BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Di alam populasi mikroorganisme tidak terpisah menjadi spesies tersendiri tetapi terdapat bersama-sama. Di laboratorium populasi campuran tersebut dapat dipisahkan menjadi kultur murni. Kultur murni mengandung hanya satu jenis organisme dan dapat dipelajari selanjutnya mengenai morfologi, sifat biokimia dan lain sebagainya. Koloni merupakan massa pertumbuhan mikroorgsnisme secara makroskopis dapat terlihat pada permukaan medium padat, masing-masing menunjukkan multiplikasi dari satu organisme. Teknik umum yang digunakan untuk mengisolasi koloni diskret harus dilakukan pengurangan jumlah inokulum. Dengan pengurangan tersebut, inokulasi berikutnya, maka sel akan terpisah cukup jauh dari sel lainnya pada permukaan medium agar sehingga terbentuk spesies berbeda akan terpisah. Beberapa teknik untuk isolasi adalah sebagai berikut : 1. Metode streak plate merupakan metode isolasi kualitatif yang dapat dilakukan dengan cepat. Perlu dilakukan teknik pengenceran dengan menggunakan ujung jarum inokulasi bulat untuk membantu menyebarkan kultur pada permukaan medium. 2. Teknik spread plate membutuhkan campuran mikroorganisme yang diencerkan sebelumnya. Selama inokulasi sel-sel akan terpisahkan ke 1
seluruh permukaan medium padat dengan menggunakan batang kaca yang berujung L sedang cawan petri di putar menggunakan suatu alat lazy-susan. 3. Teknik pour plate membutuhkan pengenceran seri dari kultur campuran dengan menggunakan jarum inokulasi atau pipet. Inokulum yang telah diencerkan kemudian ditambahkan ke dalam medium agar yang telah dicairkan ke dalam cawan petri, ocok kemudian biarkan membeku. 1.2 Tujuan Praktikum Adapun tujuan diadakannya praktikum kali ini adalah untuk mempelajari prosedur inokulasi untuk memisahkan kultur campuran sehingga dapat diisolasi koloni diskret. 1.3 Perumusan Masalah Permasalahan yang diangkat adalah bagaimanakah prosedur inokulasi untuk memisahkan kultur campuran sehingga dapat diisolasi diskret? 2
BAB II KAJIAN TEORI Isolasi bakteri adalah proses mengambil bakteri dari medium atau lingkungan asalnya dan menumbuhkannya di medium buatan sehingga diperoleh biakan yang murni. Bakteri dipindahkan dari satu tempat ke tempat lainnya harus menggunakan prosedur aseptik. Aseptik berarti bebas dari sepsis, yaitu kondisi terkontaminasi karena mikroorganisme lain. Teknik aseptik ini sangat penting bila bekerja dengan bakteri. Beberapa alat yang digunakan untuk menjalankan prosedur ini adalah bunsen dan laminar air flow Bila tidak dijalankan dengan tepat, ada kemungkinan kontaminasi oleh miroorganisme lain sehingga akan mengganggu hasil yang diharapkan. Teknik aseptik juga melindungi laboran dari kontaminasi bakteri (Singleton dan Sainsbury, 2006). Bakteri di alam umumnya tumbuh dalam populasi yang terdiri dari berbagai spesies. Oleh karena itu, untuk mendapatkan biakan murni, sumber bakteri harus diperlakukan dengan pengenceran agar didapat hanya 100-200 bakteri yang ditransfer ke medium, sehingga dapat tumbuh menjadi koloni yang berasal dari bakteri tunggal. Ada beberapa metode untuk menginokulasi bakteri sesuai dengan jenis medium tujuannya. Pada medium agar tegak, dilakukan metode tusuk menggunakan jarum ose. Pada medium agar miring, dilakukan metode gores dengan menggunakan loop ose. Pada medium petridisk, dapat digunakan 3
