ANALISA KUALITATIF DAN KUANTITATIF KARBOHIDRAT Analisis Kualitatif Karbohidrat dengan zat tertentu akan menghasilkan warna tertentu yg dapat dgunakan untuk analisis kualitatif. Beberapa reaksi yg lebih spesifik dpt membedakan golongan karbohidrat. Banyak cara untuk mengetahui atau mengidentifikasi karbohidrat dalam suatu bahan alam, diantaranya adalah sebagai berikut: 1. Uji Molisch Prinsip reaksi ini adalah dehidrasi senyawa karbohidrat oleh asam sulfat pekat. Dehidrasi heksosa menghasilkan senyawa hidroksi metil furfural, sedangkan dehidrasi pentose menghasilkan senyawa fulfural. Uji positif jika timbul cincin merah ungu yang merupakan kondensasi antara furfural atau hidroksimetil furfural dengan a-naftol dalam pereaksi molish.uji molisch adalah uji kimia kualitatif untuk mengetahui adanya karbohidrat. Uji ini untuk semua jenis karbohidrat. Mono-, di-, dan polisakarida akan memberikan hasil positif. Sampel yang diuji dicampur dengan reagent Molisch, yaitu -naphthol yang terlarut dalam etanol 95%. Setelah pencampuran atau homogenisasi, H 2 SO 4 pekat perlahan-lahan dituangkan melalui dinding tabung reaksi agar tidak sampai bercampur dengan larutan atau hanya membentuk lapisan. H 2 SO 4 pekat (dapat digantikan asam kuat lainnya) berfungsi untuk menghidrolisis ikatan pada sakarida untuk menghasilkan furfural. Furfural ini kemudian bereaksi dengan reagent Molisch, -naphthol membentuk cincin yang berwarna ungu. Reaksi :.
KH (pentose) + H 2 SO 4 pekat furfural + α-naftol warna ungu KH (heksosa) + H 2 SO 4 pekat HM-furfural + α-naftol warna ungu Kedua macam reaksi diatas berlaku umum, baik untuk aldosa (-CHO) maupun karbohidrat kelompok ketosa (C=O). 1. Masukkan 15 tetes larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang masih kering danbersih 2. Tambahkan 3 tetes pereaksi Molisch. Campurkan dengan baik. 3. Miringkan tabung rekasi, lalu alirkan dengan hati-hati 1 ml H 2 SO 4 pekat melalui dinding tabung supaya tidak bercampur. 4. Perhatikan terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas antara kedua lapisan yangmenandakan reaksi positif karbohidrat. 5. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya. 6. Lakukan tes terhadap larutan glukosa, galaktosa, laktosa, sukrosa, maltosa, arabinosa,larutan 1% amilum dan selulosa (kapas) yang disuspensikan dalam air. 2. Uji Benedict Uji Benedict adalah uji kimia untuk mengetahui kandungan gula (karbohidrat) pereduksi (yang memiliki gugus aldehid atau keton bebas). Gula pereduksi meliputi semua jenis monosakarida dan beberapa disakarida seperti laktosa, glukosa dan maltosa. Uji benedict berdasarkan reduksi Cu 2+ menjadi Cu + oleh gugus aldehid atau keton bebas dalam suasana alkalis, biasanya ditambahkan zat pengompleks seperti sitrat atau tatrat untuk mencegah terjadinya pengendapan CuCO 3.
