BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Sediaan Apus Darah Tepi Tujuan pemeriksaan sediaan apus darah tepi antara lain menilai berbagai unsur sel darah tepi seperti eritrosi, leukosit, dan trombosit dan mencari adanya parasit seperti malaria, tripanosoma, microfilarian dan lain sebagainya. Sediaan apus yang dibuat dan dipulas dengan baik merupakan syarat mutlak untuk mendapatkan hasil pemeriksaan yang baik. Bahan pemeriksaan yang terbaik adalah darah segar yang berasal dari kapiler atau vena, yang dihapuskan pada kaca obyek. pada keadaan tertentu dapat pula digunakan darah EDTA. (Arjatmo Tjokronegoro, 1996) Sediaan apus darah yang baik harus memenuhi syarat yaitu lebar dan panjangnya tidak memenuhi seluruh kaca, ekornya tidak terbentuk seperti bendera robek,secara granula penebalannya nampak berangsur-angsur menipis dari kepala kearah ekor, tidak berlubang-lubang, tidak terputus-putus, tidak terlalu tebal dan pewarnaan yang baik. (Imam Budiwiyono, 1995) Jenis apusan darah: 1. Sediaan darah tipis Ciri-ciri sediaan apus darah tipis yaitu lebih sedikit membutuhkan darah untuk pemeriksaan dibandingkan dengan sediaan apus darah tebal, morfologinya lebih jelas, dan perubahan pada eritrosit dapat terlihat jelas. 5
6 2. Sediaan darah tebal Ciri-ciri sediaan apus darah tebal yaitu lebih banyak membutuhkan darah untuk pemeriksaan dibandingkan dengan sediaan apus darah tipis, jumlah selnya lebih banyak dalam satu lapang pandang, dan bentuknya tidak sama seperti dalam sediaan apus darah tipis. Kriteria kualitas pewarnaan yang baik 1. Makroskopis a. Sediaan darah kelihatan jernih dan transparan b. Warna sel darah merupakan kombinasi warna-warna merah, ungu dan biru c. Bentuk ekor pada preparat tidak runcing d. Preparat tidak terputus-putus e. Preparatnya tidak berlubang-lubang 2. Mikroskopis a. Lapisan darah harus cukup tipis sehingga eritrosit dan leukosit jelas terpisah satu dengan lainnya b. Leukosit tidak boleh menggerombol pada bagian terakhir dari apusan darah c. Hapusan tidak boleh mengandung endapan cat d. Sel leukositnya tidak berlubang-lubang e. Sel leukositnya terwarnai semua
7 B. Morfologi Sel Darahp 1. Sel darah merah (eritrosit). Eritrosit merupakan diskus bikonkaf, bentuknya bulat dengan lekukan pada sentralnya dan berdiameter 7,65 µm. Eritrosit terbungkus dalam membran sel dengan permeabilitas tinggi. Membran ini elastis dan fleksibel, sehingga memungkinkan eritrosit menembus kapiler (pembuluh darah terkecil). Setiap eritrosit mengandung sekitar 300 juta molekul hemoglobin, sejenis pigmen pernapasan yang mengikat oksigen. Volume hemoglobin mencapai sepertiga volume sel. (Ethel Sloane, 2003) Eritrosit merupakan sel yang paling banyak dibandingkan dengan 2 sel lainnya, dalam keadaan normal mencapai hampir separuh dari volume darah. Sel darah merah mengandung hemoglobin, yang memungkinkan sel darah merah membawa oksigen dari paru-paru dan mengantarkannya ke seluruh jaringan tubuh. Oksigen dipakai untuk membentuk energi bagi selsel, dengan bahan limbah berupa karbon dioksida, yang akan diangkut oleh sel darah merah dari jaringan dan kembali ke paru-paru.. 1. Gambar eritrosit normal
