3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan mulai Maret 2012 sampai Juli 2012. Proses preparasi sampel dan ekstraksi (maserasi) dilakukan di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku Hasil Perairan. Proses evaporasi ekstrak dan penghitungan rendemen dilakukan di Laboratorium Kimia Organik, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Uji fitokimia dan analisis antimikroba dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Uji total fenol dan antioksidan dilakukan di Laboratorium Biofarmaka (LUB) IPB. 3.2 Bahan dan Alat Bahan utama yang dibutuhkan untuk penelitian ini adalah alga cokelat jenis S. polycystum. Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk ekstraksi S. polycystum meliputi metanol, etil asetat dan n-heksana. Bahan yang digunakan untuk uji fitokimia meliputi pereaksi Meyer, pereaksi Wagner, pereaksi Dragendorff (uji alkaloid), kloroform, anhidra asetat, asam sulfat pekat (uji steroid), serbuk magnesium, amil alkohol (uji flavonoid), air panas, larutan HCl 2 N (uji saponin) dan etanol 70%, larutan FeCl 3 5% (uji hidrokuinon), FeCl 3 10% (uji tanin). Bahan yang digunakan untuk uji total fenol adalah etanol, akuades, Na 2 CO 3 5%, reagen Folin-Ciocalteu 50% dan asam galat sebagai standar. Bahan yang digunakan untuk uji antioksidan meliputi ekstrak kasar metanol, etil asetat, n-heksana, Kristal 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) dan antioksidan sintetik (vitamin C) sebagai pembanding. Bahan yang digunakan untuk analisis antimikroba adalah bakteri dan khamir uji (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, dan Candida maltosa), akuades, kloramfenikol, media Trypticase Soy Agar (TSA), media Nutrient Broth (NB), media Mueller Hinton Agar (MHA), aluminium foil, dan plastik wrapping. Alat-alat yang diperlukan dalam penelitian ini meliputi pisau, sudip, cawan porselen, timbangan digital, gegep, kompor listrik, labu Erlenmeyer, pipet mikro, pipet tetes, gelas ukur, gelas piala, tabung reaksi dan autoklaf, rotary
20 vacuum evaporator (RE-MH3), multimeter, spektrofotometer UV-Visible (Shimadzu), refrigerator, vortex. 3.3 Metode Penelitian 3.3.1 Pengambilan, preparasi dan ekstraksi bahan baku Pengambilan sampel S. polycystum dilakukan pada tanggal 03 Maret 2012, di Pulau Pramuka, Taman Nasional Kepulauan Seribu yang kemudian dikeringkan. Lokasi ini dipilih karena kondisi perairan laut yang relatif lebih bersih, sehingga S. polycystum tumbuh melimpah. Pengambilan sampel ini dilakukan dengan langsung memetik S. polycystum dari substratnya secara mekanik menggunakan tangan. S. polycystum diisi ke dalam wadah berisi air laut yang kemudian ditransportasikan ke tempat penelitian untuk selanjutnya dikeringkan dengan sinar matahari selama tiga hari dan diekstraksi. Sebelum diekstraksi, sampel kering terlebih dahulu dibersihkan dari komponen-komponen pengotor seperti pasir, garam, kayu, ranting, dan rumput laut jenis lain. Tahap selanjutnya adalah ekstraksi bahan aktif. Metode ekstraksi yang digunakan adalah metode ekstraksi tunggal yang mengacu pada (Quinn 1988 dalam Darusman et al. 1995). Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini yaitu pelarut polar (metanol), semi polar (etil asetat) dan non polar (n-heksana). Sampel yang telah dihancurkan ditimbang sebanyak 50 gram dan dimaserasi dengan pelarut polar (metanol), semipolar (etil asetat) dan nonpolar (n-heksana) sebanyak 250 ml selama 24 jam. Hasil maserasi yang berupa larutan kemudian disaring dengan kertas saring sehingga didapat filtrat dan residu. Filtrat yang diperoleh dievaporasi hingga pelarut memisah dengan ekstrak menggunakan rotary vacuum evaporator pada suhu kurang dari 50 o C. Diagram alir tahap penelitian dapat dilihat pada Gambar 3.