Uji positif ditandai dengan terbentuknya endapan merah bata, kadang disertai dengan larutan yang berwarna hijau, merah, atau orange. Pada uji Benedict, pereaksi ini akan bereaksi dengan gugus aldehid, kecuali aldehid dalam gugus aromatik, dan alpha hidroksi keton. Oleh karena itu, meskipun fruktosa bukanlah gula pereduksi, namun karena memiliki gugus alpha hidroksi keton, maka fruktosa akan berubah menjadi glukosa dan mannosa dalam suasana basa dan memberikan hasil positif dengan pereaksi benedict. Untuk mengetahui adanya monosakarida dan disakarida pereduksi dalam makanan, sample makanan dilarutkan dalam air, dan ditambahkan sedikit pereaksi benedict. Dipanaskan dalam waterbath selama 4-10 menit. Selama proses ini larutan akan berubah warna menjadi biru (tanpa adanya glukosa), hijau, kuning, orange, merah dan merah bata atau coklat (kandungan glukosa tinggi). Sukrosa (gula pasir) tidak terdeteksi oleh pereaksi Benedict. Sukrosa mengandung dua monosakrida (fruktosa dan glukosa) yang terikat melalui ikatan glikosidik sedemikian rupa sehingga tidak mengandung gugus aldehid bebas dan alpha hidroksi keton. Sukrosa juga tidak bersifat pereduksi. Pengamatan yang dilakukan dalam uji Benedict ini dapat dilakukan dengan mengamati perubahan warna dan terjadinya endapan. Warna larutan dapat terlihat bermacam-macam tergantung dari konsentrasi karbohidrat yangg dipakai, larutan dapat berwarna hijau, hijau kebiruan dan kuning. Pada uji Benedict terhadap glukosa dan fruktosa larutan berwarna hijau kebiruan dan terdapat endapan merah bata di dalamnya yang menandakan pengujian positif, sedangkan pada maltosa dan laktosa larutan memiliki warna hijau kebiruan tanpa endapan merah batahal ini menunjukan bahwa pengujian positif terdapat gula di dalamnya, tetapi pada pengujian terhadap sukrosa dan pati warna yang terlihat adalah biru menandakan bahwa hasil uji negatif mengindikasikan bahwa sukrosa dan pati tidak memiliki gula pereduksi yang dapat mereduksi reagen benedict. Uji Benedict dapat dilakukan pada urine untuk mengetahui kandungan glukosa. Urine yang mengandung glukosa dapat menjadi tanda adanya penyakit diabetes. Sekali urine diketahui mengandung gula pereduksi, test lebih jauh mesti dilakukan untuk memastikan jenis gula pereduksi apa yang terdapat dalam urine. Hanya glukosa yang mengindikasikan penyakit diabetes. Berikut reaksi yang berlangsung: Reaksi: R-COH + CuO Cu 2 O (s) + R-COOH Atau KH + camp CuSO4, Na-Sitrat, Na 2 CO 3 Cu 2 O (endapan merah bata)
Pereaksi Benedict : Satu liter pereaksi Benedict dapat dibuat dengan menimbang sebanyak 100 gram natrium karbonat anhydrous (Na2CO3), 173 gram natrium sitrat, dan 17,3 gram tembaga (II) sulfat pentahydrate, kemudian dilarutkan dengan akuadest sebanyak 1 liter. 1. Masukkan 3 tetes larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang masih kering dan bersih 2. Tambahkan 2 ml pereaksi Benedict, kemudian dikocok. 3. Masukan kedalam penangas air selama 5 menit. Amati perubahan warna endapannya. 4. Pembentukan warna endapan hijau, kuning, atau merah menunjukan reaksi positif karbohidrat. 5. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya. 6. Lakukan percobaan ini dengan menggunakan larutan glukosa, galaktosa, maltosa,fruktosa, laktosa, sukrosa dan larutan amilum. 3. Uji Barfoed Uji ini untuk membedakan monosakarida dan disakarida dengan jalan mengontrol kondisi-kondisi percobaan, seperti ph dan waktu pemanasan. Pada analisa ini, karbohidrat direduksi pada suasana asam. Disakarida juga akan memberikan hasil positif bila didihkan cukup lama hingga terjadi hidrolisis. Uji Barfoed menggunakan reagen Barfoed yang terdiri dari tembaga asetat dan asam asetat glacial sebagai pereaksi. Diketahui bahwa disakarida merupakan agen pereduksi yang lemah, mereka tidak membentuk ion kupri pada reagen Barfoed yang ada dalam keadaan asam, sedangkan monosakarida merupakan agen pereduksi yang kuat dan mampu membentuk ion kupri dalam reagen Barfoed dalam keadaan asam karena itu uji Barfoed ini digunakan untuk membedakan disakarida pereduksi dengan monosakarida pereduksi dalam suatu sampel. Pada proses pengujian, larutan dipanaskan, pemanasan terhadap sampel membantu asamasetat glacial menghidrolisis disakarida menjadi monosakarida yang kemudian akanmereduksi reagen, karena itu perbedaan waktu yang ada menjadi indikasi perbedaan terhadap monosakarida pereduksi dan disakarida pereduksi. Monosakarida pereduksi ditandai dengan terjadinya endapan merah bata kupro oksida (Cu 2 O) pada saat di panaskan dalam kurun waktu dua sampai tiga menit sedangkan disakarida pereduksi di tandai dengan pembentukan endapan merah bata kupro oksida (Cu 2 O) dalam kurun waktu sepuluh sampai dua belas menit.
