41 III BAHAN DAN METODE PENELITIAN 3.1 Bahan Penelitian 3.1.1 Bahan Percobaan Bahan percobaan yang digunakan adalah 36 buah ovarium yang berasal dari 18 ekor domba betina dengan umur 1- tahun dan telah dipotong di RPH Cidurian. 3.1. Bahan dan Perlengkapannya (1) Media Transportasi Natrium klorida fisiologis (NaCl) 0,9% (B-Braun), digunakan untuk menghilangkan kotoran yang menempel pada ovarium ketika diambil dari tubuh ternak, Penicillin 100 IU/ml (G-Meiji), digunakan untuk menghilangkan bakteri gram positif (+), Steptomycin 0,1 mg/ml (G-Meiji), digunakan untuk menghilangkan bakteri gram negatif (-) yang disimpan pada suhu 37 0 C-38 0 C. () Perlengkapan Pengambilan Ovarium 1. Gunting, digunakan untuk memisakan ovarium dari tubuh ternak. Termometer, digunakan untuk mengukur suhu media transportrasi di termos 3. Termos, digunakan sebagai tempat penyimpanan plastik zipper yang telah berisi ovarium 4. Plastik zipper, sebagai wadah media transportrasi dan ovarium, digunakan menyimpan ovarium lalu dimasukan ke dalam termos 5. Spidol, digunakan sebagai alat untuk mencatat yang digunakan untuk identifikasi ovarium dari masing-masing betina yang sudah dipotong.
4 (3) Perlengkapan Pengukuran Diameter Folikel 1. Alat pencatatan, digunakan untuk mencatat dan menggambar posisi folikel sebelum dan setelah di preservasi. Jangka sorong, digunakan untuk mengukur diameter folikel 3. Kamera, digunakan untuk mendokumentasi folikel yang diukur 4. Pinset, digunakan untuk mengambil ovarium di dalam wadah dan sebagai penjepit ovarium. (4) Perlengkapan Preservasi Ovarium 1. Cawan petri, digunakan sebagai tempat saat preservasi ovarium. Stopwatch, digunakan untuk menghitung waktu selama preservasi 3. Termometer digital, digunakan untuk mengetahui suhu selama preservasi ovarium 4. Lemari pendingin (kulkas), digunakan sebagai tempat penyimpanan ovarium. (5) Perlengkapan Koleksi Oosit 1. Cawan petri, digunakan sebagai tempat meletakkan ovarium. Mikro pipet, digunakan untuk memindahkan oosit yang telah dikoleksi 3. Pinset, digunakan untuk menjepit ovarium ketika mengkoleksi oosit 4. Jarum suntik merek (One Med )1 ml, digunakan untuk mengambil cairan yang ada di dalam folikel (metode aspirasi) 5. Student/research microscope stereo merk (Yashima, Japang) dengan menggunakan pembesaran 6 X 10, digunakan untuk melihat dan menghitung jumlah kualitas oosit yang dihasilkan.
