PENETAPAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE KJELDAHL 1. Tujuan Percobaan - Mahasiswa dapat melakukan analisis kadar protein dalam suatu bahan pangan - Mahasiswa dapat mengetahui kadar protein dalam bahan 2. Peralatan dan Bahan - Pemanas Kjeldahl lengkap yang dihubungkan dengan pengisap uap aspirator - Labu Kjeldahl berukuran 30 ml / 50 ml - Alat destilasi lengkap dengan erlenmeyer berpenampung berukuran 125 ml - Buret 25 ml/50ml - Neraca analitik dengan ketelitian ± 0,1 - Tepung terigu cakra 3. Dasar Teori Protein merupakan suatu zat makanan yang amat penting bagi tubuh karena zat ini disampng berfungsi sebagai bahan bakar dalam tubuh juga berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur. Protein adalah sumber asam-asam amino yang mengandung unsur-unsur C,H,O dan N. Senyawa ini digunakan terutama untuk pembentukan dan regenerasi daripada jaringan-jaringan yang rusak, dapat berfungsi sebagai enzim, antibodi dan merupakan bagian dari cairan tubuh seperti darah, susu dan lain-lain. Protein memiliki beberapa sifat yang besar sekali pengaruhnya terhadap bahan makanan seperti: - Perbedaan rasa dan tekstur dari berbagai jenis daging (ayam,sapi, kambing dan sebagainya) - Konfigurasi protein dapat diubah dengan perlakuan fisik maupun kimia, misalnya putih telur yang terdenaturasi oleh pemanasan air susu akan menghasilkan crude dengan penambahan asam - Protein dapat mengalamai degradasi yaitu pemecahan molekul kompleks menjadi molekul yang lebih sederhana. Hasil degradasi protein berbentuk sebagai berikut: protease-pepton-polipeptida-peptida-asam amino-amoniakunsur N
Kadar protein dalam penetapan ini didefinisikan sebagai senyawa nitrogen yang terdapat dalam contoh diubah menjadi ammonium sulfat, ammonia yang dihasilkan dari penambahan natrium hidroksida ( NaOH) yang didestilasi diikat suatu asam, kemudian kadar nitrogen yang diperoleh dikalikan suatu angka faktor. Penetapan protein berdasarkan oksidasi bahan-bahan berkarbon dan konversi nitrogen menjadi ammonia. Selanjutnya amonia bereaksi menjadi basa dan amonium sulfat. Larutan dibuat menjadi basa dan amonia diuapkan untuk kemudian diserap dalam larutan asam borat. Nitrogen yang terkandung dalam larutan dapat ditentukan jumlahnya dengan titrasi menggunakan HCL 0,02 N. Kemudian kadar nitrogen yang diperoleh dikalikan suatu angka faktor. Pereaksi 1. Asam sulfat pekat, berat jenis 1,84 2. Air raksa oksida 3. Kalium sulfat 4. Larutan natrium hidroksida-natrium tiosulfat ( Larutkan 60 gr NaOH dan 5 gr Na 2 S 2 O 3. 5 H 2 O dalam 1 liter) 5. Larutan asam borat jenuh 6. Larutan asam klorida 0,02 N 7. Larutan indikator ( campuran 2 bagian metil red 0,2 % dalam alkohol dan 1 bagian metilen blue 0,2 % dalam alkohol)
Dasar Teori Tambahan Protein merupakan suatu zat makanan yang amat penting bagi tubuh., karena zat ini di samping berfungsi sebagai bahan baker dalam tubuh juga berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur. Protein adalah sumber asam-asam amino yang mengandung unsurunsur C,H,O dan N yang tidak di miliki oelh lemak dan karbohidrat. Molekul protein mengandung pula fosfor, belerang, dan ada jenis protein yang mengandung unsure logam seperti besi dan tembaga. Sebagai zat pembangun protein merupakan bahan pembentuk jaringan-jaringan baru yang selalu terjadi dalam tubuh. Pada masa pertumbuhan proses pembentukan jaringan terjadi secara besarbesaran, pada