KH + camp CuSO 4 dan CH 3 COOH Cu 2 O endapan merah bata 1. Masukkan 1 ml larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang masih kering dan bersih. 2. Tambahkan 1 ml pereaksi Barfoed, kemudian dikocok. 3. Masukan kedalam penangas air selama 3 menit. 4. Kemudian didinginkan dalam air mengalir. 5. Bila tidak terjadi reduksi selama 5 menit, lakukan pemanasan selama 15 menit sampai terlihat adanya reduksi. 6. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya 7. Lakukan percobaan ini dengan larutan glukosa, galaktosa, laktosa, sukrosa dan maltosa. 4. Uji Seliwanoff Uji Seliwanoff bertujuan untuk mengeahui adanya ketosa (karbohidrat yang mengandung gugus keton). Pada pereaksi seliwanoff, terjadi perubahan oleh HCl panas menjadi asam levulinat dan 4-hidroksilmetilfurfural. Jika dipanaskan karbohidrat yang mengandung gugus keton akan menghasikan warna merah pada larutannya. Disakarida sukrosa yang mudah dihidrolisa menjadi glukosa dan fruktosa memberi reaksi positif dengan uji Seliwanoff. Glukosa dan karbohidrat lain dalam jumlah banyak dapat juga memberi warna yang sama. Pada pengujian dilakukan pemanasan pada larutan, pemanasan akan membantu proses hidrolisis disakarida yang akan menghasilkan monosakarida ketosa, dan kemudian member warna. Keberadaan HCl dalam reagen pada saat fruktosa yang berada dalam golongan ketosa bereaksi dengannya akan menghasilkan warna merah cherry dengan struktur kimia yang kompleks. Sebaliknya golongan disakarida seperti maltosa dan laktosa tidak bereaksi (negatif) pada saat mereka dihidrolisis menjadi monosakarida aldosa, dengan kata lain aldosa tidak bereaksi dalam uji Seliwanoff ini. Pada dasarnya uji ini memiliki dua tahapan penting yang harus dilewati pada pendidihan,yaitu proses dehidrasi yang dialami fruktosa oleh reagen Seliwanoff yang menghasilkan pembentukan hidroksi metil furfural dan kondensasi hidroksi metil furfural dengan resorcinol sehingga membentuk senyawa kompleks berwarna merah cherry. Hasil yang didapat pada uji ini dapat diidentifikasi dari warna larutan yang berubah pada saat bereaksi. Jika sampel berubah menjadi
warna merah cherry, itu menunjukan bahwa di dalam sampel terdapat ketosa, tetapi jika sampel berwarna biru kehijauan atau peach menunjukan bahwa sampel memiliki aldosa. KH (ketosa) + H 2 SO 4 furfural + resorsinol warna merah. KH (aldosa) + H 2 SO 4 furfural + resorsinol negatif 1. Masukkan beberapa tetes larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang telah diisi 2 ml pereaksi Seliwanoff. 2. Masukan kedalam penangas air selama 1 menit. Perhatikan perubahan warna yangterjadi. 3. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya 4. Lakukan percobaan ini dengan larutan fruktosa, glukosa, dan sukrosa. 5. Terjadinya perubahan warna merah dan endapan menunjukan reaksi positif untuk ketosa, bila endapan dilarutkan dalam alcohol terjadi larutan berwarna merah. 5. Uji Fehling Prinsip reaksi ini yaitu menggunakan gugus aldehid pada gula untuk mereduksi senyawa Cu2SO4 menjadi Cu2O (enpadan berwarna merah bata) setelah dipanaskan pada suasana basa (Benedict dan Fehling) atau asam (Barfoed) dengan ditambahkan agen pengikat (chelating agent) seperti Na-sitrat dan K-Na-tatrat. Reaksi : 6. Uji Tollens