8 Kelainan morfologi eritrosit: Kelainan morfologi eritrosit berupa kelainan ukuran (size), bentuk (shape) dan warna (staining characteristics). a. Kelainan ukuran : 1. Mikrosit Sel ini dapat berasal dari fragmentasi eritrosit yang normal seperti pada anemia hemolitik, anemia megaloblastik dan dapat pula terjadi pada anemia difisiensi besi. 2. Makrosit Makrosit adalah eritrosit yang berukuran lebih dari 8 µm. sel ini didapatkan pada anemia megaloblastik. 3. Anisositosis Anisositosis tidak menunjukkan suatu kelainan hematologic yang spesifik. Keadaan ini ditandai dengan adanya eritrosit dengan ukuran yang tidak sama besar dalam sediaan apus darah tepi. Anisositosis jelas terlihat pada anemia mikrositik yang ada bersamaan dengan anemia makrositik seperti pada anemia gizi. ( Arjatmo Tjokronegoro dan Hendra Utama, 1996) b. Kelainan bentuk 1. Ovalosit Ovalosit adalah eritrosit yang berbentuk lonjong. 2. Sperofit Sperofit adalah eritrosit yang berbentuk lebih bulat, lebih
9 kecil dan lebih tebal dari eritrosit normal 3. Schitosit atau fragmentosit Sel ini merupakan pecahan eritrosit. 4. Sel target Eritrosit yang mempunyai masa kemerahan di bagian tengahnya, disebut juga sebagai sel sasaran. 5. Sel sabit atau sickle cell Sel ini didapatkan pada penyakit sel sabit yang homozigot (SS). Sel sabit didapatkan dengan cara eritrosit di inkubasi terlebih dahulu dalam keadaan anoksia dengan menggunakan zat reduktor (Na 2 S 2 O 3 atau Na 2 S 2 O 5 ). 6. Krenasi Sel seperti ini merupakan artefak, dapat dijumpai dalam sediaan apus darah tepi yang telah disimpan 1 malam pada suhu 20 0 C atau eritrosit yang berasal dari washed packed cell. 7. Sel Burr Sel ini adalah eritrosit yang kecil atau fragmentosit yang mempunyai duri satu atau lebih pada permukaan eritrosit. 8. Akantosit Sel ini desebabkan oleh metabolism fosfolipid dari membrane eritrosit. Keadaan tepi eritrosit mempunyai tonjolantonjolan berupa duri.
10 9. Tear drop cell Eritrosit yang mempunyai bentuk seperti tetesan air. 10. Poiklositosis Poiklositosis adalah istilah yang menunjukan bentuk eritrosit yang bermacam-macam dalam sediaan apus darah tepi. 11. Rouleaux Rouleaux tersusun dari 3-5 eritrosit yang membentuk barisan sedangkan auto aglutinasi adalah keadaan dimana eritrosit bergumpal. ( Arjatmo Tjokronegoro dan Hendra Utama, 1996) c. Kelainan warna 1. Hipokrom Eritrosit yang tampak pucat. Eritrosit hipokrom disebabkan kadar hemoglobin dalam eritrosit 2. Polikrom Eritrosit polikrom adalah eritrosit yang lebih besar dan lebih biru dari eritrosit normal. Polikromasi suatu keadaan yang ditandai dengan banyak eritrosit polikrom pada preparat sediaan apus darah tepi, keadaan ini berkaitan dengan retikulositosis. ( Arjatmo Tjokronegoro dan Hendra Utama, 1996) 2. Sel darah putih (leukosit) Jumlahnya lebih sedikit, dengan perbandingan sekitar 1 sel darah putih untuk setiap 660 sel darah merah. Terdapat 5 jenis utama dari sel darah putih yang bekerja sama untuk membangun mekanisme utama tubuh