43 (6) Perlengkapan Evaluasi Oosit 1. Kaca arloji dengan diameter 10 cm, digunakan sebagai tempat mengelompokan oosit sesuai kriteria kualitasnya. Mikroskop stereo merk (Yashima, Jepang), digunakan untuk mengevaluasi oosit 3. Mikro pipet, digunakan untuk memindahkan oosit ke kaca arloji. 3. Metode Penelitian 3..1 Prosedur Penelitian Prosedur kerja penelitian ini yaitu (Ilustrasi 1) : 1. Pengambilan Ovarium Ovarium diambil dari domba lokal betina di RPH Cidurian Jl. Soekarno- Hata Bandung. Ovarium dimasukan ke dalam plastik zipper yang berisi media trasportrasi seperti Natrium klorida fisiologis (NaCl) 0,9% yang ditambahkan dengan penicillin 100 IU/ml serta streptomycin 0,1 mg/ml disimpan dalam termos dengan suhu suhu 37 0 C-38 0 C.. Pengukuran Diameter Folikel Folikel diukur menggunakan jangka sorong. Pengukuran dilakukan dua kali yaitu sebelum preservasi (awal) dan setelah preservasi (akhir). Folikel difoto dengan kamera dan digambar untuk memudahkan identifikasi perubahan ukuran diameter folikel. 3. Preservasi Ovarium Preservasi ovarium dilakukan di dalam lemari pendingin (kulkas) dengan suhu 6 0 C-9 0 C selama 4 jam. 1. Preservasi ovarium pada media (Natrium klorida fisiologis (NaCl) 0,9% + penicillin 100 IU/ml + streptomycin 0,1 mg/ml)
44. Preservasi ovarium pada media (Natrium klorida fisiologis (NaCl) 0,9% + penicillin 100 IU/ml + streptomycin 0,1 mg/ml) dan ditambahkan dengan antioksidan glutathione 1 mm 3. Preservasi ovarium pada media (Natrium klorida fisiologis (NaCl) 0,9% + penicillin 100 IU/ml + streptomycin 0,1 mg/ml) dan ditambahkan dengan antioksidan asam askorbat 0,05 mg/ml. 4. Koleksi Oosit Koleksi oosit menggunakan metode aspirasi, menggunakan jarum merek (One Med ) 1 ml, satu persatu ovarium dikoleksi oositnya dengan cara menyuntikan jarum pada bagian sebelah permukaan folikel, kemudian mengarahkan jarum pada folikel untuk mengambil cairan yang terdapat dalam folikel dan kemudian oosit dikelompokan berdasarkan kualitasnya grade A, B, C dan D. 5. Evaluasi Kualitas Oosit Oosit dipindahkan dengan mikro pipet ke cawan petri sesuai kriteria kualitasnya. Evaluasi kualitas oosit menggunakan mikroskop stereo merk (Yashima, Japan).
45 Pengambilan ovarium di RPH Cidurian Pengukuran diameter folikel sebelum preservasi Proses preservasi ovarium di dalam media selama 4 jam Pengukuran diameter folikel setelah preservasi Koleksi dan evaluasi kualitas oosit Ilustrasi 1. Alur Prosedur Penelitian Keterangan : = Media preservasi tanpa antioksidan = Media preservasi + antioksidan Glutathione 1 mm = Media preservasi + antioksidan asam askorbat 0,05 mg/ml.
46 3.. Peubah yang Diamati dan Pengukuran Peubah yang diamati dalam penelitian ini adalah : 1. Diameter folikel yang pengukurannya dibagi menjadi tiga kriteria yaitu: A = ukuran kecil (< mm) B = ukuran sedang (-5 mm) C = ukuran besar (>5 mm). Jumlah kualitas oosit grade A, B, C dan D pada domba lokal dinilai berdasarkan lapisan sel kumulus dan kondisi sitoplasma yang dikelompokan menjadi empat kriteria (Gordon, 003) (Ilustrasi ) : 1) Kualitas oosit grade A Oosit yang memiliki lima lapis atau lebih sel kumulus dengan sitoplasma yang homogen dan berwarna hitam ) Kualitas oosit grade B Oosit yang memiliki kurang dari lima lapisan sel kumulus dengan sitoplasma yang homogen berwarna hitam 3) Kualitas oosit grade C Oosit yang terlihat masih sedikit lapisan sel kumulus, zona pellucida yang terlihat dan sitoplasma yang tidak homogen 4) Kualitas oosit grade D Oosit yang memiliki sitoplasma transparan, zona pellucida terlihat atau bahkan tidak sama sekali dan lapisan sel kumulus hampir hilang bahkan hilang seluruhnya.
47 Ilustrasi. Morfologi Kualitas Oosit Grade A, B, C dan D (Gordon, 003) 1..3 Perlakuan yang Diberikan Perlakuan yang diberikan pada penelitian ini sebanyak 3 perlakuan dan 6 kali ulangan sehingga didapat 18 unit data. Perlakuan yang diberikan yaitu : = Preservasi ovarium pada media preservasi tanpa antioksidan = Preservasi ovarium pada media preservasi + antioksidan Glutathione 1 mm = Preservasi ovarium pada media preservasi + antioksidan asam askorbat 0,05 mg/ml.