Uji ini untuk positif terhadap karbohidrat pentosa yang membedakannya dengan heksosa. Aldehidadapat mereduksi pereaksi Tollens sehingga membebaskan unsur perak (Ag). Pereaksi tollens, pengoksidasi ringan yang digunakan dalam uji ini, adalah larutan basa dari perak nitrat. Larutannya jernih dan tidak berwarna. Untuk mencegah pengendapan ion perak sebagai oksida pada suhu tinggi, maka ditambahkan beberapa tetes larutan amonia. Amonia membentuk kompleks larut air dengan ion perak. Pereaksi Tollens mengandung ion diammin perak(i), [Ag(NH 3 ) 2 ] +. Ion ini dibuat dari larutan perak (I) nitrat. Caranya dengan memasukkan setetes larutan natrium hidroksida ke dalam larutan perak (I) nitrat yang menghasilkan sebuah endapan perak (I) oksida, dan selanjutnya tambahkan larutan amonia encer secukupnya untuk melarutkan ulang endapan tersebut. Pereaksi Tollens sering disebut sebagai perak amoniakal. Endapan perak pada uji ini akan menempel pada tabung reaksi yang akn menjadi cermin perak. Oleh karena itu Pereaksi Tollens sering juga disebut pereaksi cermin perak. 1. Masukkan beberapa tetes larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang telah diisi2 ml pereaksi Tollens. 2. Masukan kedalam penangas air selama 1 menit. Perhatikan perubahan warna yangterjadi. 3. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya 4. Lakukan percobaan ini dengan larutan arabinosa, glukosa dan gummi arabikum. 7. Uji Osazon Pada uji Osazon, yang mendasarinya adalah pemanasan karbohidrat yang memiliki gugus aldehida atau keton bersama fenilhidrazin berlebihan akan membentuk hidrazon atau osazon. Osazon yang terbentuk mempunyai bentuk kristal dan titik lebur yang spesifik. Osazon dari disakarida larut dalam air mendidih dan terbentuk kembali bila didinginkan, namun sukrosa tidak membentuk osazon karena gugus aldehida dan keton yang terikat pada monomernya sudah tidak bebas, sebaliknya osazon monosakarida tidak larut dalam air mendidih. Beberapa larutan uji menunjukkan reaksi positif dengan membentuk kristal berwarna kuning yang disebut dengan osazon yaitu larutan fruktosa dan galaktosa dan larutan lainnya tidak membentuk kristal osazon.
Setelah diamati di bawah mikroskop, bentuk kristal dari fruktosa adalah pentagonal sedangkan pada galaktosa segi empat runcing. 1. Masukkan 5 ml larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi. 2. Masukkan campuran fenil hidrazon Na-asetat kering. 3. Kocok dan panaskan dalam penangas air selama 30 menit. 4. Dinginkan, kemudian diperiksa endapan yang terbentuk di bawah mikroskop. 5. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya. 6. Lakukan percobaan ini dengan larutan arabinosa, sukrosa, glukosa, fruktosa, maltosa,dan galaktosa 8. Uji Iodium Karbohidrat dengan golongan polisakarida akan memberikan reaksi dengan larutan iodium dan memberikan warna yang spesifik bergantung pada jenis karbohidratnya. Analisa dengan iodin akn berwarna biru, amilopektin dengan iodin akan berwarna merah violet, glikogen dengan iodin akan berwarna merah cokelat, begitu juga dengan dekstrin. Uji Iodium Dilakukan untuk menentukan polisakarida. Larutan uji dicampurkan dengan larutan iodium. Hasil positif ditandai dengan amilum dengan iodium berwarna biru, dan dekstrin dengan iodium berwarna merah anggur. KH (poilisakarida) + Iod (I 2 ) warna spesifik (biru kehitaman) 1. 2 ml larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi atau porselin tetes. 2. Kemudian ditambahkan dua tetes larutan iodium.
