BAB V METODOLOGI 5.1 Bahan dan Alat yang Digunakan 5.1.1 Bahan yang digunakan : Substrat yang dignakan dalam penelitian adalah limbah cangkang rajungan yang diperoleh dari pasar Tambak Sari, Semarang. Inokulum yang digunakan untuk fermentasi limbah cangkang rajungan yaitu Lactobacillus acidopilus dan Saccharomyces cerevisiae. Bahan lain yang digunakan adalah aquadest, tauge, agar-agar, sukrosa, NaCl, NaOH, Indikator pp, formalin 40%, kalium oksalat. 5.1.2 Alat yang digunakan : Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoclave, pengduk, kaca arloji, buret, corong, kertas saring, neraca digital, tabung kaca, gelas beaker, gelas ukur, bunsen, cawan petri, kertas ph, pipet tetes, labu takar, inkubator. 5.2 Variabel Percobaan 5.2.1 Variabel Tetap Tabel 2. Variabel Tetap No. Bahan 1. Cangkang Rajungan 2. Aquades 3. Lactobacillus acidopilus 4. Saccharomyces cerevisiae Jumlah 15 Gram 150 ml 3% 2% 23
24 5.2.2. Variabel Bebas Tabel 3. Variabel Bebas Lama Fermentasi Sampel Lactobacillus acidopilus Saccharomyces cerevisiae 1 1 Hari 5 Hari 2 2 Hari 4 Hari 3 3 Hari 3 Hari 4 4 Hari 2 Hari 5 5 Hari 1 Hari 5.3 Cara Kerja 5.3.1 Pembuatan Sampel 1. Sterilisasi 100 gram limbah cangkang rajungan di dalam autoclave selama 15 menit dengan suhu 121 C dan tekanan 1 atm. 2. Tiriskan lalu hitung kandungan bahan kering substrat. 3. Masukan masing-masing 20 gram limbah cangkang rajungan ke dalam 5 tabung kaca dan tambahkan aquades 200 ml 4. Diinokulasi dengan Lactobacillus acidopilus 3% (dari jumlah bahan kering) kemudian aduk hingga homogen lalu tutup tabung kaca sehingga kondisi menjadi anaerob. 5. Inkubasi sampel di dalam rak fermentor dengan lamanya hari sesuai dengan veriabel Lactobacillus acidopilus. 6. Setelah waktu yang telah ditetapkan selesai lalu ukur ph dan hitung jumlah koloni mikroba dengan metode TPC (Total Plate Count)
25 7. Selanjutnya limbah cangkang ajungan diinokulasikan lagi dengan Saccharomyces cerevisiae 2 % (dari jumlah bahan kering) lalu aduk hingga homogen. 8. Inkubasi kembali sampel di dalam inkubator dengan lamanya hari sesuai dengan veriabel Saccharomyces cerevisiae. 9. Setelah waktu yang telah ditetapkan selesai lalu ukur ph dan hitung jumlah koloni mikroba dengan metode TPC (Total Plate Count) 10. Sterilkan produk fermentasi dengan autoclave selama 15 menit pada suhu 121 C dengan tekanan 1 atm. 11. Analisis kandungan protein 5.3.2 Penghitungan Jumlah Mikroba dengan metode Total Plate Count 1. Masak tauge 25 gram didalam 500 ml aquadest 2. Saring filtrat rebusan dan masukkan kedalam gelas beaker sebanyak 150 ml 3. Timbang agar-agar dan gula sebanyak 5 gram 4. Panaskan filtrat diatas hot plate lalu masukkan agar-agar dan gula 5. Tambahkan CaSO4 0,1 gram 6. Setelah mendidih angkat gelas baeker dan ukur ph, jika ph >5 tambahkan HCL 7. Tuangkan larutan kedalam cawan petri 8. Panaskan jarum ose hingga berpijar 9. Ambil sampel mikroba yang akan di uji 10. Pindahkan kedalam cawan petri
26 11. Tutup cawan petri dan lapisi dengan kertas 12. Masukan cawan petri kedalam incubator selama dua hari dan amati perkembangannya 13. Hitung jumlah bakteri yang ada : Populasi Bakteri 5.3.3 Analisis Kandungan Protein dengan Metode Formol 5.3.3.1 Cara Pembuatan Sampel 1. Timbang 10 gram cangkang rajungan yang sudah halus di neraca digital. 2. Masukan kedalam gelas beaker, tambahkan aquades 15 ml. 3. Kemudian diencerkan menjadi 100 ml di dalam labu takar. 4. Saring larutan dengan kertas saring, filtrat merupakan larutan protein. 5.3.3.2 Uji Sampel 1. Ukur 10 ml larutan sampel (larutan protein) dan masukkan kedalam erlenmeyer. 2. Tambahkan 0,4 ml larutan K-oksalat jenuh (1:3) dan 3 tetes indikator pp 1%. Gojog lalu diamkan 2 menit 3. Titrasi larutan sampel dengan larutan NaOH 0,1 N sampai berwarna merah jambu (titrasi pertama), catat volume NaOH yang digunakan. 4. Setelah warna tercapai, tambahkan 2 ml larutan formaldehide 40% dan titrasi kembali dengan larutan NaOH 0,1 N sampai berwana merah jambu (pink). setelah
27 warna tercpai catat banyaknya larutan NaOH 0,1 N yang digunakan pada titrasi kedua. 5.3.3.3 Titrasi Blanko 1. Ukur 20 ml aquadest, masukkan kedalam erlenmeyer. 2. Tambahkan 0,4 ml larutan K-oksalat jenuh dan 3 tetes indikator pp 1%. Gojog lalu diamkan 2 menit 3. Titrasi larutan sampel tersebut dengan larutan NaOH 0,1 N sampai berwarna merah jambu (titrasi pertama), catat banyaknya larutan NaOH 0,1 N yang digunakan untuk titrasi (titrasi pertama). 4. Setelah warna tercapai,ditambahkan 2 ml larutan formaldehide 40% dan dititrasi kembali dengan larutan NaOH 0,1 N sampai berwana merah jambu (pink). Catat banyaknya larutan NaOH 0,1 N yang digunakan untuk titrasi (titrasi kedua). 5.3.3.4 Rumus Perhitungan 1. Kandungan protein Kandungan Protein = A x N NaOH x 14,008 x fk x 100% B x 10 Keterangan: N NaOH = Normalitas NaOH 14,008 = Masa atom nitrogen A B =Titrasi formol (titrasi sampel-titrasi blanko) = Berat sampel (g) Fk = Faktor konversi (6,25)
28 Bahan Baku (Limbah Cangkang Rajungan) Sterilisasi Lactobacillus acidopilus, dilanjutkan dengan Saccharomyces cerevisiae Fermentasi Perhitungan J umlah Mikroba Metode TPC Analisa Kandungan Protein Gambar 3. Alur Proses Analisis Limbah Cangkang Rajungan
23