48 1..4 Rancangan Percobaan dan Analisis Statistik Penelitian dilakukan secara eksperimental dengan rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL), dengan ulangan sebanyak enam kali. Setiap ulangan terdiri dari satu ekor domba (dua ovarium). (1) Diameter Folikel (uji F). Data perubahan diameter folikel dianalisis menggunakan tabel sidik ragam Model matematika yang digunakan adalah sebagai berikut : Yij = µ +α i + ε ij Keterangan : Y ij = Respon hasil pengamatan akibat terhadap perlakuan ke-i ulangan ke-j μ = Nilai tengah / rata-rata umum α i = Pengaruh perlakuan ke-i ε ij = Pengaruh komponen galat pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j i = 1,,3 (jumlah perlakuan) j = 1,,3,4,5,6 (jumlah ulangan) Hipotesis yang akan diuji melalui percobaan ini adalah : H0 :, artinya, penambahan antioksidan Glutathione 1 mm pada media preservasi ovarium dapat mempertahankan perubahan diameter folikel lebih kecil atau sama. H1 : >, > artinya, penambahan antioksidan Glutathione 1 mm pada media preservasi ovarium dapat mempertahankan perubahan diameter folikel lebih besar.
49 Asumsi : 1. Nilai ij menyebar normal satu sama lain. Nilai harapan dari ij= 0 3. Ragam dari ij = Jadi, ij NID (0, ) Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan metode sidik ragam. Tabel 1. Tabel Sidik Ragam Sumber Keragaman DB JK KT Fhit Perlakuan t 1 JKP KTP KTP/KTG Galat (r - 1) (t-1) JKG KTG Total rt r JKT - - Sumber : (Gaspersz, 1995) Keterangan: DB = Derajat Bebas JK = Jumlah Kuadrat KT = Kuadrat Tengah JKP = Jumlah Kuadrat Perlakuan JKG = Jumlah Kuadrat Galat JKT = Jumlah Kuadrat Total KTP = Kuadrat Tengah Perlakuan KTG = Kuadrat Tengah Galat Kaidah Keputusan : 1. Jika P 0,05 artinya berbeda nyata (significant), tolak H0. Jika P 0,05 artinya tidak berbeda nyata (non significant), terima H0 Apabila hasil yang diperoleh berbeda nyata, maka dilakukan uji lanjut dengan menggunakan Uji Wilayah Berganda Duncan, dengan rumus : LSR = SSR x Sy ; S y KT galat S r r Keterangan: Sy = Galat Baku KTG = Kuadrat Tengah Galat r = Banyaknya Ulangan LSR = Least Significant Range SSR = Studentized Significant Range
50 Bila selisih antara perlakuan (d) dibandingkan dengan LSR ternyata : 1. Bila d LSR, maka penambahan antioksidan Glutathione 1 mm pada media preservasi ovarium dapat mempertahankan perubahan diameter folikel tidak berbeda nyata.. Bila d > LSR, maka penambahan antioksidan Glutathione 1 mm pada media preservasi ovarium dapat mempertahankan perubahan diameter folikel berbeda nyata (Gaspersz, 1995). () Kualitas Oosit Jumlah kualitas oosit grade A, B, C, dan D yang didapat, di uji dengan uji Chi Kuadrat (x ) untuk bx k sampel independen (Gaspersz, 1995). Hipotesis yang akan diuji melalui percobaan ini adalah : H0 :, artinya, penambahan antioksidan Glutathione 1 mm pada media preservasi ovarium dapat mempertahankan kualitas oosit lebih kecil atau sama H1 : >, > artinya, penambahan antioksidan Glutathione 1 mm pada media preservasi ovarium dapat mempertahankan kualitas oosit lebih besar. Terdapat rumus uji Chi Kuadrat (x ) sebagai berikut : Rumus Chi Kuadrat dengan menggunakan nilai ekspektasi x hit k = j=1 b (f o f h ) i=1 f h
51 Keterangan : x = Chi kuadrat fo = Frekuensi yang diobservasi = Frekuansi yang diharapkan fh db = (b-1)(k-1) Terima H 0 jika x hit < x tabel Tabel. Tata Letak Percobaan 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 13 14 15 16 17 18 Keterangan : = Media preservasi tanpa antioksidan = Media preservasi + antioksidan Glutathione 1 mm = Media preservasi + antioksidan asam askorbat 0,05 mg/ml