11 dalam melawan infeksi, termasuk menghasilkan antibodi. Dibedakan berdasarkan ukuran, bentuk nukleus, dan ada tidaknya granula sitoplasma. Sel yang memiliki granula sitoplasma disebut granulosit sedangkan sel tanpa granula disebut agranulosit. a. Granulosit 1) Neutrofil Juga disebut granulosit karena berisi enzim yang mengandung granul-granul, jumlahnya paling banyak. Neutrofil membantu melindungi tubuh melawan infeksi bakteri dan jamur dan mencerna benda asing sisa-sisa peradangan. Ada 2 jenis neutrofil, yaitu neutrofil berbentuk pita (imatur, belum matang) dan neutrofil bersegmen (matur, matang). neutrofil memiliki granula kecil berwarna merah muda dalam sitoplasmanya. Nukleusnya memiliki tiga sampai lima lobus yang terhubungkan dengan benang kromatin tipis. Diameternya mencapai 9 µm samapai 12 µm. ( Ethel Sloane, 2003) Sel netrofil paling banyak di jumpai pada sel darah putih. Sel golongan ini mewarnai dirinya dengan pewarna netral atau campuran pewarna asam dan basa serta tampak bewarna ungu.(irianto,2004)
12 2. Gambar netrofil batang 3. Gambar netrofil segmen 2) Eosinofil Eosinofil Sel ini ukurannya kurang lebih sama dengan netrofil. Bentuk inti umumnya mirip gagang telepon atau kaca mata dengan ukuran yang kurang lebih seragam dan berwarna merah jingga. Sel ini agak sukar ditemukan karena jumlahnya lebih sedikit dari neutrofil. Banyaknya jumlah granula membuat sel ini berwarna lebih gelap. Bentuk inti sel ini merupakan bentuk pada fase eusinofil yang telah dewasa. Granula pada sel ini mengandung
13 protein yang mampu membunuh cacing seperti schistosoma. (Irianto,2004) 4. Gambar eosinofil 3) Basofil Sel ini ukurannya kurang lebih sama dengan neutrofil. Namun sel ini agak sukar dicari karena jumlahnya dalam keadaan normal sedikit, bahkan lebih sedikit dari eosinofil. Bentuk intinya tidak menentu, bahkan sering tidak jelas karena tertutup granula. Kadang juga terlihat berlobus atau berbentuk batang bengkok. Granula sitoplasma berwarna biru kehitaman, ukurannya tidak seragam dan tersebar menutupi inti. 5. Gambar basofil
14 b. Agranulosit 1) Limfosit Ukuran sel ini beragam, ada yang seperti eritrosit dan ada yang sebesar netrofil. Limfosit dengan garis tengah 6-8 mikrometer dikenal sebagai limfosit kecil. Sitoplasma limfosit bersifat basa lemah dan berwarna biru muda pada sediaan yang terpulas. Sitoplasma ini mengandung granul azurofilik. Inti selnya kebanyakan bulat atau terkadang mirip ginjal. Kromatin inti amat padat dan berwarna biru gelap. Sel ini juga relatif sedikit dan berwarna biru langit tanpa granul spesifik, namun pada beberapa sel terlihat granula azurofil yang jika pulasannya baik bewarna ungu kemerahan.(irianto,2004) Limfosit dibagi ke dalam 2 kelompok utama: a. Limfosit B berasal dari sel stem di dalam sumsum tulang dan tumbuh menjadi sel plasma, yang menghasilkan antibodi b. Limfosit T terbentuk jika sel stem dari sumsum tulang pindah ke kelenjar thymus, dimana mereka mengalami pembelahan dan pematangan.di dalam kelenjar thymus, limfosit T belajar membedakan mana benda asing dan mana bukan benda asing. Limfosit T dewasa meninggalkan kelenjar thymus dan masuk ke dalam pembuluh getah bening dan berfungsi sebagai bagian dari sistem pengawasan kekebalan. (Farieh, 2008)
