UNIVERSITAS GADJAH MADA LABORATORIUM GENETIKA DAN PEMULIAAN

Transkripsi

1 Halaman : 1 dari 5 METODE PREPARASI KROMOSOM HEWAN DENGAN METODE SQUASH 1. RUANG LINGKUP Metode ini digunakan untuk penentuan jam pembelahan sel dan jumlah kromosom. 2. ACUAN NORMATIF Amemiya, C.T., J.W. Bickham, J.R. Gold A Cell Culture Technique For Chromosome Preparation in Cyprinid Fishes. Copeia1: Aristya, G.R., Daryono, B.S., Handayani, N.S.N., dan Arisuryanti, T Karakterisasi Kromosom Tumbuhan dan Hewan. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. Ostergren, G., and Heneen, W.K A Squash Technique For Chromosome Morphological Studies. Insitute of Genetics,University of Lund, Sweden. Suryo Sitogenetika. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta 3. ISTILAH DAN DEFINISI A. Larutan kolkisin 2% Larutan yang mempunyai kadar kolkisin sebanyak 2% dalam akuades. Larutan ini berfungsi sebagai anti mitotic agent. B. Larutan hipotonik potassium klorida (KCl) 0,56% Larutan yang mempunyai kadar potassium klorida (KCl) dalam akuades. larutan yang mempunyai kadar Asam Asetat Glasial (AAG) sebanyak 45% dalam akuades. Larutan AAG 45% ini berfungsi sebagai larutan fiksatif sel. C. Larutan Carnoy Larutan Carnoy merupakan larutan yang terdiri dari campuran methanol dengan asam asetat glasial (3:1). D. Larutan Giemsa 2% Larutan yang mempunyai kadar Giemsa 20%. Larutan Giemsa berfungsi sebagai senyawa yang dapat berikatan dengan kromosom sehingga akan meningkatkan visualisasi kromosom pada saat pengamatan menggunakan mikroskop.

2 Halaman : 2 dari 5 E. indeks sentromer (IS) panjang lengan pendek kromosom (p) dibagi panjang kromosom (p+q) dikali 100. Perhitungan IS ini bertujuan dalam klasifikasi bentuk-bentuk kromosom. F. karyogram suatu gambar pengaturan dari set kromosom somatis individu (e.g. Hewan normal= 2n) berdasarkan jumlah dan disusun berdasarkan IS (letak sentromer) kromosom. 4. CARA UJI 4.1.Prinsip Sampel Hewan (e.g. darah) ditambahkan larutan kolkisin 2% untuk menghentikan proses pembelahan sel dan depolimerisasi benang-benang spindle, suspensi darah yang terbentuk lalu disentrifuse untuk mengendapkan sel darah putih, supernatan dibuang lalu digantikan dengan larutan KCl 0,56% lalu difiksasi dengan larutan Carnoy. Proses penggantian supernatan dilakukan dengan cara sentrifugasi sampel terlebih dahulu. Penggantian supernatan dilakukan tiga kali, kemudian suspensi yang terbentuk dipreprasi dengan teknik tetes ke gelas benda pada ketinggian 20 cm. Cairan suspensi yang tersebar pada gelas benda kemudian dikering-anginkan pada suhu ruang lalu diberi pewarna giemsa 2% selama 20 menit lalu dibilas pada air pengalir. 4.2.Bahan a) Larutan kolkisin 2% b) Larutan potassium klorida (KCl) 0,56% c) Larutan Carnoy d) Akuades e) Gliserin f) Kutex g) Larutan Giemsa

