BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Jenis Penelitian Penelitian yang dilakukan merupakan penelitian analitik dengan menggunakan desain case-control. 3.2 Tempat Penelitian Amplifikasi DNA dan digesti enzim restriksi dilaksanakan di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran, Medan. 3.3 Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan mulai April 2015 sampai bulan Juli 2016. 3.4 Populasi Penelitian Penderita PPOK dan non PPOK. 3.5 Sampel Penelitian Sampel berasal dari penelitian Dr.dr. Amira Permatasari Tarigan, Sp.P dalam bentuk isolat DNA sebesar 30 sampel PPOK dan 30 sampel non PPOK. 3.6 Variabel Penelitian Variabel Bebas: Polimorfisme gen MMP-12 Variabel Tergantung: Penyakit Paru Obstruktif Kronik.
3.7 Besar Sampel Besar sampel ditentukan berdasarkan jenis penelitian case-control: 2 Zα 2PQ+Zβ P1Q1+P2Q2 n1 = n2 = (P1-P2) dimana: P1 = 0,23 (frekuensi penderita PPOK (0,23%) (Li et al., 2012). P2 P = 0,50 (perkiraan proporsi trial) = ½ (P1+P2) Q = 0,64 (1- P) Q1 = 0,79 (1- P1) Q2 = 0,50 (1- P2) Zα = 1,96 (Nilai standar normal deviasi untuk α) Zβ = 0,84 (Nilai standar normal deviasi untuk β) n1 = n2 = 30. Besar sampel yang telah memenuhi syarat untuk penderita PPOK (kasus) adalah 30 dan non PPOK (kontrol) adalah 30. 3.8 Kriteria Inklusi dan Eksklusi Kriteria sampel penelitian kelompok kasus dan kontrol adalah kriteria untuk bahan biologi tersimpan yang berada di Laboratorium Terpadu FK USU yang merupakan sampel penelitian Dr. dr. Amira Permatasari Tarigan, Sp.P
* Untuk PPOK Kriteria Inklusi: 1. Penderita PPOK yang sudah dipastikan dengan hasil pemeriksaan spirometri: VEP 1 /KVP 70%, 15 menit setelah diberikan salbutamol Inhaler dosis terukur dua semprot dengan alat bantu (spacer), derajat menurut GOLD : ringan-sangat berat. 2. Umur penderita 40 tahun 3. Laki-laki 4. Perokok aktif atau mantan perokok dengan riwayat merokok 200 Indeks Brinkman 5. Bersedia mengikuti prosedur penelitian dan diambil sampel darahnya, dinyatakan secara tertulis setelah mendapatkan penjelasan mengenai penelitian. Kriteria Eksklusi: 1. Penderita asma, TB paru atau penyakit paru lainnya 2. Keadaan umum penderita dalam keadaan lemah (kaheksia) 3. Terdapat kesulitan dalam pengambilan darah * Untuk non PPOK Kriteria Inklusi : 1. Normal faal paru yang sudah dipastikan dengan hasil pemeriksaan spirometri: VEP 1 /KVP 70% 2. Umur penderita 40 tahun 3. Laki-laki 4. Perokok aktif atau mantan perokok dengan riwayat merokok 200 Indeks Brinkman
5. Bersedia mengikuti prosedur penelitian dan diambil sampel darahnya, dinyatakan secara tertulis setelah mendapatkan penjelasan mengenai penelitian. Kriteria Eksklusi : 1. Penderita penyakit paru seperti TB, Bronkitis kronik atau penyakit paru lain. 2. Keadaan umum penderita dalam keadaan lemah (kaheksia) 3. Terdapat kesulitan dalam pengambilan darah 4. Mempunyai keluarga yang berpenyakit PPOK 3.9 Definisi Operasional No. Variabel Definisi Operasional Cara Alat Skala Hasil Ukur Ukur Ukur Ukur 1. Polimorfisme Gen Kriteria: perbedaan alel Analisa UV Nominal homozigot MMP-12 dalam lokus yang sama Elektro Reader AA, GG dan dengan gen MMP-12 foresis gel heterozigot AG agarosa 2. PPOK Sudah ditetapkan - - Nominal - sebelumnya oleh ahli paru 3. Non-PPOK Sudah ditetapkan - - Nominal - sebelumnya oleh ahliparu