masa kehamilan droteinlah yang membenuk jaringan janin dan pertumbuhan embrio. Protein juga mengganti jaringan tubuh yang rusak dan yang di rombak. Fungsi utama protein bagi tubuh ialah untuk membentuk jaringan baru dan mempertahankan jaringan yang telah ada. Protein dapat juga di gunakan untuk bahan baker apabila keperluan energi tunbuh tidak terpenuhi oleh karbohidrat dan lemak. Protein ikut pula mengatur berbagai proses tubuh baik langsung maupun tidak langsung dengan membentuk zat-zat pengatur proses dalam tubuh. Protein mengatur keseimbangan cairan dalam jaringan dan pembuluh darah, yaitu dengan menimbulkan tekanan osmotic koloid yang dapat menarik cairan dari jaringan ke dalam pembuluh darah. Sifat atmosfer protein yang yapat bereaksi dengan asam dan basa, dapat mengatur keseimbangan asam-basa dalam tubuh. Protein dalam tubuh manusia, terutama dalam sel jaringan, bertindak sebagai bahan membrane sel, dapat membentuk jaringan pengikat misalnya kolagen dan elastin, serta membentuk protwin yang inert seperti rambut dan kuku. Di samping itu protein yang bekerja sebagai enzim, bertindak sebagai plasma (albumin), membentuk antibody, membentuk komplek dengan molekul lain, serta dapat bertindak sebagai bagian sel yang bergerak. Kekurangan
protein dalam waktu lama dapat menggaggu berbagai proses dalam tubuh dan menurunnkan daya tahan tubuh terhadap penyakit. Metode Kjeldahl merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan dengan alkali kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi. Metode ini telah banyak mengalami modifikasi. Metode ini cocok digunakan secara semimikro, sebab hanya memerlukan jumlah sampel dan pereaksi yang sedikit dan waktu analisa yang pendek. Metode ini kurang akurat bila diperlukan pada senyawa yang mengandung atom nitrogen yang terikat secara langsung ke oksigen atau nitrogen. Tetapi untuk zat-zat seperti amina, protein,dan lain lain hasilnya lumayan. Cara Kjeldahl digunakan untuk menganalisis kadar protein kasar dalam bahan makanan secara tidak langsung, karena yang dianalisis dengan cara ini adalah kadar nitrogennya. Dengan mengalikan hasil analisis tersebut dengan angka konversi 6,25, diperoleh nilai protein dalam bahan makanan itu. Untuk beras, kedelai, dan gandum angka konversi berturut-turut sebagai berikut: 5,95, 5,71, dan 5,83. Angka 6,25 berasal dari angka konversi serum albumin yang biasanya mengandung 16% nitrogen. Prinsip cara analisis Kjeldahl adalah sebagai berikut: mula-mula bahan didestruksi dengan asam sulfat pekat menggunakan katalis selenium oksiklorida atau butiran Zn. Amonia yang terjadi ditampung dan dititrasi dengan bantuan indikator. Cara Kjeldahl pada umumnya dapat dibedakan atas dua cara, yaitu cara makro dan semimakro. 1. Cara makro Kjeldahl digunakan untuk contoh yang sukar dihomogenisasi dan besar contoh 1-3 g. 2. Cara semimikro Kjeldahl dirancang untuk contoh ukuran kecil yaitu kurang dari 300 mg dari bahan yang homogen. Cara analisis tersebut akan berhasil baik dengan asumsi nitrogen dalam bentuk ikatan N-N dan N-O dalam sampel tidak terdapat dalam jumlah yang besar. Kekurangan cara analisis ini ialah bahwa purina, pirimidina, vitamin-vitamin, asam amino besar, kreatina, dan kreatinina ikut teranalisis dan terukur sebagai nitrogen protein. Walaupun demikian, cara ini kini masih digunakan dan dianggap cukup teliti untuk pengukuran kadar protein dalam bahan makanan.