21 Sampel kering (50 g) Penambahan pelarut (1:5) Sampel + metanol Sampel + etil asetat Sampel + n-heksana Maserasi Penyaringan Evaporasi Ekstrak kasar metanol Ekstrak kasar etil asetat Ekstrak kasar n-heksana Rendemen (%) Uji Fitokimia Uji Total Fenol Uji aktivitas antioksidan Uji aktivitas antimikroba Gambar 3 Diagram alir tahapan penelitian 3.3.2 Uji fitokimia Uji fitokimia dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak kasar S. polycystum. Uji fitokimia yang dilakukan
22 merupakan modifikasi dari Harborne (1987) yang meliputi uji alkaloid, steroid/triterpenoid, flavonoid, saponin, fenol hidrokuinon dan tanin. 1) Alkaloid Sebanyak 0,05 mg sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid yaitu, pereaksi Dragendorff, pereaksi Meyer, dan pereaksi Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan, endapan cokelat dengan pereaksi Wagner dan endapan merah hingga jingga dengan pereaksi Dragendorff. 2) Steroid/triterpenoid Sebanyak 0,05 mg sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi yang kering. Kemudian ditambahkan 10 tetes anhidrat asetat dan 3 tetes asam sulfat pekat. Terbentuknya larutan berwana merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau menunjukan reaksi positif. 3) Flavonoid Sebanyak 0,05 mg sampel ditambahkan serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol (campuran asam klorida 37% dan etanol 95% dengan volume yang sama) dan 4 ml alkohol kemudian campurkan dikocok. Terbentuk warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid. 4) Saponin Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Sebanyak 0,05 mg sampel dimasukkan dalam tabung reaksi yang berisi air panas 20 ml. Busa yang sudah stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan adanya saponin. 5) Fenol hidrokuinon (pereaksi FeCl 3 ) Sebanyak 0,05 mg sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70%. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3 5%. Terbentuknya warna hijau atau hijau biru menunjukkan adanya senyawa fenol dalam bahan.
23 6) Tanin Sebanyak 0,05 mg sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Air panas yang telah diseduh diteteskan ke dalam tabung reaksi kemudian didihkan dalam wadah berisi air. Larutan ekstrak yang medidih kemudian disaring. Filtrat ekstrak ditambahkan FeCl 3 10% dan divorteks sampai terlihat perubahan warna. Perubahan warna reaksi menjadi hitam menunjukkan adanya kandungan tanin dalam ekstrak. 3.3.3 Uji total fenol Kandungan total fenol ditentukan dengan menggunakan prosedur Folin-Ciocalteau yang dimodifikasi dari Pambayun et al. (2007) dimana uji kandungan total fenol dilakukan untuk mengetahui jumlah fenol yang terdapat pada sampel. Ekstrak kasar dengan berat sekitar 5-10 mg ditimbang lalu dilarutkan dengan 2 ml etanol 95%. Kemudian larutan ditambahkan 5 ml akuades dan 0,5 ml reagen Folin-Ciocalteau 50% (v/v). Campuran didiamkan selama 5 menit dan ditambahkan 1 ml Na 2 CO 3 5% (b/v). Selanjutnya campuran dihomogenkan dan diinkubasi dalam kondisi gelap selama satu jam. Serapan yang dihasilkan diukur dengan spektrofotometer UV-Visible pada panjang gelombang 725 nm. Asam galat digunakan sebagai standar dengan konsentrasi 5, 10, 15, 25, dan 50 ml/l. Kandungan total fenol diinterpretasikan sebagai milligram ekivalen asam galat (GAE = Galic Acid Equivalent) per 100 g sampel (mg GAE/100 g sampel). 3.3.4 Uji aktivitas antioksidan Metode uji aktivitas antioksidan yang digunakan dimodifikasi dari Ebrahimzadeh et al. (2010) yaitu metode 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH). Masing-masing ekstrak kasar dilarutkan dalam etanol dengan konsentrasi yang berbeda, yaitu 31,25, 62,5, 125, 250 dan 500 ppm. Antioksidan Vitamin C digunakan sebagai pembanding dan kontrol positif. Vitamin C dilarutkan dalam pelarut etanol dengan konsentrasi 12,5, 6,25, 3,12, 1,56, 0,78 dan 0,39 ppm. Larutan DPPH yang akan digunakan dibuat dengan menggunakan kristal DPPH dalam pelarut etanol dengan konsentrasi 1 mm. Proses pembuatan larutan DPPH 1 mm dilakukan dalam kondisi suhu rendah dan terlindung dari cahaya matahari.
