BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Waktu pelaksanaan pada bulan Desember 2011 hingga September 2012. Peremajaan Isolat Isolat bakteri R. pickettii TT47 (isolat koleksi Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Proteksi Tanaman, IPB) dibiakkan pada media Luria Agar (LA) (Pancreatic Digest of Casein 10 g, NaCl 5 g, Yeast Extract 5 g, agar 15 g, aquades 1 L) pada ph 7 dalam kondisi suhu ruangan. Isolat E. coli S17-1λpir (koleksi dari Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, IPB) dibiakkan juga pada media LA yang ditambahkan antibiotik kanamisin dan ampisilin dengan konsenterasi masing-masing 50 µg/ml. Selanjutnya, isolat R. solani (isolat koleksi Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Proteksi Tanaman, IPB) ditumbuhkan pada media Potato Dextrose Agar (PDA) (dextrose 20 g, kentang 200 g, agar 15 g, aquades 1 L). Baik E. coli S17-1λpir dan R. solani ditumbuhkan pada suhu ruangan dengan ph 7. Pengujian Antagonisme R. pickettii terhadap R. solani Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan antagonis R. pickettii terhadap R. solani. Biakan bakteri R. pickettii untuk pengujian antagonisme ditumbuhkan pada LA selama 3-5 hari dan biakan R. solani ditumbuhkan pada PDA selama 3-5 hari juga. Selanjutnya, kedua biakan ditumbuhkan secara bersamaan pada PDA. Posisi biakan bakteri R. pickettii digoreskan 3 cm dari bagian tepi cawan petri membentuk garis lurus vertikal, sedangkan satu bulatan agar (d=0.5 cm) R. solani ditumbuhkan dengan posisi yang berseberangan dengan koloni R. pickettii dan berjarak 3 cm dari tepi cawan petri. Kemampuan penghambatan R. pickettii dapat diukur dengan perhitungan persentase penghambatan seperti di bawah ini.
9 Keterangan: R1= panjang pertumbuhan miselium cendawan ke arah bakteri; R2= panjang pertumbuhan miselium cendawan ke arah berlawanan bakteri menuju tepi cawan. Keterangan: A B A B R1 = koloni R. solani = koloni R. pickettii = panjang pertubuhan miselium ke arah bakteri R2 = panjang miselium ke arah R2 R1 berlawanan dengan bakteri menuju ke tepi cawan. Gambar 2 Uji antibiosis R. pickettii terhadap R. solani dengan metode dual culture. Uji Sensitivitas R. pickettii terhadap Antibiotik Kanamisin Satu loop koloni R. pickettii ditumbuhkan pada Luria Broth (LA tanpa agar) dengan ph 7 dan diinkubasi pada mesin shaker dengan kecepatan 100 rpm selama 24 jam. Sebanyak 100 µl R. pickettii disebar secara merata pada LA. Kertas saring steril direndam selama 15 menit di dalam kanamisin dengan konsenterasi 50 µg/ml. Selanjutnya, kertas saring diangkat dengan pinset dan dikeringanginkan beberapa saat, kemudian diletakkan di LA. Biakan diinkubasi pada suhu ruangan selama 24 jam dan diamati zona penghambatan yang ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening. C Keterangan: A ( ) = hamparan koloni R. pickettii pada media LA B ( ) = cakram yang telah direndam kanamisin A B C ( ) = zona bening yang terbentuk Gambar 3 Uji sensitivitas R. pickettii terhadap antibiotik kanamisin.