metode streak plate (metode gores), pour plate (metode tuang) atau spread plate (metode sebar) Setelah inokulasi, dilakukan proses inkubasi, yaitu menyimpan medium pada alat atau kontainer ada temperatur tertentu dan periode tertentu, sehingga tercipta lingkungan yang menyediakan kondisi cocok untuk pertumbuhan bakteri. (Harley dan Presscot, 2002). Metode gores atau streak plate menggunakan loop ose dan menggoreskannya ke permukaan medium agar dengan pola tertentu dengan harapan pada ujung goresan, hanya sel-sel bakteri tunggal yang terlepas dari ose dan menempel ke medium. Sel-sel bakteri tunggal ini akan membentuk koloni tunggal yang kemudian dapat dipindahkan ke medium selanjutnya agar didapatkan biakan murni. Metode tuang atau pour plate dilakukan dengan 2 cara, yaitu dengan mencampur suspensi bakteri dengan medium agar pada suhu 50ºC kemudian menuangkannya pada petridisk atau dengan menyemprotkan suspensi pada dasar petridisk, kemudian menuang medium agar keatasnya dan diaduk. Setelah agar mengeras, bakteri akan berada pada tempatnya masing-masing dan diharapkan bakteri tidak mengelompok sehingga terbentuk koloni tunggal. Metode sebar atau spread plate dilakukan dengan menyemprotkan suspensi ke atas medium agar kemudian menyebarkannya secara merata dengan trigalski. Dengan ini diharapkan bakteri terpisah secara individual, kemudian dapat tumbuh menjadi koloni tunggal. 4
Metode pemaparan pada udara terbuka adalah metode untuk mengisolasi bakteri udara. Metode ini sangat simpel, yaitu dengan memaparkan medium pada udara terbuka, dengan harapan ada bakteri yang menempel dan kemudian akan tumbuh menjadi koloni. Bakteri dapat ditumbuhkan dalam suatu medium agar dan akan membentuk penampakan berupa koloni. Koloni sel bakteri merupakan sekelompok masa sel yang dapat dilihat dengan mata langsung. Semua sel dalam koloni itu sama dan dianggap semua sel itu merupakan keturunan (progeny) satu mikroorganisme dan karena itu mewakili sebagai biakan murni. 5
BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Alat dan Bahan 1. Alat a. Ose. b. Inkubator. c. Cawan petri steril. d. Bunsen. e. Korek. 2. Bahan a. Nutrien agar (NA) dan nutrien broth (NB).biakan bakteri. B. Cara Kerja 1. Cara Goresan (Streak Plate Method) a. Cairkan nutrien agar dalam penangas air. b. Dinginkan sampai temperatur ± 50. c. Tuangkan medium agar tersebut ke dalam cawan petri steril secara aseptik dan biarkan sampai dingin dan padat. d. Ambil 1 ose suspensi bahan yang mengandung bakteri atau campuran bakteri secara aseptik, kemudian dibuat goresan pada permukaan agar. e. Cawan petri diberi label (etiket) kemudian dibungkus dan dibalik untuk mencegah terjadinya tetesan air pada permukaan agar dari hasil kondensasi uap air. f. Inkubasi dilakukan dengan posisi cawan terbalik pada suhu 30 0 C, minimal selama 1x24 jam g. Sesudah inkubasi akan terlihat koloni pada bekas goresan. Pada permulaan goresan akan terjadi pertumbuhan yang lebat setelah diinkubasikan, sehingga akan sukar diisolasi. 6
Tiap koloni yang terpisah mungkin berasal dari 1 macam sel bakteri. h. Salah satu koloni dipilih dari masing-masing tipe koloni yang tumbuh, kemudian diamati bentuk koloninya. 2. Cara Tuang (Pour Plate Method) a. Medium untuk pertumbuhan bakteri (nutrien agar) yang telah dicairkan dalam penangas air (100 C), dinginkan sampai temperatur 50 C, kemudian diinokulasikan dengan satu ose suspensi secara aseptis. b. Dituangkan ke dalam cawan petri steril berlabel secara aseptis, kemudian digoyang perlahan supaya cepat mengering. c. Diambil sampel sebanyak 1 ml dari masing-masing pengenceran berseri pada teknik dilusi dan dimasukkan ke dalam cawan petri steril, cawan segera ditutup agar terhindar dari kontaminan. d. Segera setelah media dimasukkan, cawan petri diputar secara perlahan-lahan di atas meja horizontal untuk mengaduk campuran media agar dengan dilusi kultur mikroba. e. Setelah memadat, cawan-cawan tersebut diletakkan dalam posisi terbalik. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar, minimal selama 1x24 jam. f. Karakteristik koloni yang tumbuh diamati. 3. Cara Sebar (Spread Methode) a. Pengenceran sampel sama seperti pada cara penuangan. b. Dengan memipet sebanyak 0,1 ml cairan dari botol pengencer dan biarkan cairan mengalir ke atas permukaan agar. 7