Analisa protein cara Kjeldahl pada dasarnya dapat dibagi menjadi tiga tahapan yaitu proses destruksi, proses destilasi dan tahap titrasi : 1. Tahap destruksi 2. Tahap destilasi 3. Tahap titrasi Kandungan nitrogen kemudian dapat dihitung sebagai berikut: %N = ml NaOH blanko ml NaOH sampel N. HCl 14,008 100% Gram bahan x 1000 Setelah diperoleh %N, selanjutnya dihitung kadar proteinnya dengan mengalikan suatu faktor. Besarnya faktor perkalian N menjadi protein ini tergantung pada persentase N yang menyusun protein dalam suatu bahan. Kadar protein (%) = % N x faktor konversi. Tabel Nilai Faktor Koreksi Sampel Pada Bahan Pangan : N Bahan Pangan o 1 Sereal 5,7 2 Roti 5,7 3 Sirup 6,25 4 Biji-bijian 6,25 5 Buah 6,25 6 Beras 5,95 7 Susu 6,38 8 Kelapa 5,20 9 Kacang Tanah 5,46 Faktor Koreksi Tiga Tahapan dalam analisa protein dengan metode Kjeldahl: a. Proses destruksi (Oksidasi) Tahapan pertama penentuan kadar protein ini yaitu destruksi, destruksi protein meliputi gangguan dan kerusakan yang mungkin terjadi pada struktur sekunder dan tersier protein. Sampel g ditimbang, kemudian ditambahkan HgO dan K 2 SO 4 sebagai katalis. Destruksi merupakan proses pengubahan N protein menjadi ammonium sulfat. Proses ini berlangsung selama sampel yang ditambah dengan katalisator direaksikan dengan H 2 SO 4 pekat dan dididihkan di atas pemanas labu Kjeldahl. Penambahan asam sulfat dilakukan dalam ruang asam untuk menghindari S yang berada di dalam protein terurai menjadi SO 2 yang sangat berbahaya. Setelah penambahan asam sulfat larutan menjadi keruh. Asam sulfat pekat berfungsi untuk mendestruksi protein menjadi unsur-
unsurnya, sedangkan katalisator berfungsi untuk mempercepat proses destruksi dan menaikkan titik didih asam sulfat. Tiap 1 gram K 2 SO 4 menaikkan titik didih 3 0 C. Dari proses ini semua ikatan N dalam bahan pangan akan menjadi ammonium sulfat (NH 4 SO4) kecuali ikatan N=N; NO; dan NO 2. Ammoniak dalam asam sulfat terdapat dalam bentuk ammonium sulfat. Pada tahap ini juga menghasilkan CO 2, H 2 O, dan SO 2 yang terbentuk adalah hasil reduksi dari sebagian asam sulfat dan menguap. Reaksi yang terjadi selama destruksi: HgO + H 2 SO 4 HgSO 4 + H 2 O 2HgSO 4 Hg 2 SO 4 + SO 2 +2O n Hg 2 SO 4 + 2H 2 SO 4 2HgSO 4 + 2H 2 O + SO 2 (CHON) + O n + H 2 SO 4 CO 2 + H 2 O + (NH 4 ) 2 SO 4 + SO 2 (Sudarmadji, 1996) Katalisator Proses pemanasan dilakukan ± 2 jam sampai larutan jernih.larutan yang jernih menunjukkan bahwa semua partikel padat bahan telah terdestruksi menjadi bentuk partikel yang larut tanpa ada partikel padat yang tersisa. Larutan jernih yang telah mengandung senyawa (NH 4 ) 2 SO 4 ini kemudian didinginkan supaya suhu sampel sama dengan suhu luar sehingga penambahan perlakuan lain pada proses berikutnya dapat memperoleh hasil yang diinginkan. b. Proses Destilasi Pada tahap destilasi, ammonium sulfat dipecah menjadi ammonia (NH 3 ). Prinsip destilasi adalah memisahkan cairan atau larutan berdasarkan perbedaan titik didih. Dari hasil destruksi protein, labu destruksi didinginkan kemudian dilakukan pengenceran dengan penambahan aquades. Pengenceran dilakukan untuk mengurangi kehebatan reaksi bila ditambah larutan alkali. Larutan dijadikan basa dengan menambahkan NaOH 60%, lalu corong ditutup dan ditambahkan aquades ± setengah bagian. Sampel harus dimasukkan terlebih dahulu kedalam alat destilasi sebelum NaOH, karena untuk menghindari terjadinya superheating. Fungsi penambahan NaOH adalah untuk memberikan suasana basa karena reaksi tidak dapat berlangsung dalam keadaan asam