24 Uji aktivitas antioksidan dilakukan berdasarkan kemampuan sampel yang digunakan dalam mereduksi radikal bebas stabil DPPH. Sebanyak 1 mg ekstrak kasar dan Vitamin C sebagai kontrol positif ditimbang dan kemudian ditambahkan dengan etanol dengan perbandingan 1:1000. Selanjutnya 1,3 mg DPPH diencerkan dengan 25 ml etanol. Sebanyak 1 µl etanol diisikan ke dalam microplate yang telah disiapkan. Setelah itu dilakukan pengisian ekstrak dengan beberapa konsentrasi dan penambahan larutan DPPH. Campuran dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 30 menit. Serapan yang dihasilkan diukur dengan spektrofotometer UV-Visible pada panjang gelombang 517 nm. Persentase penghambat aktivitas radikal bebas diperoleh dari nilai absorben sampel. Persamaan regresi diperoleh dari hubungan antara konsentrasi sampel dan persentase penghambat aktivitas radikal bebas. Nilai konsentrasi penghambat aktivitas radikal bebas sebanyak 50% (IC50) dihitung dengan menggunakan persamaan regresi. Nilai IC 50 diperoleh dengan memasukkan Y=50 serta nilai A dan B yang telah diketahui. Nilai x sebagai IC 50 dapat dihitung dengan persamaan. Aktivitas antioksidan dari masing-masing sampel dan antioksidan pembanding vitamin C dinyatakan dengan persen inhibisi yang dihitung dengan rumus berikut: Y= A+B Ln(x) Keterangan: Y= persen inhibisi A = slope B = intercept x = konsentrasi sampel 3.3.5 Uji aktivitas antimikroba Uji aktivitas antimikroba dilakukan terhadap ekstrak S. polycystum. Uji ini meliputi persiapan media padat TSA, persiapan media cair NB, persiapan suspensi mikroba, persiapan media padat MHA, prosedur uji aktivitas antimikroba dengan berbagai konsentrasi dan pengukuran zona hambat. Mikroba uji yang digunakan adalah E. coli dan S. aureus, B. subtilis dan C. maltosa. Pengujian aktivitas antimikroba dilakukan dengan metode difusi agar.
25 a) Persiapan media padat TSA Penyegaran mikroba uji, yaitu E. coli dan S. aureus, B. subtilis dan C. maltosa dilakukan pada media Trypticase Soy Agar (TSA). Media TSA dibuat dengan melarutkan sebanyak 8 gram media TSA bubuk dalam akuades hingga volume 200 ml, lalu dipanaskan sambil diaduk hingga mendidih. Sebanyak 9 ml TSA dipipet dalam tabung reaksi dan masing-masing tabung ditutup dengan kapas dan aluminium foil. Media lalu disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Setelah itu media dimiringkan sekitar 45 derajat dan dibiarkan hingga membeku. Setelah membeku media selanjutnya disimpan dalam refrigerator. b) Persiapan media cair NB Media Nutrient Broth (NB) dibuat dari 2,6 gram media NB bubuk yang dilarutkan dalam akuades hingga volume 200 ml, selanjutnya dipanaskan sambil diaduk hingga mendidih. Sebanyak 9 ml NB dipipet ke dalam tabung reaksi dan masing-masing tabung ditutup menggunakan kapas dan aluminium foil. Sebelum digunakan, media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Setelah itu media didinginkan ditempat yang steril pada suhu ruang. c) Persiapan suspensi mikroba Sebanyak 1 ose mikroba uji digoreskan pada media TSA dengan pola zig-zag secara aseptik, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 o C selama 18-24 jam. Setelah itu 1-2 ose bakteri uji dari media TSA dimasukkan ke dalam media NB yang telah dingin secara aseptik. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 o C selama 18-24 jam. Optical Density (OD 600 nm ) dihitung menggunakan spektrofotometer untuk menentukan fase hidup bakteri yang digunakan. Nilai OD bakteri setelah inkubasi selama 12-18 jam tiap mikroba berbeda yaitu E. coli 0,607 nm, S. aureus 0,808 nm, B. subtilis 0,540 nm, dan C. maltosa 0,663 nm. d) Persiapan media padat MHA Media padat yang digunakan untuk pengujian aktivitas antimikroba adalah media Mueller Hinton Agar (MHA). MHA dibuat dengan melarutkan 7,6 gram media MHA bubuk dalam akuades hingga volume 200 ml,