3 Halaman : 3 dari Peralatan a) labu ukur 100 ml; b) gelas ukur 50 ml; c) gelas ukur 100 ml; d) tabung gelap; e) gelas benda; f) gelas penutup; g) suntikan; h) botol flakon; j) pipet tetes (tumpul); k) pipet penghisap; l) kulkas; m) mikroskop; n) pensil; o) software AutocadMap; p) kertas tissue; q) cawan petri 4.4.Persiapan Pengujian Sampel darah hewan diambil lalu ditambahkan kolkisin 20% yang berfungsi sebagai anti mitotic agent. Tiap 30 menit, sampel digoyang-goyang perlahan agar kolkisin bekerja lebih merata. 4.5.Prosedur Pengujian 1. Suspensi sel yang terbentuk kemudian dimasukkan ke dalam botol sentrifuse untuk disentrifugasi dengan kecepatan 750 gravitation (G) selama 10 menit. 2. Supernatan dibuang dan diganti dengan larutan hipotonik potasium klorida (KCl) 0,56% sebanyak 4 ml serta dibiarkan selama 1 jam sambil diaduk dengan hati-hati setiap 15 menit. 3. Setelah itu 2 ml larutan Carnoy ditambahkan ke dalam larutan dan disentrifuse kembali dengan kecepatan dan waktu yang sama. 4. Proses sentrifuse dan pembuangan supernatan diulangi 2 kali. 5. Pelet yang terbentuk hasil sentrifuse terakhir difiksasi kembali dengan larutan Carnoy sebanyak 1-1,5 ml. 6. Stok suspensi sel darah kemudian dipindahkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml. 7. Stok suspensi sel ini dapat disimpan dalam refrigerator dan diaduk dengan pipet jika akan digunakan. 8. Pembuatan preparat dan pewarnaan dilakukan dengan cara meneteskan suspensi sel di atas gelas benda bersih dari ketinggian sekitar cm.

4 LABORATORIUM PENELITIAN DAN PENGUJIAN TERPADU Halaman : 4 dari 5 9. Preparat dibiarkan kering pada suhu kamar. Setelah itu preparat diwarnai dengan Giemsa 2 % selama 20 menit pada suhu kamar. 10. Pewarnaan dilakukan dengan cara meneteskan Giemsa di atas preparat hingga menutupi seluruh permukaannya. 11. Preparat didiamkan selama 20 menit, selanjutnya preparat dicuci dengan akuades yang mengalir sampai giemsa terbilas dengan sempurna. Lalu dikering-anginkan kembali lalu ditambahkan gliserin untuk meningkatkan indeks bias kemudian ditutup menggunakan gelas penutup. Proses menyegelan gelas penutup dapat menggunakan kutex pada bagian tepi gelas benda. 12. Preparat diberi label dan dapat disimpan dalam kotak preparat pada suhu kamar. 4.6.Pengamatan dan Pemotretan 1. Setelah preparasi selesai, preparat diamati di bawah mikroskop cahaya di Laboratorium Genetika Fakultas Biologi UGM dengan perbesaran 10x, 40x, dan 100x untuk mengamati fase mitosis yang terjadi 2. Pemotretan dilakukan ketika perbesaran 40x menggunakan kamera digital 3. Berdasarkan gambar tersebut kemudian diamati dan ditentukan jenis fase mitosis yang tampak 4. Selanjutnya, preparat juga diamati menggunakan mikroskop milik LPPT UGM dengan perbesaran 100x, agar kromosom pada fase prometafase terlihat jelas 5. Dari sekian foto, diambil foto yang menunjukkan fase prometafase yang paling jelas untuk dijadikan dasar dalam menghitung jumlah kromosom. Isi Dokumen ini tidak diperkenankan untuk disalin atau digandakan tanpa seijin dari Manajer Puncak Laboratorium Penelitian Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada.

5 LABORATORIUM PENELITIAN DAN PENGUJIAN TERPADU Halaman : 5 dari 5 5. PENGENDALIAN MUTU Gunakan mikroskop dengan perbesaran tinggi agar kromosom yang diamati tampak jelas saat dipotret. Lakukan preparasi triplo untuk kontrol presisi analisis. Nama Disiapkan Oleh Diperiksa Oleh Disahkan Oleh Subakir Ganies Riza Aristya, S.Si., M.Sc. Dr. Niken Satuti Nur Handayani, M.Sc. Tanggal 26 Oktober Oktober Oktober 2015 Isi Dokumen ini tidak diperkenankan untuk disalin atau digandakan tanpa seijin dari Manajer Puncak Laboratorium Penelitian Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada.