Deteksi Resistensi Mycobacterium kusta Secara Molekuler

36 Deteksi Resistensi Mycobacterium kusta Secara Molekuler Mudatsir Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Syiah Kuala Banda Aceh. Email: mudatsir@unsyiah.ac.id Abstrak Penyakit kusta atau Morbus Hansen adalah penyakit kronik yang disebabkan oleh Mycobacterium leprae. Basil ini pertama menyerang saraf tepi, selanjutnya dapat menyerang kulit, mukosa mulut dan saluran nafas atas, dan organ-organ lainnya. Sampai saat ini penyakit kusta masih merupakan masalah kesehatan terutama di negaranegara berkembang termasuk Indonesia.Sejak dimulainya pengobatan Multydrug Therapy (MDT) pada tahun 1980 banyak penderita kusta dapat disembuhkan dan dengan sendirinya jumlah penderita kusta terdaftar juga berkurang. Namun, munculnya laporan resistensi terhadap satu atau lebih antibiotik yang digunakan merupakan ancaman serius terhadap program pengendalian penyakit kusta karena MDT yang digunakan selama ini sangat efektif dalam pengobatan penyakit kusta. Uji resistensi Mycobacterium leprae secara konvensional sampai sekarang masih menjadi kendala karena bakteri tersebut belum berhasil dibiakkan dalam media buatan. Namum pada era biologi molekuler seperti sekarang ini kendala ini mulai dapat diatasi. Uji resistensi secara molekuler yang sering dilakukan untuk mendeteksi gen rpob, folp1 dan gyra yang merupakan gen-gen yang berperan dalam resistensi M.leprae terhadap rifampisin, dapson dan golongan kuinolon Kata Kunci: Multydrug Therapy (MDT), Resisten, Kusta, gen rpob, folp1 dan gyra Pendahuluan 439

Penyakit kusta merupakan penyakit menular yang masih menjadi masalah kesehatan di beberapa Negara didunia, termasuk Indonesia. Penyakit kusta banyak menimbulkan masalah bukan hanya dalam segi medis saja tetapi juga dari segi mental, sosial, ekonomi dan budaya penderita. Kusta termasuk salah satu dari 10 penyakit tropis yang terabaikan (neglected tropical diseases) (1). Penderita kusta tersebut membutuhkan dukungan dari berbagai pihak seperti keluarga, tenaga kesehatan dan masyarakat sekitar dalam menghadapi dalam kehidupan sehari-hari yang penuh tekanan. World Health Organization (WHO) telah mencanangkan program eliminasi kusta di seluruh dunia tahun 1990, dimana setiap negara harus menurunkan prevalensi kusta di bawah 1/10.000 penduduk pada tahun 2000. Dari semua kasus di dunia 82% terdapat di 5 negara, yaitu Brazil, India, Indonesia, Congo dan Bangladesh (2). Di Indonesia sendiri masih terdapat sejumlah kantong-kantong kusta dengan angka prevalensi secara nasional 0,86/10.000 penduduk (3). Pengendalian kusta menunjukkan hasil yang cukup signifikan dengan dilaksanakannya Multidrug Therapy (MDT).Program Pengobatan MDT yang telah dimulai sejak tahun 1980 menunjukkan hasil yang luar biasa dengan menurunnya jumlah penderita kusta secara dramatik dari 5,4 juta orang yang terdaftar (dari estimasi total 10-12 juta) ditahun 1985, menjadi tinggal 770.000 orang (dari estimasi total 1,6 juta) di tahun 2000. Menurut WHO jumlah penderita kusta baru sampai akhir tahun 2013 di seluruh dunia berjumlah 215.656 orang (4). Menurunnya penderita kusta baru menunjukkan keberhasilan dalam pengobatan penyakit kusta, namun beberapa tahun belakangan ini mulai dilaporkan 440

adanya resistensi agen penyebab kusta yaitu Mycobacterium leprae resisten terhadap MDT tersebut. Sejumlah kasus kusta yang diobati dengan MDT mulai menunjukkan tidak adanya respon terhadap MDT. Adanya kasus resistensi MDT tersebut bila tidak didteksi akan menjadi masalah baru dalam pengendalian penyakit kusta. Pemeriksaan resistensi terhadap M. kusta tidak dapat dilakukan dengan metode mikrobiologi konvensional karena bakteri ini tidak bisa dibiakkan pada medium artifisial. Metode konvensional untuk mendeteksi resistensi menggunakan hewan coba seperti tikus untuk uji resistensi terhadap obat tidak efektif. Kekeurangan dari metode tersebut adalah sangat rumit, memakan waktu dan hanya bisa dilakukan pada laboratorium tertentu serta tidak praktis (5). Artikel ini akan membahas tentang cara mendeteksi kasus resistensi terhadap MDT secara molekuler. Analisis resistensi molekuler ini yang akan dibahas mencakup epidemiolgi kusta, regimen pengobatan MDT pada penderita kusta. Analisis mendalam juga akan dilakukan dengan metode deteksi resistensi MDT secara molekuler pada M. leprae khususnya pada gen gen rpob, folp1 dan gyra yang merupakan gen-gen yang berperan dalam penentuan resistensi terhadap rifampisin, dapson dan golongan kuinolon. Epidemiologi Penyakit Kusta Penderita kusta di seluruh dunia menurun drastis karena tahun 1993 WHO mencanangkan program Elimination of Leprosy by the year 2000, dimana seluruh negara di dunia harus menurunkan prevalensi kusta di bawah 1 per 10.000 penduduk agar kusta tidak lagi menjadi masalah kesehatan (6). Dengan Program Pengobatan Multi Drug Therapy (MDT) yang telah dimulai sejak tahun 1980, jumlah keseluruhan 441

penderita kusta di seluruh dunia telah berkurang secara dramatik dari 5,4 juta orang yang terdaftar (dari estimasi total 10-12 juta) ditahun 1985, menjadi tinggal 770.000 orang (dari estimasi total 1,6 juta) di tahun 2000. Pada akhir tahun 2014 jumlah penderita kusta di seluruh dunia berjumlah 180.464.(7) Program eliminasi kusta tahun 2000 tersebut memang bisa dicapai oleh beberapa negara, namun Indonesia tidak bisa mencapai pada tahun tersebut karena beberapa kendala. Meskipun angka prevalensi kusta pada tahun 2000 telah turun sampai 1,09/10.000 penduduk, tercatat masih ada kabupaten dan propinsi di Indonesia yang angka prevalensinya di atas target Penyebaran penyakit ini di Indonesia tidak merata, sebagian besar kasus ditemukan di Indonesia Bagian Timur disertai adanya kantong-kantong endemik dengan prevalensi cukup tinggi (8). Regimen Pengobatan Multidrug Therapy pada Penderita Kusta Pada era sebelum tahun 1940 untuk mengobati penderita kusta menggunakan suntikan minyak chaulmogra, namun cara ini menimbulkan banyak efek samping dan perlu waktu sangat lama (8,9). Sejak ditemukannya DDS (Diamino-DiphenylSulphone) tahun 1942 dimulailah era kemoterapi antikusta yang menunjukkan hasil yang nyata secara klinik dan bakteriologik. Pengobatan penderita bertujuan membunuh kuman kusta, dengan demikian pongobatan akan: 1) memutuskan mata rantai penularan, 2) menyembuhkan penyakit pendrita dan, 3) mencegah terjadinya cacat atau mencegah bertambahnya cacat yang sudah ada sebelum pengobatan. (8) Penggunaan Multidrug Therapy (MDT) dilakukan dengan mengkombinasi dua atau lebih obat anti kusta, yang salah satunya harus 442

terdiri atas rifampisin sebagai anti kusta yang sifatnya bakterisid kuat dengan anti kusta lain yang bersifat bakteriostatik. Rifampisin diberikan hanya sebulan sekali. (9,10). Beberapa laporan tidak menunjukkan ada efek toksik telah dilaporkan dalam kasus dari pemberian rifampisin ini. Biasanya penderita urin akan berwarna kemerahan sedikit selama beberapa jam setelah pemberian. Hal ini harus dijelaskan kepada pasien saat mulai MDT. Klofazimin paling aktif bila diberikan setiap hari. Obat ini ditoleransi dengan baik dan hampir tidak beracun dalam dosis yang digunakan untuk MDT. Obat ini menyebabkan perubahan warna hitam kecoklatan dan kekeringan kulit. (8,10) Namun, ini menghilang dalam waktu beberapa bulan setelah menghentikan pengobatan. Ini harus dijelaskan kepada pasien yang mulai MDT rejimen untuk kusta MB. Obat ini sangat aman dalam dosis yang digunakan dalam MDT dan efek samping yang jarang terjadi. Efek samping utama adalah reaksi alergi, menyebabkan ruam kulit gatal dan dermatitis eksfoliatif. Pasien yang diketahui alergi terhadap salah satu obat sulfa tidak boleh diberikan dapson. (1,8,11) Metode Deteksi Resistensi Multidrug Therapy Secara Molekuler Terapi MDT diperkenalkan untuk pengendalian kusta dengan tujuan untuk meminimalkan terjadinya resistensi obat pada Mycobacterium leprae. Penggunaan MDT dalam pengendalian kusta secara nyata menurun prevalensi kusta secara global selama dua dekade terakhir. Namun, sekarang mulai dilaporkan adanya resistensi terhadap MDT ini diberbagai negara di dunia. Informasi adanya resistensi ini sangat penting untuk mengevaluasi kemanjuran MDT dan untuk menjaga efektivitas arus strategi pengendalian kusta. Oleh karena itu diperlukan 443

teknik secara molekuler untuk mendeteksi resistensi M. leprae terhadap antibiotik MDT tersebut. Deteksi resistensi secara konvensional dengan metode difusi atau dilusi tidak dapat dilakukan pada M.lepraea karena bakteri ini tidak dapat dibiakkan pada media artifisial (media buatan). Sebelum berkembangnya terknik biologi molekuler untuk memeriksa adanya kekebalan atau resistensi terhadap obat kusta, hanya bisa lewat inokulasi M.kusta pada telapak kaki tikus. Tikus yang telah terinfeksi tersebut diberi obat anti kusta untuk melihat apakah jumlah kuman berkurang atau tidak. Prosedur ini memerlukan waktu minimal 6 bulan sebelum diketahui apakah ada resistensi atau tidak (12). Metode pemeriksaan secara konvensional untuk mendeteksi resistensi menggunakan hewan coba ini untuk uji resistensi terhadap obat tidak efektif. Kekeurangan dari metode tersebut adalah sangat rumit, memakan waktu dan hanya bisa dilakukan pada laboratorium tertentu serta tidak praktis. Kini dengan tehnik biomolekuler, dalam waktu 3 hari sudah bisa diketahui adanya resistensi lewat analisis adanya mutasi pada DNA dari M.leprae (13,14). Dari beberapa laporan hasil penelitian menunjukkan frekuensi mutasi M. leprae dalam resistensi obat menentukan wilayah gen yang berpengaruh pada resistensi MDR adalah gen folp1, rpob, dan gen gyra. Ketiga gen tersebut sekarang digunakan untuk mendeteksi resistensi resisten terhadap dapson, rifampisin, dan ofloxacin. Untuk mengetahui resisistensi terhadap gen tersebut dilakukan sekuensing DNA terhadap M.leprae (15). Resistensi terhadap regimen MDT seperti dapson, rifampisin dan ofloxacin, berlangsung pada asam amino substitusi yang mengikat obat tersebut. Cara yang dapat dilakukan untuk mengetahui mekanisme 444

resistensi dapat dilakukan dengan menggunakan metode uji berbasis DNA sekuensing dan deteksi DNA dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) secara langsung. Untuk mengetahui resisistensi terhadap gen tersebut dilakukan sekuensing DNA terhadap M. kusta.lokus yang mengalami mutasi terhadap MDR dapat dilihat pada gambar berikut. Daerah gen yang digunakan untuk mendeteksi MDR secara molekuler adalah adalah gen folp1, rpob, dan gen gyra. (15,16,17) Langkah pertama dalam deteksi resistensi adalah ekstraksi DNA sampel, kemudian diikuti oleh amplifikasi oleh Polymerase Chain Reaction (PCR) daerah menentukan resisten yaitu di gen rpob, folp dan gen gyra. Amplifikasi daerah target akan dikonfirmasi oleh agarosa elektroforesis. Produk PCR kemudian dimurnikan dan dilanjtkan dengan sekuensing fragmen pendek. Daerah mutasi yang diamati setelah sekuensing digunakan untuk mengetahui daerah mutasi terhadap gen folp1, rpob, dan gen gyra (15). Daerah mutasi tersebut dapat dilihat pada gambar 1 berikut. Gambar 1. Mutasi dan resistensi terhadap MDT (15) Prinsip deteksi secara biologi molekuler adalah melihat urutan nukleotida pada gen yang menyandi enzim dimana obat anti kusta 445

bekerja. Sebagai contoh, DDS bekerja menghambat enzim dehydropteroat dimana enzim tersebut disandi oleh gen folp. Urutan nukleotida normal dari gen folp ini telah diketahui dari bank data. Dengan membandingkan urutan nukleotida hasil sekuensing isolat M.leprae yang dicurigai dengan urutan nukleotida yang normal, dapat dilihat terjadinya mutasi. Perubahan nukleotida ini menyebabkan perubahan asam amino yang selanjutnya merubah enzim yang dibentuknya. Akibatnya DDS tidak bisa lagi bekerja pada enzim dihydropteroate synthase yang telah berubah sifat ini (18). Begitu pula mutasi pada gen rpob akan menyebabkan terjadinya resistensi terhadap rifampisin karena enzim dimana obat tersebut bekerja telah berubah. (19) Dari beberapa laporan hasil penelitian secara molekuler menunjukkan frekuensi mutasi M. leprae dalam resistensi MDT berkisar 2% sampai 5% (20,21) Kesimpulan Resistensi terhadap regimen MDT seperti dapson, rifampisin dan ofloxacin terjadi pada asam amino substitusi yang mengikat obat tersebut. Untuk mendeteksi resistensi resistensi tersebut dapat dilakukan dengan teknik biologi molekuler terhadap gen rpob, folp1 dan gyra yang merupakan gen-gen yang berperan dalam resistensi M. leprae terhadap rifampisin, dapson dan golongan kuinolon. Daftar Pustaka 1. World Health Organization. WHO recommended MDT regimens.http://www.who.int/lep/mdt/regimens/en/. 2015. Diakses tanggal 12 Oktober 2015. 2. World Health Organization. Global Leprosy Situation 2012. Weekly Epidemiological Record. 2013. 34: 289-296. 3. Lystiawan Y. Menuju Indonesia Bebas Kusta. Bulletin Perdoski. 2013. 2: 1-6. 446

4. World Health Organization. Global Leprosy Situation 2012. Weekly Epidemiological Record. 2013. 34: 289-296. 5. Ebenezer, G. J., G. Norman, G. A. Joseph, S. Daniel, and C. K. Job. Drug resistant Mycobacterium leprae results of mouse footpad studies from a laboratory in south India. Indian Journal Leprosy. 2002. 74:301-312. 6. Britton, WJ. And Lockwood, DNJ. Leprosy. The Lancet. 2004. 363: 1209-1219 7. World Health Organization. Leprosy Today.http://www.who.int/lep/en/. 2015. Diakses tanggal 12 Oktober 2015. 8. Departemen Kesehatan RI. Buku Pedoman Nasional Pengendalian Penyakit Kusta. 2007. Direktorat Jenderal Pengendaliam Penyakit dan Penyehatan Lingkungan. 9. Truman, R. Distinguishing Genotypic Variations of Mycobacterium leprae. 2004. National Hansen s Disease Program BPHC/HRSA, Baton Rauge, USA. 10. William DL and Gillis TP. Drug-resistant leprosy: Monitoring and current Status. Leprosy Review. 2012. 83: 269 281. 11. World Health Organization. Guide to Eliminate Leprosy as a Public Health Problem. 2010. WHO. Geneva. 12. Ebenezer, G. J., G. Norman, G. A. Joseph, S. Daniel, and C. K. Job. Drug resistant Mycobacterium leprae results of mouse footpad studies from a laboratory in south India. Indian Journal of Leprosy. 2002. 74:301-312. 42. 13. Musser, J. M. Antimicrobial agent resistance in mycobacteria: molecular genetic insights. Clinical Microbiology Review.1995. 8:496-514. 14. Indropo I, Penyakit Kusta Penyakit Tua dengan Segudang Misteri. Pidato Pengukuhan Jabatan Guru Besar. 2003. Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Surabaya, 19 April 2003 15. World Health Organization. Guidelines for Global Surveillance of Drug Resistance in Leprosy. 2009. WHO, Regional Office for South-East Asia, Indraprastha Estate, Mahatma Gandhi Marg, New Delhi, India. 16. Cambau E, Chauffour-Nevejans AI, Tejmar-Kolar L, Matsuoka M and Jarlier V. Detection of Antibiotic Resistance in Leprosy UsingGenoType LepraeDR, a Novel Ready-To-Use Molecular Test.. PLoS. Neglected Tropical Diseases. 2012. 6:1739-1745. 447

17. Kai M. Nhu HN, Hoang AN, Hoang BD, Khanh HN, Miyamoto N, Maeda Y, Fukutomi Y, Nakata N,i Matsuoka M Makino M and Nguyen HT. Analysis of Drug-Resistant Strains of Mycobacterium leprae in an Endemic Area of Vietnam. Clinical Infection Diseases. 2011. 52: 127-132. 18. Williams, D. L., L. Spring, E. Harris, P. Roche, and T. P. Gillis. Dihydropteroate synthase of Mycobacterium leprae and dapsone resistance. Antimicrobial. Agents Chemotherapy. 2000. 44:1530-1537. 19. Honore, N., E. Perrani, A. Telenti, J. Grosset, and S. T. Col. A simple and rapid technique for the detection of rifampin resistance in M.leprae. 1993. International Journal Leprosy and Other Mycobacterium. Diiseases. 61:600-604. 20. Weil L., Matsuoka M., Kai M.,Thapa P., Khadge S., Hagge DA., Brennan PJ and Vissa V. Real-Time PCR and High-Resolution Melt Analysis for RapidDetection of Mycobacterium leprae Drug Resistance Mutations and Strain Types. Journal of Clinical Microbiology. 2012. 5: 742 753. 21. Kai M., Nakata N., Matsuoka M. Sekizuka T., Kuroda M and Makino M. 2013. Characteristic mutations found in the ML0411 gene of Mycobacterium leprae isolated in Northeast Asian countries.2013. Infection, Genetics and Evolution 19: 200 204. 448