c. Cairan sampel disebarkan dengan penyebar yang terbuat dari gelas berbentuk huruf L. Pada teknik ini sterilisasi penyebar dilakukan dengan mencelupkan ke dalam alkohol dan kemudian dipanaskan sampai alkohol terbakar habis. d. Penyebar didinginkandahulu sebelum digunakan untuk menyebar cairan sampel pada permukaan agar. Penyebaran cairan contoh ( sampel ) dilakukan dengan memutar agar lempengan tersebut. 8
BAB IV HASIL PENGAMATAN Tabel. Macam-macam teknik isolasi No. Metode Isolasi Gambar Pengamatan 1 Streak Plate dan Pour Plate 2 Streak Plate Semua bakteri (E. coli, bakteri lingkungan dan bakteri di badan) 3 Pour Plate E. coli E. coli 9
No. Metode Isolasi Gambar Pengamatan 4 Pour Plate 5 Pour Plate Bakteri di badan (kaki) 6 Medium Cair Bakteri Lingkungan E. coli 10
BAB V PEMBAHASAN Dalam keadaan sebenarnya (di alam bebas) tidak ada bakteri yang hidup tersendiri terlepas dari spesies lainnya. Kerapkali bakteri patogen kedapatan bersama-sama bakteri saproba. Yang terakhir ini boleh disebut penyerbu yang membonceng (secondary invaders). Mungkin juga bakteri patogen yang membonceng. Untuk menentukan siapa pembonceng dan siapa yang diboncengi diberikan pedoman siapa yang kedapatan di situ lebih dulu, dan siapa yang datang terkemudian. Untuk menyendirikan suatu spesies ada dikenal beberapa cara, yaitu: 1. Dengan Pengenceran Cara ini pertama-tama dilakukan oleh Lister dalam tahun 1865. Ia berhasil memiara murni Streptococcus lactis yang diisolasikannya dari susu yang sudah masam. Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-macam spesies diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari enceran ini kemudian diambil 1 ml untuk diencerkan lagi. Dan dari pengenceran yang kedua ini diambil 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 ml untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni tumbuh dalam medium tersebut, tetapi mungkin juga kita hanya memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini kita memperoleh satu koloni murni, dan selanjutnya spesies 11
ini dapat kita jadikan biakan murni. Kalau kita belum yakin, bahwa koloni tunggal yang kita peroleh itu murni, kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel. 2. Dengan Penuangan Robert Koch (1843 1905) mempunyai metode yang lain, yaitu dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel ini kemudian disebarkan di dalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer. Dengan demikian yang diperoleh hanyalah suatu piaraan adukan. Setelah medium itu mengental, maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni-koloni yang masing-masing dapat dianggap murni. Dengan mengulang pekerjaan seperti tersebut di atas ini, maka akhirnya akan diperoleh biakan murni yang lebih terjamin. Dalam melakukan metode ini ada dua orang pembantu Koch yang sangat berjasa, yaitu Petri yang menciptakan cawan dengan tutup yang sekarang terkenal sebagai cawan Petri (Petri dish). Pembantu yang kedua ialah Hese yang menemukan agar-agar untuk menggantikan gelatin. Memang agar-agar ternyata lebih baik daripada gelatin untuk bahan pengental suatu medium. Agar-agar tidak lekas mencair, titik cairnya 95 o C. 3. Dengan Penggesekan Metode ini sekarang banyak digunakan, karena tidak begitu memakan waktu, tapi dengan cara ini maka bakteri anaerob tidak dapat 12
