kali. Setelah pencucian dan supernatant dibuang, polen ditambahkan asam asetat glasial (100%) sebanyak 1 mm untuk menghidrolisis air dan menjernihkan polen, kemudian disentrifugasi. Langkah selanjutnya supernatant dibuang dan polen ditambah larutan acetolysis. Larutan acetolysis merupakan campuran acetic anhydrous (100%) dengan sulfuric acid (100%) dengan perbandingan 9:1. Pembuatan larutan acetolysis dengan cara menambahkan sulfuric acid pada acetic anhydrous secara perlahan, karena menimbulkan panas. Pembuatan larutan acetolysis harus di ruang asam karena menggunakan asam kuat. Setelah pemberian larutan acetolysis, kemudian sampel dipanaskan dalam penangas air pada suhu 90-95 C selama ± 5 menit. Sampel didinginkan dan disentrifugasi lalu supernatant dibuang. Sampel polen ditambahkan asam asetat glacial dan disentrifugasi. Langkah terakhir adalah mencuci sampel polen dengan akuades sebanyak tiga kali dan disentrifugasi. Setelah pencucian sampel disimpan dalam gliserin 30%, dan siap untuk dibuat preparat. Pembuatan preparat polen menggunakan media gliserin jeli 30%. Pemeriksaan karakter dan identifikasi polen berdasarkan Edrtman (1972) dan Huang (1972). Pengamatan polen menggunakan mikroskop cahaya. Pengukuran polen menggunakan mikrometer dan setiap tipe polen dilakukan lima kali pengukuran. Pengambilan gambar polen menggunakan kamera digital Olympus DP-12. Identifikasi tumbuhan yang berbunga di sekitar sarang berdasarkan Stenis et al. (2008). Untuk pemeriksaan kembali tipe polen dari tungkai A. cerana, dilakukan verifikasi polen oleh Bapak Bob Yuris dari PT. Corelab Indonesia. Karakterisasi Sarang A. cerana Penghitungan luas sisir sarang, jumlah pupa, sel madu, dan sel kosong menggunakan program ImageJ yang dapat diakses secara langsung (online) dari http://rsb.info.nih.gov/ij.
Analisis Data Penghitungan A. cerana yang masuk ke sarang dan yang membawa polen menggunakan program K-Lite. Codec. Pack. 3.4.5. Analisis hubungan aktivitas harian, mencari polen dan faktor lingkungan menggunakan Principle Component Analysis (PCA). Hubungan jumlah pupa dengan aktivitas terbang harian mencari polen menggunakan regresi. Peta Penelitian di Bali Barat Bujur Timur N 2Km Lintang Selatan Gambar 13 Peta lokasi penelitian.
Sarang A. cerana Handycam Pengamat Pollen trap Gambar 14 Posisi sarang, handycam dan pengamat. Gambar 15 Pollen trap untuk pengumpulan polen. Gambar 16 Polen yang dikumpulkan dari tungkai A. cerana. Koloni 1, sisi A. ML Gambar 17 Sisir sarang A. cerana Gambar 18 Tahapan singkat acetolysis.