10 Mutagenesis R. pickettii dengan Transposon put Mini-Tn5Km1 Transposon mutagenesis dilakukan dengan metode konjugasi antara bakteri antagonis R. pickettii sebagai resipien (penerima) dengan E. coli S17-1λpir yang merupakan pembawa plasmid put Mini-Tn5Km1 sebagai donor (Wahyudi et al. 1998). Bakteri R. pickettii ditumbuhkan selama 24 jam (ph 7, suhu ruangan, 100 rpm) pada LB hingga konsentrasi sel menjadi 1.5 10 8 cfu/ml. Sel R. pickettii dipanen dengan cara disentrifugasi selama 8 menit, kecepatan 10 000 rpm dengan suhu 20ᴼC. Setelah itu, supernatan dibuang dan dicuci dengan NaCl 0.85% sebanyak 3 kali. E. coli S17-1λpir ditumbuhkan pada LB yang telah ditambahkan kanamisin dan ampisilin dengan konsenterasi 50 µg/ml selama 24 jam hingga diperoleh konsentrasi sel 4.08 10 10 cfu/ml (ph 7, suhu ruangan, 100 rpm). Pemanenan dan pencucian sel dilakukan sama seperti metode pada R. pickettii di atas (Ratdiana 2011). Kedua pelet bakteri diresuspensikan dengan 40 µl LB, suspensi bakteri dicampurkan dan diteteskan pada membran steril yang diletakkan di atas LA dan selanjutnya diinkubasi selama 24 jam. Membran dimasukkan ke dalam tabung yang telah terisi 1 ml NaCl 0.85% dan kemudian dikocok dengan vorteks. Setelah selesai, suspensi bakteri pada tabung dimasukkan ke dalam tabung ependorf steril. Sebanyak 100 µl suspensi bakteri dari ependorf diencerkan berseri dari pengenceran 10-1 hingga 10-10 pada tabung ependorf steril dan 100 µl kultur bakteri pengenceran berseri tersebut disebar secara merata pada LA yang telah ditambahkan kanamisin dengan konsenterasi 50 µg/ml. Transkonjugan R. pickettii ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan koloni pada media tersebut. Seluruh koloni transkonjugan R. picketii dimurnikan pada LA yang telah ditambahkan kanamisin dengan konsenterasi 50 µg/ml. Koloni transkonjugan selanjutnya dapat diuji sifat antagonismenya untuk melihat peran aktivitas penghambatan pertumbuhan R. solani. Seleksi Transkonjugan R. pickettii. Seleksi transkonjugan R. pickettii dilakukan dengan menggunakan PDA ditumbuhkan bersama-sama dengan R. solani. Satu bulatan agar yang ditumbuhi R. solani diletakkan pada bagian tengah cawan. Sebanyak 8 jenis transkonjugan R. pickettii yang berbeda jenis digores
11 dengan jarak 3 cm dari koloni R. solani. Perlakuan juga dibandingkan dengan pertumbuhan dan penghambatan R. pickettii kontrol. Perlakuan yang sama dilakukan untuk jenis transkonjugan R. pickettii yang lainnya. Zona penghambatan pertumbuhan miselium R. solani dibentuk oleh jenis transkonjugan R. pickettii yang memiliki sifat antagonis tinggi. Isolat transkojugan yang memiliki potensi penghambatan kemudian digunakan kembali untuk uji antagonisme dual culture terhadap R. solani pada PDA yang telah ditambahkan kanamisin berkonsenterasi 50 µg/ml. Seleksi dipilih berdasarkan kemampuan dalam menghambat pertumbuhan R. solani yang ditunjukkan dengan adanya proses kerusakan pada jaringan miselia cendawan yang tumbuh di dekat isolat transkonjugan, perubahan warna pada miselia cendawan, dan yang terakhir adalah tebal dan tipis perkembangan miselia cendawan. Pengujian Antagonisme antara Transkonjugan R. pickettii dengan R. solani Transkonjugan R. pickettii terpilih digores terlebih dahulu pada PDA dengan ph 7 yang telah ditambahkan kanamisin berkonsenterasi 50 µg/ml dengan jarak 3 cm dari tepi petri. Setelah biakan transkonjugan R. pickettii berumur 3 hari, 1 bulatan yang ditumbuhi R. solani dengan diameter 0.5 cm berumur 3 hari diletakkan berseberangan terhadap