3. Kemudian warna spesifik yang tebentuk diamati. 9. Uji Fermentasi Dalam ragi terdapat enzim-enzim yang dapat mencerna amilum sampai menjadi CO 2 dan H 2 O, juga terdapat enzim sukrosa (invertase) maupun fruktokinase. Oleh karena amilum, glukosa, fruktosa, maltosa, dan sukrosa dapat diragikan. Dalam ragi tidak terdapat laktosa, maka laktosa tidak dapat dipecahkan. Hal ini dapat digunakan untuk membedakan apakah gula dalam urin glukosa atau fruktosa. Enzim ragi pada umumnya baik bekerja pada temperatur 37 o C 40 o C. Analisis Kuantitatif Kadar karbohidrat dalam berbagai bahan makanan dapat ditentukan dengan berbagai cara, diantaranya cara kimiawi, cara fisik, cara enzimatik atau biokimia dan cara kromatografi. Penentuan karbohidrat yang termasuk polisakarida maupun oligosakarida memerlukan pendahuluan yaitu hidrolisis lebih dahulu sehingga diperoleh monosakarida. Untuk keperluan ini, maka bahan dihidrolisa dengan asam atau enzim pada suatu keadaan tertentu. Salah satu metode yang dapat digunakan adalah Luff Schoorl. Penentuan kadar karbohidrat pada percobaan dengan metode Luff Schoorl dibagi atas tiga tahapan, yaitu: 1. Tahap sebelum inversi 2. Tahap setelah inversi lemah 3. Tahap setelah inversi kuat
Pada penentuan karbohidrat dengan metode Luff Schoorl, yang ditentukan bukan Cu 2 O yang mengendap tapi dengan menggunakan CuO dalam larutan yang belum direaksikan dengan gula reduksi (titrasi blanko) dan sesudah direaksikan dengan gula reduksi (titrasi sampel). Penentuannya dengan menggunakan titrasi volumetri. Setelah diketahui selisih banyaknya titrasi blanko dan titrasi sampel kemudian dikonsultasikan dengan tabel yang telah tersedia yang menggambarkan hubungan antara banyaknya Na 2 S 2 O 3 dengan banyaknya gula pereduksi. Pada metode Luff Schoorl terdapat dua cara pengukuran yaitu : 1. Penentuan Cu tereduksi dengan I 2 2. Menggunakan prosedur Lae-Eynon Metode Luff Schoorl mempunyai kelemahan yang terutama disebabkan oleh komposisi yang konstan. Hal ini diketahui dari penelitian A.M Maiden yang menjelaskan bahwa hasil pengukuran yang diperoleh dibedakan oleh pebuatan reagen yang berbeda. Monosakarida akan mereduksikan CuO dalam larutan Luff menjadi Cu 2 O. Kelebihan CuO akan direduksikan dengan KI berlebih, sehingga dilepaskan I 2. I 2 yang dibebaskan tersebut dititrasi dengan larutan Na 2 S 2 O 3. Pada dasarnya prinsip metode analisa yang digunakan adalah Iodometri karena kita akan menganalisa I 2 yang bebas untuk dijadikan dasar penetapan kadar. Dimana proses iodometri adalah proses titrasi terhadap iodium (I 2 ) bebas dalam larutan. Apabila terdapat zat oksidator kuat (misal H 2 SO 4 ) dalam larutannya yang bersifat netral atau sedikit asam penambahan ion iodida berlebih akan membuat zat oksidator tersebut tereduksi dan membebaskan I 2 yang setara jumlahnya dengan dengan banyaknya oksidator. I 2 bebas ini selanjutnya akan dititrasi dengan larutan standar Na 2 S 2 O 3 sehinga I 2 akan membentuk kompleks iod-amilum yang tidak larut dalam air. Oleh karena itu, jika dalam suatu titrasi membutuhkan indikator amilum, maka penambahan amilum sebelum titik ekivalen. Metode Luff Schoorl ini baik digunakan untuk menentukan kadar karbohidrat yang berukuran sedang. Dalam penelitian M.Verhaart dinyatakan bahwa metode Luff Schoorl merupakan metode tebaik untuk mengukur kadar karbohidrat dengan tingkat kesalahan sebesar 10%. Persamaan reaksinya: R-COH + 2 CuO Cu 2 O (s) + R-COOH (aq) H 2 SO 4 (aq) + CuO CuSO 4 (aq) + H 2 O (l) CuSO 4 (aq) + 2 KI (aq) CuI 2 (aq) + K 2 SO 4 (aq)
2 CuI 2 Cu 2 I 2 + I 2 I 2 + Na 2 S 2 O 3 Na 2 S 4 O 6 + NaI I 2 + amilum Biru Penetapan sebelum inversi dilakukan untuk mengetahui jumlah gula pereduksi yang terdapat dalam sampel. Penetapan inversi lemah dilakukan untuk mengetahui jumlah disakarida yang tidak bersifat reduksi seperti sukrosa. Penetapan sesudah inversi kuat biasanya dilakukan untuk menentukan kadar karbohidrat pada poliskarida.