15 6. Gambar limfosit 2) Monosit Monosit merupakan sel leukosit yang besar 3-8% dari jumlah leukosit normal, diameter 9-10 um tapi pada sediaan darah kering diameter mencapai 20 µm atau lebih. Inti biasanya eksentris, adanya lekukan yang dalam berbentuk tapal kuda. Sitoplasma relatif banyak dengan pulasan wrigh berupa bim abuabu pada sajian kering. Granula azurofil, merupakan lisosom primer, lebih banyak tapi lebih kecil. Ditemui retikulim endoplasma sedikit. Juga ribosom, pliribosom sedikit, banyak mitokondria. Apa ratus Golgi berkembang dengan baik, ditemukan mikrofilamen dan mikrotubulus pada daerah identasi inti. Monosit terdapat dalam darah, jaringan ikat dan rongga tubuh. Monosit tergolong fagositik mononuclear (system retikuloendotel) dan mempunyai tempat-tempat reseptor pada permukaan membrannya. Untuk imunoglobulin dan komplemen.(efendi, 2003)
16 7. Gambar monosit c. Kelainan morfologi leukosit 1) Kelainan sitoplasma a) Granulasi toksik (infeksi akut, luka bakar dan intoksikasi) b) Granulasi polimorfonuklear (leukemia dan sindrom mielodisplasia) c) Badan dohle (keracunan, luka bakar dan infeksi berat) d) Batang aurer (leukemia myeloid akut) e) Limpositik plasma biru (infeksi virus dan mononucleosis infeksiosa) f) Smudge sel (leukemia limfosit kronik) g) Vakuolisasi (keracunan dan infeksi berat) 2) Kelainan inti sel a) Hipersegmentasi (anmegaloblastik, infeksi, uremia dan GGK) b) Intipiknotik (sepsis dan leukemia) c) Anomaly pelger huet (leukemia kronik mielodisplastik)
17 3. Platelet (trombosit). Merupakan paritikel yang menyerupai sel, dengan ukuran lebih kecil daripada sel darah merah atau sel darah putih. Sebagai bagian dari mekanisme perlindungan darah untuk menghentikan perdarahan, trombosit berkumpul dapa daerah yang mengalami perdarahan dan mengalami pengaktivan. Setelah mengalami pengaktivan, trombosit akan melekat satu sama lain dan menggumpal untuk membentuk sumbatan yang membantu menutup pembuluh darah dan menghentikan perdarahan. Pada saat yang sama, trombosit melepaskan bahan yang membantu mempermudah pembekuan. (Junquiera,1997) 8. Gambar trombosit C. Pewarnaan Sediaan Darah Macam-macam pewarnaan pada sediaan apus darah menurut Romanowsky ada empat macam pewarnaan yaitu pewarnaan wright s stain, pewarnaan Lieshman,pewarnaan may grunwald dan pewarnaan giemsa.(imam Budiwiyono, 1995)
18 Pewarnaan wright adalah pewarnana untuk sedian darah dengan menggunakan reagen biru metilena dan eosin, yang menghasilkan warna akhir sediaan darah merah muda dan sel darah merah berwarna kuning atau merah muda. (Pudjaatmaka, A.Hadyana.2002) Bagian sel darah dapat jelas dibedakan dengan pewarnaan pappenheim pada film darah (pewarnaan May -Grunwald dan pewarna giemsa).struktur nucleus lebih kurang bersifat basofil dibandingankan sitoplasma, dengan cara tersebut granula dapat diperhatikan dengan baik (Martoprawiro.1986) Giemsa adalah zat warna yang terdiri dari eosin dan metilen azur memberi warna merah muda pada sitoplasma dan metilen biru pada inti leokosit.ketiga jenis zat warna ini dilarutkan dengan metal alcohol dan gliserin.larutan Ini dikemas dalam botol coklat (100-500-1000cc) dan dikenal sebagai giemsa stock yang ph 7. Eosin yang dicampur dengan methilen biru akan menghasilkan pulasan berupa sel darah berwarna merah muda, inti sel darah putih menjadi lembayung tua, protoplasma parasit malaria menjadi biru dan butir kromatin parasit menjadi merah.(hadidjaja,1992) Faktor yang harus diperhatikan untuk mencapai pewarnaan yang baik : 1) Kualitas dari stock giemsa yang digunakan standar mutu a) Stock giemsa yang belum tercemar air. b) Zat warna pada giemsa masih aktif.