Ammonia yang dibebaskan selanjutnya akan ditangkap oleh larutan asam standar. Untuk menampung NH 3 yang keluar, digunakan asam borat dalam erlenmeyer dan telah ditambahkan indikator Toshiro (Metil Merah + Metil Biru), menghasilkan larutan berwarna biru tua. Indikator ini digunakan untuk mengetahui asam dalam keadaan berlebih. Hasil destilasi (uap NH 3 dan air) ditangkap oleh larutan H 3 BO 3 yang terdapat dalam labu erlenmeyer dan membentuk senyawa (NH 4 ) 3 BO 3. Senyawa ini dalam suasana basa akan melepaskan NH 3. Agar kontak antara asam dan ammonia lebih baik maka diusahakan ujung tabung destilasi tercelup sedalam mungkin dalam asam borat. Penyulingan dihentikan jika semua N sudah tertangkap oleh asam borat dalam labu erlenmeyer atau hasil destilasi tidak merubah kertas lakmus merah serta menghasilkan larutan berwarna hijau jernih. Ujung selang dibilas dengan aquades, agar tidak ada ammonia yang tertinggal di selang. Reaksi yang terjadi: (NH 4 )SO 4 + NaOH Na 2 SO 4 + 2 NH 4 OH 2NH 4 OH 2NH 3 + 2H 2 O 4NH 3 + 2H 3 BO 3 2(NH 4 ) 2 BO 3 +H 2 c. Proses Titrasi Titrasi merupakan tahap akhir pada penentuan kadar protein dalam bahan pangan ini. Banyaknya asam borat yang bereaksi dengan ammonia (N) dapat diketahui dengan volume HCl yang dibutuhkan destilat. Titik akhir titrasi dihentikan sampai larutan berubah dari hijau ke biru (kembali ke warna awal). Selisih jumlah titrasi blanko dan sampel merupakan jumlah ekuivalen nitrogen. 4. Prosedur Percobaan
- Menimbang sejumlah sampel 1 gr, memindahkan ke dalam labu Kjeldahl. - Menambahkan 1,9 ± 0,1 gr K 2 SO 4, 40 ± 10 mg HgO dan 12,0± 0,1ml H 2 SO 4. - Menambahkan beberapa butir batu didih. Memanaskan sampai mendidih dan larutan menjadi jernih kehijau-hijauan. Melakukan dalam lemari asam menggunakan alat dekstruksi dengan unit pengisapan asap - Mendinginkan, menambahkan sejumlah air kira-kira 30-50 ml secara perlahan-lahan ( Hati-hati tabung menjadi panas kemudian didinginkan) - Memindahkan isi labu ke dalam alat destilasi. Mencuci dan membilas labu 5-6 kali dengan 1-2 ml air, memindahkan air cucian ini ke dalam alat destilasi - Meletakkan erlenmeyer 125 ml yang berisi 5 ml larutan H 3 BO 3 dan 2 tetes indikator dibawah kondensor. Ujung tabung kondensor harus terendam di dalam larutan H 3 BO 3 - Menambahkan 8-10 ml larutan NaOH- Na 2 S 2 O 3, kemudian melakukan destilasi sampai tertampung destilat ke dalam erlenmeyer - Membilas tabung kondenser dengan air dan tampung bilasannya dalam erlenmeyer yang sama - Mengencerkan isi erlenmeyer sampai kira-kira 50 ml kemudian menitrasi dengan HCL 0,02 N sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu. Melakukan juga penetapan blanko 5. Data Pengamatan Perlakuan Menimbang 1 gr sampel dan memasukkan dalam labu Kjeldahl Menambahkan K 2 SO 4, HgO dan H 2 SO ke dalam labu Kjeldahl Pengamatan Sampel berwarna putih Sampel : Larutan campuran berwarna putih keruh. Blanko : Berwarna bening
Melakukan proses dekstruksi pada sampel dan Blanko pada alat dekstruksi. Mendinginkan dan menambahkan 30 ml air ke dalam labu. Melakukan destilasi. Sebelumnya menambahkan 8 ml larutan NaOH- Na 2 S 2 O 3 dalam larutan sampel dan juga larutan blanko dalam labu dan meletakkan erlenmeyer yang berisi larutan H 3 BO 3 dalam penampung destilat. Mentitrasi larutan sampel dan blanko dengan menggunakan HCL 0,04 N. Sampel : Berwarna putih keruh dan panas Blanko : Berwarna bening dan panas Sampel : Berwarna hijau kehitaman dan mengeluarkan asap saat ditambah air dan mengeluarkan bau. Blanko : Berwarna bening tetapi tidak mengeluarkan asap. Tujuan ditambah air adalah agar endapan yang terbentuk selama proses dekstruksi dapat larut. Sampel : Cairan destilat yang ditampung berwarna agak coklat. Blanko : Cairan destilat yang ditampung berwarna kecoklatan. Sampel : Dtitrasi sampai berubah warna menjadi keabu-abuan dengan volume titrasi yang didapat 41 ml. Blanko : Dititrasi sampai berubah warna menjadi keabu-abuan dengan volume titrasi yang didapat 21,5 ml.