transkonjugan pada PDA dengan jarak 3 cm dari tepi petri. Posisi keduanya sejajar satu sama lain. Hal yang sama ini juga dilakukan pada transkonjugan R. pickettii lain. R. pickettii tipe liar digunakan sebagai perlakuan pembanding (kontrol). Jenis transkonjugan yang memiliki persentase penghambatan pertumbuhan miselia R. solani yang besar dapat digunakan untuk uji selanjutnya. Konfirmasi Penyisipan Plasmid put Mini-Tn5Km1 pada Genom Transkonjugan R. pickettii dengan Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) Isolasi DNA Genom Transkonjugan R. pickettii Tn5Km1. Transkonjugan R. pickettii yang terpilih dibiakkan pada LB 3 ml yang telah ditambahkan kanamisin dengan konsenterasi 50 µg/ml selama 48 jam. Biakan dimasukkan ke dalam ependorf 1.5 ml dan disentrifugasi pada suhu 20ᴼC selama 15 menit dengan kecepatan 10 000 rpm. Pelet yang diperoleh kemudian diresuspensikan dengan 250 µl buffer TE yang telah dicampurkan lisozim 5 mg/ml, ependorf dikocok
12 berulang kali untuk mempercepat lisis sel. Selanjutnya, suspensi diinkubasi pada 37ᴼC selama 30 menit menggunakan water shaker bath. Proses lisis bakteri dilanjutkan dengan penambahan 50 µl Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 10%, kemudian ependorf dikocok kembali berulang-ulang. Selanjutnya, suspensi diinkubasi pada suhu 37ᴼC selama 1 jam dengan water shaker bath. Sebanyak 65 µl NaCl 5 M dan 80 µl CTAB-NaCl ditambahkan ke dalam suspensi, kemudian diinkubasi lagi pada suhu 65ᴼC selama 20 menit, tabung kembali dikocok berulang-ulang secara perlahan-lahan. Purifikasi DNA dan pemisahan debris sel dilakukan dengan ditambah kloroform isoamil (24:1) sebanyak equal volume sebelumnya (450 µl), kemudian dikocok kuat selama 30 menit. DNA dipisahkan dari debris sel dengan cara disentrifugasi pada suhu 20ᴼC selama 15 menit dengan kecepatan 11 000 rpm. Untuk mengendapkan DNA, supernatan sebanyak 450 µl yang didapatkan kemudian ditambahkan 450 µl isopropanol dingin dan dibantu dengan disentrifugasi selama 20 menit dengan suhu 4ᴼC dengan kecepatan 12 000 rpm. Kemudian, pelet dicuci dengan 70% ETOH, supernatan dibuang. Pelet dikeringkan dengan membuka penutup dan ditutup dengan kertas tisu selama satu malam. DNA pelet dilarutkan dengan buffer TE 100 µl dan dapat disimpan pada mesin freezer dengan suhu -20ᴼC. Ampilifikasi Sisipan Tn5Km1 pada Genom R. pickettii dengan PCR. Sebanyak 1 µl larutan DNA dimasukkan ke dalam ependorf steril. Selanjutnya, komponen berikut ditambahkan, yaitu: primer forward (Km0: 5 -ACA CTG ATG AAT GTT CCG TTG-3 ) 40 pmol sebanyak 1 µl, primer reverse (Km1: 5 -ACC TGC AGG CAT GCA AGC TTC-3 ) 40 pmol sebanyak 1 µl, 2x Dream Taq Green PCR master mix 12.5 µl, dan dd H 2 O ditambahkan hingga total volume dengan larutan DNA menjadi 25 µl. Suspensi tersebut dicampur hingga merata dan dimasukkan ke dalam mesin PCR. Proses amplifikasi dilakukan pada kondisi suhu pradenaturasi 95ᴼC selama 5 menit. Proses amplifikasi kemudian dilanjutkan sebanyak 30 siklus dengan tahap denaturasi 95ᴼC selama 2 menit, primer annealing pada suhu 60ᴼC selama 1 menit, dan primer ekstensi dilakukan pada suhu 72ᴼC selama 1 menit. Setelah 30 siklus, proses PCR diakhiri dengan
13 tambahan ekstensi akhir pada suhu 72ᴼC selama 10 menit. Selanjutnya, hasil PCR dapat digunakan untuk proses selanjutnya. Proses selanjutnya adalah elektroforesis hasil PCR pada agarose yang ditambahkan EtBr, kemudian proses running diatur pada tegangan 75 Volt selama 45 menit. Setelah selesai, hasil dapat dilihat dengan mesin UV transiluminator.