19 2) Kualitas dari air pengencer giemsa a) Air pengencer harus jernih b) Derajat keasaman pengencer hendaknya berada 6,8 sampai 7,2 perubahan ph pada larutan berpengaruh pada pewarnaan sel-sel darah 3) Kualitas pembuatan sedian darah Ketebalan sel darah yang akan diwarnai mempengaruhi hasil pewarnaan, semakin berat fixaxi akan semakin sukar bagi larutan giemsa menerobos plasma darah untuk mencapai sel darah merah untuk melakukan proses hemolisa. 4) Kebersihan sedian darah Zat warna yang mengendap dipermukaan pada akhir pewarnaan tertinggal pada sel darah dan mengotorinya.oleh karena itu pada akhir pewarnaan larutan giemsa harus dibilas dengan air yang mengalir. 5) Lakukan pewarnaan. (Depkes RI,1993) Giemsa stock harus diencerkan lebih dulu sebelum dipakai mewarnai sel darah.elemen-elemen zat warna giemsa melarut selama 40-90 menit dengan air atau aquadest atau air buffer.setelah itu semua elemen zat warna akan mengendap dan sebagian lagi balik ke permukaan membentuk lapisan tipis seperti minyak sebab itu giemsa tidak boleh tercemar air. (Depkes RI,1993)
20 D. Pedoman Pemakaian Giemsa 1. Giemsa stock baru boleh diencerkan dengan aquadest atau air buffer sesaat akan digunakan agar diperoleh efek pewarnaan yang optimal. 2. Mengencerkan giemsa sebanyak yang dibutuhkan, sebab bila berlebih terpaksa harus dibuang. 3. Untuk mengambil stock giemsa dari botolnya, menggunakan pipet khusus agar stock giemsa tidak dicemari. 4. Methanol dapat menarik air dari udara, sebab itu stock giemsa harus di tutup rapat dan tidak boleh sering dibuka. Pisahkan giemsa dibotol tetes atau botol kecil dari stock. 5. Pewarnaan giemsa adalah pewarnaan lambat, sehingga hasil baik bila menggunakan giemsa encer. 6. Tolak ukur sebagai dasar perhitungan a) 1cc sama dengan 20 tetes b) Seluruh permukaan kaca sediaan dapat ditutupi cairan sebanyak 1 cc c) Berdasarkan tolak ukur ini dapat dihitung banyaknya giemsa encer yang harus dibuat sesuai dengan kebutuhan terutama bila melakukan pewarnaan. 7. Takaran pewarnaan Untuk melakukan pewarnaan individu pada kegiatan stock giemsa 1 tetes tambah pengencer sepuluh tetes dengan lama pewarnaan 15 20 menit (giemsa 10%) atau stock giemsa 1 tetes ditambah pengencer 1 cc (20 tetes) dengan lama pewarnaan 45 60 menit (giemsa 5%)
21 8. Gunakan air pengencer yang mempunyai PH 6,8 7,2. (Depkes,1993) E. Konsentrasi Pengenceran Giemsa 1. Pembuatan larutan giemsa 5% (1:20), 1 bagian giemsa + 19 bagian aquadest atau buffer. Lakukan pewarnaan dengan larutan giemsa 5% selama 30-45 menit. 2. Pembuatan larutan giemsa 10% (1:10), 1 bagian giemsa + 9 bagian aquadest atau buffer. Lakukan pewarnaan dengan larutan giemsa 10% selama 20-25 menit. 3. Pembuatan larutan giemsa 20% ( 1:5), 1 bagian giemsa + 4 bagian aquadest atau buffer. Lakukan pewarnaan dengan larutan giemsa 20% selama 10-15 menit. (Depkes RI,2007) F. Pengencer Giemsa 1. Larutan Penyangga buffer Suatu larutan yang dapat menahan perubahan ph yang besar ketika ion-ion hydrogen atau hidroksida ditambahkan atau ketika larutan itu diencerkan disebut larutan penyangga atau larutan dapar. (Day And Underwood, 2001:148) Larutan buffer adalah larutan yang memiliki kemampuan untuk mempertahankan PH pada penambahan asam atau basa (Tim Dosen Kimia, 2003)
