BAB III METODE PENELITIAN A. Variabel penelitian 1. Variabel bebas : variasi konsentrasi sabun yang digunakan. 2. Variabel tergantung : daya hambat sabun cair dan sifat fisik sabun 3. Variabel terkendali : Lamanya waktu perendaman kertas cakram dalamsabun cair B. Tempat Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Teknologi Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto, Laboratorium Botani dan Genetik program Studi Pendidikan Biolagi FKIP Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerta, Laboratorium Mikrobiologi Program Studi Pendidikan Biologi Fakultas Keguruan dan IImu Pendidikan Universitas Muhammadiyah Purwokerto. C. Alat dan Bahan 1. Alat yang digunakan Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan analitik, blender, sendok sungu, sudip, alat-alat gelas, penangas air, viscometer, cawan porselin, cawan pentri, lampu spritus, jarum ose, spatel, pinset, autoclave, incubator, Laminar Air Flow (LAF). 2. Bahan yang digunakan Ekstrak daun pepaya, KOH (PT Bratachem), minyak kelapa, EDTA (PT Bratachem), gliserin (PT Bratachem),aquades (PT Bratachem), isolat bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli (diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi FKIP UMP), media NA atau Natrium Agar dan NB atau Natrium Borth (derajat farmasetik merk Oxid yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi FKIP UMP). D. Jalannya Penelitian 14
1. Determinasi Tanaman Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Botani dan Genetika Program Studi Pendidikan Biologi FKIP Universitas Muhammadiyah Purwokerto. 2. Penyiapan Bahan Utama Daun papaya (Carica papaya L)diambil dari daerah Beji Kecamatan Kendungbanteng. Setelah dibersihkan dari kotoran, daun dikeringkan dengan panas matahari ditutup kain hitam. Selama pemanasan daun-daun tadi di balik supaya pemanasan merata dan cepat kering. Pengeringan dianggap cukup bila daun pepaya tadi sudah rapuh. Daun yang sudah kering di blender sampai menjadi serbuk. Serbuk yang diperoleh adalah simplisia daun pepaya. 3. Pembuatan Ekstrak Pembuatan ekstrak dilakukan dengan menggunakan metode maserasi dengan menggunakan etanol 70%.Satu bagian serbuk kering daun pepaya dimasukan dalam maserator, ditambahkan 10 bagian etanol 70%, direndam sambil sekali-kali diaduk selama 6 jam, kemudian didiamkan selama 24 jam. Maserat dipisahkan dan proses diulang 2 kali dengan jenis dan pelarut yang sama. Semua maserat dikumpulkan dan diuapkan dengan evaporator sampai diperoleh ekstrak kental (Badan POM, 2004: 18). 4. Evaluasi Ekstrak a. Susut pengeringan Ekstrak ditimbang dalam gelas arloji dicatat beratnya, kemudian dimasukkan dalam oven pada suhu 105 c selama 1 jam, lalu dinginkan dalam eksikator kemudian ditimbang lakukan pemanasan lagi sampai diperoleh selisih dua kali penimbangan tidak lebih dari 0,5 mg tiap gram sisa (Depkes RI,1979 :809). Susut pengeringan : b. Uji kelengketan Ekstrak kental sebanyak 1 mg dioleskan sebuah plat kaca, lalu kedua plat menyatu, kemudian ditekan dengan beban sebesar 1 kg selama 5 menit setelah itu beban dilepaskan,lalu diberi bebanpelepasan 80 gr untuk pengujian. Waktu yang dibutuhkan oleh kedua plat itu memisah dicatat dan dilakukan replikasi 3 kali (Trilestari, 2002).
5. Pembuatan sabun Daun papaya a. Formulasi sabun Formulasi sabun dibuat dengan komposisi : Tabel 1.Rancangan formulasi sediaan sabun cair ekstrak daun pepaya Bahan Formula 1 Formula 2 Formula 3 Formula 4 Ekstrak kental 5% 10% 15% - Minyak kelapa 30 ml 30 ml 30 ml 30 ml KOH 16 ml 16 ml 16 ml 16 ml EDTA 1 gram 1 gram 1 gram 1gram Asam stearat 0, 5 gram 0, 5 gram 0, 5 gram 0, 5 gram Gliserin 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml Aquades Ad 100 ml Ad 100 ml Ad 100 ml Ad 100 ml b. Cara kerja Semua bahan ditimbang, dimasukkan minyak kelapa sebanyak 30 ml ke dalam gelas kimia, kemudian ditambahkan dengan kalium hidroksida 40% sebanyak 16 ml sedikit demi sedikit sambil terus dipanaskan pada suhu 50 C sehingga mendapatkan sabun pasta. Sabun pasta ditambahkan dengan ± 25 ml aquades, Kemudian ditambahkan gliserin dan asam stearat, diaduk hingga homogen. Dimasukkan EDTA ke dalam campuran tersebut hingga homogen, lalu tambahkan ekstrak. Tambahkan aquadest sampai volumenya 100 ml lalu aduk hinggahomogen. Masukkan ke dalam wadah bersih yang telah disiapkan (Subagio, Boesro.2009). 6. Evaluasi sediaan sabun cair a. Pengamatan organoleptis Pengamatan organoleptis meliputi pengamatan perubahan-perubahan bentuk, warna, dan bau yang terjadi pada tiap rentang waktu tertentu selama 30 hari. Pengamatan organoleptis dilakukan pada minggu ke-0, 1, 2, 3 dan minggu ke-4. b. Pengukuran ph
Pengukuran ph menggunakan ph meter. Dengan cara mencelupkan ph meter kedalam sediaan sabun cair kemudian diamkan sesaat dan lihat angka yang muncul pada ph meter. ph sabun cair diukur tiap rentang waktu tertentu salama 1 bulan yaitu pada minggu ke-0, 1, 2, 3 dan minggu ke-4. c. Pengukuran viskositas Sediaan sebanyak 100 gram dimasukan ke dalam cup, kemudian dipasang spindle, diatur kecepatan rotasi per menitnya (rpm), dan rotor dijalankan. Hasil viskositas dicatat setelah viskotester menunjukan angka yang stabil.viskositas diukur tiap rentan dari minggu kesatu dan minggu keempat. 7. Uji aktivitas antibakteri sediaan sabun cair a. Sterilisasi alat dan bahan Pada uji antibakteri perlakuan harus dalam keadaan steril, untuk itu semua alat dan bahan yang digunakan juga harus dalam keadaan steril. Tujuan dari sterilisasi yaitu untuk membunuh mikroorganisme yang ada pada alat dan bahan, karena dikhawatirkan akan mengganggu jalannya penelitian. Sterilisasi dilakukan didalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit(hadioetomo RS, 1993 :55 ). b. Pembuatan medium Nutrient Agar ( NA) Pembuatan medium NA sebanyak 100 ml : timbang sebanyak 2, 3 gram NA masukkan ke dalam erlenmeyer dan dilarutkan dengan aquadest 100 ml kemudian panaskan agar larut sempurna. Selanjutnya larutan NA yang masih hangat dituang ke dalam tabung reaksi masing-masing 10 ml, lalu sterilkan dalam autoklaf pada suhu121 C selama 15 menit(hadioetomo RS, 1993 ). c. Pembuatan medium Nutrien Borth (NB) Pembuatan medium NB sebanyak 100 ml : timbang sebanyak 0, 8 gram NB masukkan ke dalam erlenmeyer dan dilarutkan dengan aquadest 100 ml kemudian panaskan agar larut sempurna. Selanjutnya larutan NB yang masih hangat dituang ke dalam tabung reaksi masing-masing 10 ml, lalu sterilkan dalam autoklaf pada suhu121 C selama 15 menit(hadioetomo RS, 1993 ). d. Peremajaan isolat Escherchia coli
Peremajaan isolat dilakukan dengan cara mengambil medium NA yang masih cair dan masukkan kedalam tabung reaksi lalu dimiringkan, biarkan memadat. Escherichia coli yang berasal dari stok diambil dengan jarum ose steril lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi NA padat secara aseptik dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. e. Penanaman isolat Escherchia coli Menumbuhkan isolat Escherichia coli dilakukan dengan cara mengambil bakteri Escherchia coli yang berasal dari stok dengan jarum ose steril lalu disuspensikan ke dalam tabung reaksi yang berisi NB secara aseptik, kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. f. Peremajaan isolat Staphylococcus aureus Peremajaan isolat dilakukan dengan cara mengambil medium NA yang masih cair dan masukkan kedalam tabung reaksi lalu dimiringkan, biarkan memadat Staphylococcus aureus yang berasal dari stok diambil dengan jarum ose steril lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi NA padat secara aseptik dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. g. Penanaman isolat Staphylococcus aureus Menumbuhkan isolat Staphylococcus aureus dilakukan dengan cara mengambil bakteri Staphylococcus aureus yang berasal dari stok dengan jarum ose steril lalu disuspensikan ke dalam tabung reaksi yang berisi NB secara aseptik, kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. h. Perhitungan jumlah bakteri Membuat suspensi bakteri dengan melakukan pengenceran berturut-turut 10 ¹ sampai 10 7 dengan aquadest. Kemudian diambil 0, 5 ml suspensi tersebut ditambahkan bersama dengan NA 12 ml yang masih hangat, lalu dimasukkan dalam masing-masing cawan petri dan digoyang-goyangkan dengan arah angka 8, biarkan memadat, setelah itu diinkubasi padasuhu 37 C selama 24 jam. Kekeruhannya dihitung dengan menggunakan perhitungan jumlah mikroba secara tidak langsung, dimana kekeruhannya memenuhi standar Mc Farlan(10 8 CFU/ml), selain itu juga jumlah koloni bakteri dalam cawan petri harus memenuhi standar uji yaitu 30-300 koloni ( Lay, 1994: 48).
i. Uji daya hambat Disiapkan 3 cawan petri diameter 9 cm dan 15 kertas cakram dengan diameter 5 mm. 5 kertas cakram direndam pada masing - masing formula sabun cairdan pada kontrol positif direndam 15 menit setelah itu kertas cakram dibalik dan direndam kembali selama 15 menit. Kemudian disetiap cawan petri yang telah berisi media NA dan isolat Escherichiacoli/Staphylococcusaureus diletakkan secara berurutan 5 kertas cakram yang telah direndam dari 4 formula sabun cair yang berbeda dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Diameter zona hambat diamati dan diukur. (Kontrol positif yang digunakanyaitu Ampisilin). Konterol ekstrak, masukan kertas cakram yang telah direndam pada ekstrak selama 15 menit. Kemudian disetiap cawan petri yang telah berisi media NA dan isolat Escherichiacoli/Staphylococcusaureus diletakkan secara berurutan 5 kertas cakram yang telah direndam dari 4 formula sabun cair yang berbeda dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. 7.Metode Analisis Berdasarkan data dari uji aktivitas antibakteri ekstrak daun pepaya dalam berbagai konsenterasi sabun cair, dilakukan analisis statistik diameter hambat dengan uji ANAVA, yaitu menggunakan metode RAL (Rancangan Acak Lengkap), apabila F hitung lebih besar dari F tabel, maka dilanjutkan dengan menggunakan metode BNT (Beda Nyata Terkecil) dengan taraf kepercayaan 95%.