1.10. Pelaksanaan Penelitian 3.10.1 Isolasi DNA Alat dan bahan : 1. Sarung tangan 2. Pipet automatic 1000µl, 100µl 3. Tabung ependorf 1,5ml 4. Sentrifus 5. Vortex 6. Tips steril berbagai ukuran 7. Stopwatch 8. Kulkas 9. Kertas label 10. Pena tahan air 11. Kit ekstraksi DNA [the Wizard Genomic DNA Purification Kit, (Promega Corporation USA)]. Cara Kerja : 1. Label dan kode tabung ependorf untuk sampel darah 2. Darah EDTA disentrifus pada 3000 rpm selama 15 menit 3. Pisahkan plasmanya, lalu ambil 300µl leukosit dan masukkan kedalam tabung ependorf 1,5ml kemudian ditambah 900µl EL bufer dan campur dengan cara dibolak-balik secara perlahan 4. Inkubasi selama 10 menit didalam kulkas lalu disentrifus pada kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit
5. Buang supernatan dengan hati-hati agar endapan tidak ikut terbuang dan tahapan 2-4 diulang sampai 3x dan terlihat warna supernatan menjadi jernih dan endapan berwarna putih 6. Setelah diperoleh endapan yang berwarna putih atau supernatan yang jernih, buang supernatan dan endapan divortex selama 20 detik 7. Tambahkan 300µl nuclei lysis solution dan campurkan dengan cara dibolakbalik 8. Tambahkan 100µl protein precipitation, dan vortex selama 20 detik 9. Campuran tersebut disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit 10. Pindahkan supernatan kedalam tabung ependorf yang berisi 300µl isopropanol, lalu dibolak-balik sampai terlihat benang-benang DNA 11. Campuran disentrifugasi kembali pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit 12. Buang supernatan dan tambahkan larutan etanol 70% 13. Sentrifugasi kembali pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit 14. Setelah proses sentrifugasi selesai, etanol diaspirasikan menggunakan pipet dan dikeringkan selama 1 jam 15. Setelah kering, tambahkan 100µL DNA rehidration solution dan inkubasi pada suhu 4 o C selama 1 malam. DNA dapat disimpan di freezer pada suhu -20 o C sampai proses PCR-RFLP dilaksanakan.
3.10.2 Amplifikasi isolat DNA dengan Polymerase Chain Reaction Alat dan Bahan : 1. Mesin PCR/Thermal Cycler 2. Mikropipet 3. Tabung PCR 4. Tabung ependorf 1,5 ml 5. Tip steril berrbagai ukuran 6. Mesin sentrifugasi 7. PCR mix (Go Taq Green Master Mix (Promega USA)] 8. Sampel DNA 9. Primer forward MMP-12: 5 GTCAAGGGATGATATCAGCT-3 10. Primer reverse MMP-12: 5 CTTCTAAACGGATCAATTCAG-3 11. Kertas label dan pena Cara Kerja : 1. Label tabung PCR sesuai dengan kode nomor sampel 2. Buat campuran master mix untuk reaksi PCR dengan total volume 21µl untuk setiap sampel DNA yang terdiri dari 12,5µl master mix, 1µl masing-masing primer forward dan reverse, dan 6,5 µl nuclease free water 3. Tambahkan 4µl isolat DNA sampel pada campuran master mix dan masukkan ke dalam mesin PCR (thermal cycler) 4. MMP-12 pada sampel DNA diamplifikasi dengan menggunakan mesin PCR (thermal cycler) dengan suhu pre-denaturasi 95 o C selama 5 menit, diikuti 28 siklus denaturasi pada suhu 94 o Cselama 45 detik, annealing pada suhu 53 o C
selama 30 detik, dan elongasi pada suhu 72 o C selama 45 detik, dan tahap akhir pada suhu 72 o C selama 10 menit (Li et al., 2012) 5. Hasil elektroforesis pada agarose 2% akan terlihat fragmen DNA sebesar 137 bp (Li et al.,2012) 3.10.3 Digesti amplifikat DNA dengan Enzim Restriksi Alat dan Bahan : 1. Enzim Restriksi Pvu II (Thermoscientific ) 2. Buffer G 3. Nuclease Free Water 4. Produk PCR 5. Tabung ependorf 1,5ml 6. Mikropipet 7. Inkubator 8. Stopwatch 9. Kertas label dan pena tahan air Cara Kerja : 1. Label tabung ependorf 1,5 ml sesuai kode nomor sampel 2. Buat campuran reaksi RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) dengan total volume 10µl untuk setiap sampel yang terdiri dari 2,5µl produk PCR, 0,3µl enzim Pvu II, 1,5µl Buffer G dan 6,2µl nuclease free water 3. Inkubasi selam 1 jam pada suhu 37 o C didalam inkubator
4. Dilakukan elektroforesis pada agarose 2% maka akan terlihat 2 band pada homozigot AA (137bp, 119bp), 3 band pada heterozigot AG (137bp, 119bp, 18bp) dan 2 band pada homozigot GG (119bp, 18bp) (Li et al.,2012) 3.10.4 Visualisasi Hasil Restriksi dengan Elektroforesa Gel Agarosa Alat dan Bahan : 1. Top Vision Agarosa 100 g(thermo scientific ) 2. TAE Buffer 1 x 3. Flask Beaker 250 ml 4. Magnetic Hot Stirrer 5. Timbangan Digital 6. Ethidium Bromide 7. Aluminium Foil 8. Gel Casting Tray 9. Gel Comb 10. Gel Documentation 11. Loading Dye dan Marker DNA Cara Kerja : 1. Untuk membuat gel, timbang 0,7g agarosa dalam 35 ml TAE Buffer (Li et al., 2012). Panaskan dan aduk diatas magnetic hot stirrer hingga larutan mendidih dan berwarna jernih. 2. Matikan pemanasnya dan ditambahkan 1µl ethidium bromide dan diaduk kembali
3. Cairan dituang ke dalam casting tray dengan gel comb dan biarkan sampai mengeras 4. Setelah gel mengeras cabut gel comb perlahan-lahan 5. Pipet loading dye 2µl dan marker DNA 5µl, 3µl produk PCR dan produk RFLP masing-masing 10µl ke dalam sumur-sumur gel 6. Catat posisi sampel pada sumur-sumur gel 7. Jalankan elektroforesis selama 60 menit dengan tegangan 80 volt 8. Pindahkan gel ke dalam gel documentation untuk analisa dan dokumentasi hasil elektroforesis 3.11 Kerangka Operasional DNA pasien dan kontrol yang sudah ada PPOK n=30 Non-PPOK n=30 Genotyping dengan PCR RFLP Polimorfisme Homozigot Homozigot Heterozigot AA GG AG
3.12 Analisa Data Data akan dianalisa secara statistik dengan menggunakan SPSS. Distribusi genotip dan frekuensi alel yang akan diuji signifikansinya dengan menggunakan chisquare test (x 2 ), sedangkan distribusi genotip dan frekuensi alel individu dengan kejadian PPOK akan dianalisa menggunakan analisis Hardy Weinberg Equilibrium (HWE). Hasil analisa dikatakan signifikan jika nilai p<0.05
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil 4.1.1 Deskripsi Hasil Penelitian Telah dilakukan penelitian analitik dengan desain penelitian case control, untuk mengetahui hubungan polimorfisme gen MMP-12 dengan kejadian PPOK dibandingkan dengan non PPOK yang dilakukan di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran. Sampel penelitian merupakan isolat DNA yang disimpan di Laboratorium Terpadu FK USU yang merupakan sampel dari penelitian Dr.dr. Amira Permatasari Tarigan, Sp.P dengan judul penelitian Hubungan Polimorfisme Gen TNFα Pada Posisi - 308 dan -238 Dengan Kejadian Penyakit Paru Obstruktif Kronik yang merupakan disertasi program studi Doktor (S3) Ilmu Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara yang telah memenuhi krtiteria inklusi dan eksklusi. Jumlah keseluruhan sampel adalah 60, dengan 30 penderita PPOK dan 30 yang merupakan kontrol dan bukan penderita PPOK. Penelitian ini telah mendapatkan persetujuan dari Komite Etik Penelitian Bidang Kesehatan FK USU.
Prooses Therm mal cycler dilakukan d pada p isolat DNA pendderita PPOK K dan nonn PPOK denngan teknikk Polymerasse Chain Reeaction (PC CR) dengann menggunaakan primerr forward MMP-12: M 5 5 GTCAAG GGGATGAT TATCAGC CT-3 dan pprimer reveerse MMP-12: 5 CTT TCTAAACG GGATCAA ATTCAG-3 kemudiann produk PC CR ditunjukk kan dengann elektroforeesis gel agaarosa 2% maaka akan terrlihat fragm men DNA 1337bp pada gambar g 4.1 500bp 137bp P gen MMP-12 M yaang dianaliisa elektro oforesis gell Gaambar 4.1 Produk PCR agarosa 2% berada pada 137 pasang p basaa (bp)
Kemudian produk PCR didigesti dengan enzim Restriksi Pvu II (Thermo scientific ) untuk melihat variasi polimorfisme gen MMP-12 dan ditunjukkan dengann elektroforesis gel agarosa 4% terlihat 137bp dan 119b sedangkan yang 18bp tidak tampak pada gambar. Varian AAA mempunyai 137bp dan119bp, varian AG mempunyai 137bp, 119bp dan 18bp, varian GG mempunyai 119bp dan 18bp. Tidak dijumpai varian GG pada kasus maupun kontrol pada gambar 4.2 500bp 137bp 119bp Gambar 4.2 Digestii produk PCR gen MMP-12 dengan enzim Restriksi Pvu III analisa elektroforesis agarosa 4% sampel P19, P20, P21, P26, N9, N10 terlihatt alel AA dan AG 137bp dan 119bp, tidak tampak alel GG 18bp
4.1.2 Analisa Hasil Penelitian Berdasarkan analisa polimorfisme terhadap 30 sampel PPOK dan 30 sampel non PPOK diperoleh varian homozigot AA hampir sama pada PPOK 28 (93,3%) maupun non PPOK 29 (96,7%). Varian heterozigot AG ditemukan 2 (6,66%) pada PPOK dan 1 (3,33%) pada non PPOK. Varian GG sama sekali tidak dijumpai sehingga kemungkinan pada populasi yang diteliti dominan jenis wildtype. Analisa data diuji secara statistik dengan menggunakan tekhnik chi square untuk melihat adanya hubungan antara frekuensi distribusi polimorfisme gen MMP-12 homozigot AA, heterozigot AG dan homozigot GG pada PPOK dan non PPOK. Hasil uji statistik chi square menyatakan tidak ada hubungan polimorfisme gen MMP-12 pada PPOK (p>0,05) seperti yang ditunjukkan pada tabel 4.1 Tabel 4.1 Hubungan Antara Polimorfisme Gen MMP-12 dengan Kejadian PPOK POLIMORFISME PPOK NONPPOK TOTAL n % n % n % Nilai p* AG 2 6.7% 1 3.3% 3 5.0% AA 28 93.3% 29 96.7% 57 95.0% 0.5 GG 0 0 0 0 0 0 TOTAL 30 100.0% 30 100.0% 60 100.0% *Significant with Fisher exact test
Tabel 4.2 Analisa Hukum Hardy-Weinberg Equilibrium dengan menggunakan HWE calculator pada penderita PPOK Genotypes Observed AA 28 AG 2 GG 0 Compute Exp. H- W Equilibrium Freq. Expected H-W Freq 28.03 (93.44%) 1.93 (6.44%) 0.03 (0.11%) & Chi 2 P-Value Clear Form Values P-Value =0.8502 Allele Frequencies AA = 58 (96.67%) AG = 2 (3.33%) Tabel 4.3 Analisa Hukum Hardy-Weinberg Equilibrium dengan menggunakan HWE calculator pada penderita non PPOK Genotypes AA AG GG Compute Exp. H- Observed 29 1 0 W Equilibrium Expected H-W Freq 29.01 (96.69%) 0.98 (3.28%) 0.01 (0.03%) Freq. & Chi 2 P-Value Clear Form Values P-Value =0.926 Allele Frequencies AA = 59 (98.33%) AG = 1 (1.67%) Berdasarkan analisa dengan menggunakan HWE calculator pada penderita PPOK dan non PPOK, total HW freq keduanya berjumlah 100% yang artinya penelitian
ini tidak menyimpang dari Hukum Hardy-Weinberg Equilibrium. Berdasarkan analisa HWE tidak terdapat hubungan yang signifikan pada frekuensi gen MMP-12 yang dinyatakan dengan nilai p 0,05 (seperti yang ditunjukkan pada tabel 4.2 dan 4.3) yang berarti bahwa populasi yang diteliti sesuai dengan HWE. 4.2 Pembahasan Pada hasil penelitian ini polimorfisme gen MMP-12-82 A/G tidak berperan secara signifikan dalam menentukan seseorang terkena PPOK atau non PPOK. Penelitian ini menunjukkan hasil yang tidak signifikan (nilai p=0,5). Hal ini sejalan dengan penelitian Li et al (2012) yang menemukan pada populasi di Cina Han dengan nilai p=0,537 yang berarti bahwa hasil yang diperoleh juga tidak signifikan (p>0,05). Sejalan dengan penelitian Schirmer et al (2009) pada populasi Brazilia (p=0,11) dan Zhou et al (2013) pada populasi Kaukasia (p=0,877) juga mendapatkan hasil yang tidak signifikan (p>0,05) yang artinya tidak menemukan hubungan antara MMP-12 dengan kejadian PPOK. Karakteristik sampel (PPOK dan non PPOK) pada penelitian ini adalah populasi seluruh orang Indonesia dengan berbagai macam suku. Karakteristik pada penelitian Li et al (2012) adalah populasi orang Cina suku Han dengan kebudayaannya. Kelompok suku Han ini merupakan salah satu suku yang ada pada bangsa Cina. Karakteristik sampel pada penelitian Schirmer et al (2009) adalah populasi orang Brazilia dari Pusat Rehabilitasi Paru dan Rumah Sakit Umum Brazil. Karakteristik pada penelitian Zhou et al (2013) adalah populasi orang Kaukasia. Hal yang sebaliknya ditemukan oleh Hunninghake et al (2009) pada populasi dengan tingkat resiko yang tinggi (p=0,07) menemukan polimorfisme gen MMP-12 -
82A/G adalah faktor resiko PPOK. Haq et al (2010) pada populasi Eropa (p=0,03) menemukan bahwa alel AG pada Polimorfisme Nukleotida Tunggal (SNP) positif berhubungan dengan perokok dewasa sebagai faktor penyebab PPOK. Karakteristik sampel pada penelitian Hunninghake et al (2009) pada populasi dengan tingkat resiko tinggi PPOK, yaitu dari Pusat Penelitian Genetik Asma Kosta Rika (GACRS), Program Managemen Asma pada Anak (CAMP), Pusat Penelitian PPOK Boston (BAMSE), Pusat Pemulihan Nasional Emfisema (NETT), Studi Kohort pada Perokok Lovelace, dan Penelitian PPOK berdasarkan Usia Normatif (NAS). Karakteristik sampel pada penelitian Haq et al (2010) adalah populasi Eropa secara keseluruhan (Kaukasia berkulit putih) meliputi Barselona (Spanyol), Bristol (Inggris), Dublin (Irlandia), Edinburgh (Inggris), Leiden (Belanda) dan Pisa (Italia). Pada hasil penelitian ini tidak tampak band 18bp dari homozigot GG. Hal ini dikarenakan berat molekulnya sebesar 18bp sangat kecil dan juga kecepatan elektroforesisnya sangat tinggi dalam gel agarosa sehingga tidak ditemukan (Li et al., 2012). Isolat DNA tersimpan yang digunakan pada penelitian ini tidak dilakukan pengukuran kalibrasinya. Bahan biologi tersimpan ini masih dalam keadaan yang cukup baik, dibuktikan dari hasil amplifikasi isolat DNA pengukuran PCR dan RFLP pada analisa elektroforesa gel agarosa 2% tampak band pada 137bp dan 119 bp. MMP-12 merupakan famili endopeptidase dalam golongan makrofag metaloelastase yang memiliki kemampuan untuk memecah dinding matriks ektraselular (ECM). Gen MMP-12 ini adalah regulator yang penting dari degradasi jaringan ikat dan oleh karena itu berhubungan langsung dalam remodeling jaringan. MMP-12 juga mendegradasi ECM menjadi kolagen, elastin, proteoglikan, laminin dan fibronektin.
Peningkatan aktivitas MMP-12 berhubungan dengan penghancuran dan remodeling dari matriks ekstraselular, seperti invasi tumor, penyakit peridontal, reumatoid artritis, dan penyakit vaskular (obstruktif kronik) (Haq et al., 2010). Polimorfisme MMP-12-82A/G dalam area promotor telah terbukti memiliki efek pada ekspresi MMP-12. Pembawa alel A pada gen MMP-12 memiliki aktivitas transkripsi yang lebih tinggi dari pembawa alel G (Schirmer et al., 2009). Polimorfisme tersebut di area promotor dengan alel A akan mempengaruhi pengikatan faktor transkripsi Aktivator Protein-1 (AP-1) yang berhubungan dengan peningkatan aktivitas transkripsi (Wieczorek et al., 2013). Vlaykova dan Dimov (2011) dan Nguyen et al (2013), menyatakan bahwa substitusi alel A G pada posisi -82 di area yang berdekatan dengan elemen AP-1 binding site dan itu menunjukkan bahwa polimorfisme mempengaruhi pengikatan faktor transkripsi AP-1. Afinitas ikatan yang lebih tinggi dari AP-1 ke alel A berhubungan dengan aktivitas promotor MMP-12 yang lebih tinggi pada sel makrofag. Polimorfisme MMP-12-82A/G telah diselidiki berhubungan dengan resiko terjadinya PPOK. Nakamura, 2011 juga menemukan bahwa alel A berhubungan dengan penurunan fungsi paru pada polimorfisme -82A/G. Hal tersebut juga berkaitan dengan ketidakseimbangan protease-antiprotease dan stres oksidatif. Hunninghake et al., 2009 menemukan bahwa alel minor dari Single Nucleotide Polymorphism (SNP) di MMP-12 (-82A G) positif berhubungan dengan penurunan fungsi paru pada perokok dewasa sebagai faktor risiko pada PPOK. Berdasarkan HWE pada penelitian ini berada dalam keseimbangan dengan signifikansi nilai p HWE > 0,05. HWE menyatakan distribusi frekuensi alel dalam suatu populasi selalu konstan yaitu berada dalam satu kesetimbangan. HWE berfungsi sebagai
prediksi alel suatu populasi pada masa depan sehingga berkaitan pada penelitian yang berhubungan dengan polimorfisme. Terdapat beberapa jenis dari golongan gen MMP lain yang secara teori berhubungan secara signifikan dengan kejadian PPOK, misalnya MMP-1 dan MMP-9. Berdasarkan teori oksidan-antioksidan dan protease-antiprotease juga berhubungan dengan patogenesis PPOK. Berdasarkan temuan-temuan tersebut, telah diperoleh hasil yang berbeda yaitu ada yang mendapatkan hasil positif dan berhubungan dengan kejadian PPOK (p<0,05), tetapi ada pula yang hasilnya negatif dan tidak ditemukan hubungan antara polimorfisme MMP-12 dengan kejadian PPOK (p>0,05). Hal ini disebabkan pada populasi Indonesia yang diteliti pada studi ini hanya ditemukan distribusi genotip Homozigot AA dan Heterozigot AG sedangkan homozigot GG tidak ditemukan. Berdasarkan hasil yang paradoks tersebut, tidak terdapat hubungan yang signifikan yang dapat kita simpulkan.
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian polimorfisme gen MMP-12 dengan menggunakan sampel isolat DNA tersimpan penderita PPOK dan non PPOK dengan analisa statistik dan beberapa pembahasan dapat disimpulkan bahwa: 1. Tidak terdapat hubungan antara polimorfisme gen MMP-12 dengan kejadian PPOK dan non PPOK 2. Pada PPOK ditemukan distribusi genotip Homozigot AA berjumlah 28 dan Heterozigot AG berjumlah 2 3. Pada non PPOK ditemukan distribusi genotip Homozigot AA berjumlah 29 dan Heterozigot AG berjumlah 1 4. Isolat DNA tersimpan pada penelitian ini masih dalam kondisi cukup baik dan masih bisa digunakan untuk penelitian selanjutnya 5. Untuk analisa elektroforesis hasil RFLP dengan enzim restriksi Pvu II lebih baik menggunakan agarose 4% untuk memaksimalkan visualisasi, karena diantara band 137bp dan 119bp merupakan jarak yang tidak terlalu jauh. 6. Tidak ditemukan satupun alel GG pada distribusi genotip polimorfisme gen MMP-12 baik pada PPOK maupun non PPOK
5.2 Saran 1. Dilakukan penelitian lanjutan pada analisis polimorfisme gen MMP yang lain untuk melihat hubungannya dengan kejadian PPOK 2. Dilakukan penelitian lanjutan untuk mencari polimorfisme PPOK dari faktor yang lain seperti oksidan-antioksidan dan protease-antiprotease.