6. Perhitungan (ml HCL ml Blanko ) x normalitas x 14,008 N = x 100 mg sampel ( 41ml 21,5 ml ) x 0,04 N x14,008 x 100 1000 mg = 1,092624 % % Protein = % N x faktor konversi = 1,092624 % x 5,70 = 6,227 %
7. Analisa Percobaan Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat dianalisa bahwa protein merupakan salah satu unsur makro yang terdapat pada bahan pangan selain lemak dan karbohidrat. Protein merupakan sumber asam amino yang mengandung unsur- unsur C, H, O dan N dalam ikatan kimianya. Molekul protein juga mengandung fosfor, belerang dan ada beberapa jenis protein yang mengandung tembaga. Protein sangat mudah mengalami perubahan fisis maupun aktivitas biologis yang disebabkan oleh kandungan protein berupa polipeptida dengan BM ( berat molekul ) yang beragam. Pada praktikum kali ini dilakukan penentuan kadar protein dalam bahan pangan dengan menggunakan metode Kjeldahl. Analisis protein ini dapat menentukan tingkat kualitas protein apabila dipandang dari sudut gizi serta menelaah protein yang merupakan salah satu bahan kimia secara biokimia, fisiologis, reologis dan enzimatis. Prinsip kerja dari metode Kjeldahl adalah protein dan komponen organic dalam sampel didestruksi dengan menggunakan asam sulfat dan katalis. Hasil destruksi dinetralkan dengan menggunakan larutan alkali dan melalui destilasi. Destilat ditampung dalam larutan asam borat. Selanjutnya ion- ion borat yang terbentuk dititrasi dengan menggunakan larutan HCl. Pada praktikum ini sampel yang digunakan adalah tepung terigu cakra sebanyak 1 gr yang ditambahkan dengan K 2 SO 4, HgO dan H 2 SO 4. Penambahan K 2 SO 4 berfungsi sebagai katalisator yang dapat meningkatkan titik didih. Peningkatan titik didih akan mengefektifkan reaksi antara asam sulfat dengan sampel ( destruksi berjalan efektif ). Hal tersebut disebabkan oleh lamanya waktu yang dibutuhkan oleh asam sulfat untuk menguap ( semakin tinggi titik didih, maka waktu yang dibutuhkan asam sulfat untuk menguap akan semakin lama ). Sampel yang sudah didestruksi, akan didinginkan yang kemudian akan dilanjutkan dengan proses destilasi. Sebelumnya, sampel ditambahkan dengan akuades agar endapan dapat larut. Destilasi merupakan suatu proses memisahkan cairan maupun larutan yang berdasarkan pada perbedaan titik didih. Selanjutnya dilakukan titrasi dengan menggunakan HCL 0,04 N untuk menghitung % protein yang didapat. Fungsi utama protein dalam tubuh adalah sebagai zat pembentuk jaringan baru dan mempertahankan jaringan yang sudah ada agar tidak mudah rusak.
8. Kesimpulan Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa: Protein merupakan sumber asam amino yang mengandung unsur- unsur C, H, O dan N dalam ikatan kimianya. Penentuan kadar protein dalam bahan pangan dengan metode Kjeldahl berprinsip pada protein dan komponen organic dalam sampel didestruksi dengan menggunakan asam sulfat dan katalis. Hasil destruksi dinetralkan dengan menggunakan larutan alkali dan melalui destilasi. Destilat ditampung dalam larutan asam borat. Selanjutnya ion- ion borat yang terbentuk dititrasi dengan menggunakan larutan HCl. Dari hasil perhitungan didapat: % N = 1,092624 % % Protein = 6,227 %