22 Larutan buffer didefinisikan sebagai campuran asam lemah dengan basa konjugasinya atau basa lemah dengan asam konjugasinya (Achmad, 1996:418) PH yang rendah atau kurang dari 6,8 mengakibatkan sel darah merah lebih banyak mengambil pewarna asam atau eosin, sehingga sel darah merah menjadi lebih merah muda. Lekosit juga akan memperlihatkan bagian-bagian inti yang kurang jelas. (Robert R.Harr,2002) Pembuatan larutan buffer dengan cara melarutkan Na 2 HPO 4.2H 2 O 17,799 gram kedalam beker glass 500 ml dengan aquadest 250 ml homogenkan, kemudian masukan kedalam labu ukur 1000 ml dengan menambahkan aquadest sampai tanda batas dan homogenkan kembali untuk mendapatkan larutan Na 2 HPO 4 0,1 M kemudian Melarutkan NaH 2 PO 4.2H 2 O 15,601 gram kedalam beker glass 500 ml dengan aquadest 250 ml homogenkan, kemudian masukan kedalam labu ukur 1000 ml dengan menambahkan aquadest sampai tanda batas dan homogenkan kembali untuk mendapatkan larutan NaH 2 PO 4 0,1 M. Membuat buffer PH 6,8 dengan cara menghomogenkan larutan Na 2 HPO 4 0,1 M sebanyak 51,1ml dan NaH 2 PO 4 0,1 M sebanyak 48,9 ml. (mulyono, 2006) 2. Aquadest Aquadest adalah air dari hasil penyulingan(diuapkan dan disejukan kembali) dan memiliki kandungan murni H 2 O,sedangkan air mineral tidak murni H 2 O.air suling juga memiliki rumus kimia pada air umumnya yaitu
23 H 2 O yang berarti dalam 1 molekul terdapat 2 atom hydrogen kovalen dan atom oksigen tunggal. Aquadest merupakan larutan yang bebas dari mikroba hidup,baik itu pathogen dan non patogen yang biasanya digunakan untuk campuran bahan dalam laboratorium atau melarutkan obat G. Kerangka Teori Lama pewarnaan Apusan darah Pengenceran Hasil pewarnaan sediaan apus darah SDM Keterangan : Hasil pewarnaan sediaan apus darah dipengaruhi oleh faktor lama pewarnaan, apusan darah, pewarna (jenis, kualitas, pengencer, dll), sumber daya manusia (tingkat ketrampilan, pengecatan dll). H. Kerangka Konsep Pengencer giemsa menggunakan aquadest Pengencer giemsa menggunakan buffer Hasil pewarnaan morfologi sel darah
24 Keterangan: Pengencer giemsa mempengaruhi hasil pewarnaan pada sediaan apus darah. pengencer giemsa dilakukan menggunakan larutan buffer dan aquadest. Pengenceran giemsa berpengaruh pada morfologi sel darah dan dikatakan baik apabila memperlihatkan tidak adanya endapan cat giemsa. Sel eritosit berwarna merah muda, tidak adanya kelainan warna hipokrom atau polikrom lebih dari 10%, granula sel netrofil berwarna ungu, limfosit tanpa granul spesifik berwarna biru langit, limfosit dengan sel terlihat granul azurofil berwarna ungu kemerahan, kromatin inti limfosit padat dan berwarna biru gelap, bagian tepi pada sel trombosit yang dinamakan hialomer berwarna biru muda dan bagian tengah sel trombosit yang berbutir-butir atau dinamakan granulomer berwarna ungu.