26 kemudian dipanaskan sambil diaduk hingga mendidih. Larutan dipipet 15 ml, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan masing-masing tabung ditutup dengan kapas dan aluminium foil. Sebelum digunakan, media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Media didinginkan pada suhu ruang sampai agar membeku. Setelah membeku, media disimpan dalam refrigerator. e) Uji aktivitas antimikroba (modifikasi Darusman et a.l 1995) Media MHA cair sebanyak 15 ml ditambah dengan 20 µl mikroba uji yang telah diukur OD-nya (Optical Density) antara 0,5-0,8 pada panjang gelombang 600 nm. Media yang telah ditambah dengan mikroba uji dihomogenkan dengan vorteks, kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri steril dan digoyangkan membentuk angka delapan agar menyebar secara merata. Media agar tersebut didiamkan pada suhu ruang selama 15 menit atau sampai agar membeku. Dalam uji aktivitas antimikroba, setiap sumur diberi ekstrak S. polycystum sebanyak 20 µl dengan konsentrasi 2 mg/ml, 1 mg/ml dan 0,5 mg/ml. Sumur juga diisi dengan kloramfenikol sebagai kontrol positif dengan konsentrasi 2 mg/ml dan pelarut ekstrak sebagai kontrol negatif. Setelah seluruh ekstrak pada sumur dimasukkan dalam cawan petri yang telah berisi agar dan mikroba kemudian cawan petri dilapisi dengan plastik wrapping untuk menghindari kontaminasi dan disimpan dalam inkubator dengan posisi terbalik pada suhu 37 o C selama 18-20 jam. Aktivitas antimikroba dapat dilihat dengan mengamati zona hambat yang terbentuk di sekitar sumur. Diagram alir uji aktivitas antimikroba disajikan pada Gambar 4. f) Pengukuran zona hambat Aktivitas antimikroba dinyatakan positif apabila terbentuk zona hambatan berupa zona bening di sekeliling sumur dan aktivitas antimikroba dinyatakan negatif apabila tidak terbentuk zona bening. Diameter zona hambat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
27 Keterangan : Zona hambat = A B A = Diameter zona hambat yang terbentuk (mm) B = Diameter sumur (mm) Mikroba uji Inokulasi mikroba 20 µl dalam 20 ml media MHA homogenisasi dengan vorteks Penuangan agar ke dalam cawan petri steril Pendinginan selama 15 menit atau sampai agar membeku Pembuatan sumur dalam media agar Pemberian 20 µl ekstrak pada sumur dengan konsentrasi 2 mg/ml, 1 mg/ml dan 0,5 mg/ml serta kontrol positif dan kontrol negatif Inkubasi pada suhu 37 o C selama 18-20 jam dalam posisi terbalik Zona bening Pengamatan dan pengukuran zona bening Gambar 4 Tahapan uji aktivitas antimikroba ekstrak S. polycystum (modifikasi Darusman et al.1995)
28 3.4 Rancangan Percobaan dan Analisis Data Perlakuan pada penelitian ini adalah dengan penggunaan jenis pelarut yang memiliki tingkat kepolaran yang berbeda, yaitu metanol, etil asetat dan n-heksana. Semua perlakuan dilakukan sebanyak dua kali ulangan. Model rancangan yang digunakan untuk menganalisis data rendemen hasil ekstrak, total fenol dan aktivitas antioksidan adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan model dan hipotesis sebagai berikut: Y ij = µ + αi + єij Keterangan: Y ij = hasil pengamatan rendemen ekstrak, total fenol, aktivitas antioksidan dan jenis pelarut (i) pada ulangan ke-j µ = rataan umum αi = pengaruh jenis pelarut = sisaan akibat jenis pelarut taraf ke-i pada ulangan ke-j є ij Analisis ragam digunakan untuk menganalisis data. Uji lanjut Duncan digunakan jika analisis ragam menunjukkan hasil berbeda nyata. Keterangan: Sy = (KTS ) r Rp = qa x Sy Sy = significant range KTS = kuadran tengah sisa r = ulangan qa = significant stidientized range Rp = wilayah nyata terkecil dari nilai rata-rata H0 : Jenis pelarut tidak memberikan pengaruh nyata terhadap nilai rendemen, total fenol dan aktivitas antioksidan (αi = 0) H1 : Jenis pelarut memberikan pengaruh nyata terhadap nilai rendemen, total fenol dan aktivitas antioksidan (αi 0)