tumbuh. Jika ujung kawat inokulasi dibengkokkan, kemudian ujung itu setelah disentuhkan suatu koloni lalu digesekkan pada permukaan medium padat, maka beberapa waktu kemudian daripada itu (kurang lebih setelah 12 jam) akan tampaklah koloni-koloni yang letaknya tersebat di permukaan medium. Jika diadakan pemindahan sampel dari suatu koloni yang letaknya terpencil, maka akan diperoleh suatu biakan murni. Ada beberapa teknik penggesekan yakni : a. Goresan T Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan huruf T pada bagian luar dasar cawan petri. Inokulasikan daerah I sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung. Panaskan ose dan biarkan dingin kembali Gores ulang daerah I sebanyak 3-4 kali dan teruskan goresan di daerah II. Pijarkan kembali ose dan biarkan dinginkembali Prosedur di atasdiulangi untuk daerah III. b. Goresan Kuadran, teknik ini sama dengan goresan T, hanya lempengan agar dibagi menjadi 4. c. Goresan Radian Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan Ppijarkan ose dan dinginkan kembali 13
Putar lempengan agar 90 o dan bbuat goresan terputus dimulai dari bagian pinggir lempengan Putar lempengan agar 90 o dan buat goresan terputus di atas goresan sebelummya. Pijarkan ose. d. Goresan Sinambung Ambil satu mata ose suspensi dan goreskan setengah permukaan lempengan agar. Jangan pijarkan ose, putar lempengan 180 o, gunakan sisi mata ose yng sama dan gores pada sisa permukaan lempengan agar. 4. Dengan Mengucilkan Satu Sel (Sincle Cell Isolation) Kita mempunyai alat yang dapat mengambil satu bakteri dari sekian banyak, dengan tiada ikut sertanya bakteri lain. Alat semacam itu disebut mikropipet. Alat itu ditempatkan pada tangan-tangan suatu mikromanipulator. Dengan mikropipet dibuat beberapa tetesan bergantung pada suatu kaca penutup. Pekerjaan ini dilakukan di bawah obyektif mikroskop. Jika tampak suatu tetesan hanya mengandung satu bakteri, maka dengan lain mikropipet, tetesan tersebut dipindahkan ke suatu medium encer dengan maksud supaya bakteri tersebut berbiak dulu. Kemudian dari sini dapat diperoleh biakan murni. Metode ini sangat memerlukan kesabaran, lagi pula, mikromanipulator itu sangat mahal. 14
5. Dengan Inokulasi Hewan Metode ini didasarkan atas suatu kenyataan, bahwa tidak semua bakteri dapat tumbuh di dalam tubuh seekor hewan. Misal kita ambil dahak dari seseorang yang sedang menderita tbc. Jika dahak itu disuntikkan ke dalam tubuh tikus putih, maka bakteri-bakteri saproba yang ikut serta itu tidak akan bertahan, sehingga kemudian kita peroleh semata-mata basil tbc saja. Biakan Pneumococcus murni dapat diperoleh dengan jalan demikian juga. Bakteri yang ketinggalan dalam tubuh tikus yang sakit atau mati itu akhirnya dapat dipindahkan ke dalam medium yang sesuai. Inokulasi dapat dilakukan di dalam kulit (intracutaneous), dapat di bawah kulit (subcutaneous), dapat di dalam otot (intramuscular), dapat di dalam rongga tubuh atau lain-lain tempat lagi (Redi). 15
BAB VI KESIMPULAN Dari uraian di atas dapat disimpulkan bahwa teknik isolasi kultur murni dapat dilakukan dengan menggunakan metode antara lain ; 1. Teknik pengenceran 2. Teknik penuangan 3. Teknik penggoresan 4. Teknik penyebaran 5. Cara pengucilan satu sel Dan teknik yang dilakukan adalah dengan teknik penggoresan (streak - plate), ini cara yang paling umum dan ekonomis. Namun memerlukan keterampilan. Ada beberapa metode untuk mengisolasi bakteri diantaranya metode streak plate, spread plate dan pour plate. Metode streak plate tekniknya sulit dilakukan namun kontaminan mudah dibedakan. Metode pour plate, mudah dilakukan dan dapat ditumbuhi mikrobia aerob maupun anaerob tetapi kontaminan sulit dibedakan. Metode spread tehniknya sama dengan pour plate tetapi menggunakan alat untuk menyebar medianya. 16
DAFTAR PUSTAKA Barazandeh, N. 2008. Microbiology Titles. Jerman. Springer-Verlag Berlin Heidelberg Media, pp 9-11 Pelczar, M.J.Jr, and E. Chan.1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. Penerbit UI Press. Jakarta. p:23-24. Prescott, L. M, J. P. Harley, dan D. A. Klein. 2008. Microbiology. 7 th Ed. McGraw-Hill Book Company Inc. USA, p: 113-116 Seiler, J. P. 2000. Good Laboratory Practice. Swiss. Springer-Verlag Berlin Heidelberg Media, p 61. Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang, p: 61-67. 17