BAB III METODE PENELITIAN 3.1. Rancangan penelitian Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian eksperimental, dengan rancangan acak lengkap dan menggunakan pendekatan posttest only control design untuk mengetahui rerata jumlah adiposit sumsum tulang vertebra lumbal 4, tikus putih (Rattus norvegicus) galur Wistar kontrol dan perlakuan yang diberi diet tinggi lemak (O 1, O 2 ). Selanjutnya, perlakuan yang diberikan kepada kelompok O 2 adalah intermittent fasting (sehari puasa selama 12 jam dari pukul 18:00-06.00 WIB, dan sehari makan normal ad-libitum). 3.2. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan di laboratorium hewan coba Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (MIPA), Laboratorium Fisiologi dan Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta. Mulai dari Mei 2015 hingga Maret 2016. 3.3. Populasi dan Sampel Penelitian 3.3.1. Populasi penelitian Populasi penelitian adalah tikus putih jantan dewasa (Rattus norvegicus) galur Wistar yang dikembangkan di laboratorium hewan coba Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (MIPA) Universitas Islam Indonesia. 3.3.2. Sampel penelitian Pada penelitian ini, sampel yang diambil adalah tikus putih jantan (Rattus norvegicus) galur Wistar yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi. 23
24 3.3.2.1. Kriteria inklusi : - Tikus putih (Rattus norvegicus) galur Wistar, keturunan murni. - Umur 90 hari. - Berat badan 120-220 gram. - Jenis kelamin jantan. - Belum pernah digunakan untuk penelitian. - Sehat dan tidak cacat (Tidak tampak abnormalitas anatomis yang tampak). 3.3.2.2. Kriteria Eksklusi: - Sakit (gerakan tidak aktif) selama masa adaptasi 7 hari. - Tikus menunjukkan perilaku yang tidak normal (nampak lemah, tidak lincah atau terlihat sakit, nampak agresif) selama penelitian berlangsung. - Mati selama perlakuan berlangsung. 3.3.3. Besar Sampel Besar sampel penelitian didasarkan dari rumus (Charan, 2013): E = total jumlah tikus total jumlah kelompok 10-20 = total jumlah tikus 3 Total jumlah tikus = 13-23 13-23 dibagi 3 = 4-7 ekor tikus per kelompok Sehingga berdasarkan perhitungan tersebut maka sampel minimal yang diperlukan adalah antara 4 sampai 7 ekor tikus perkelompok. Dalam penelitian ini menggunakan 5 ekor tikus.
25 3.3.4. Pembagian Kelompok Subjek pada penelitian ini dibagi menjadi 3 kelompok secara random: a. Kelompok P 1 (kontrol) terdiri dari 5 ekor tikus putih (Rattus norvegicus) galur Wistar normal yang tidak dilakukan retriksi diet atau intermittent fasting (diberi makan normal ad libitum). b. Kelompok O 1 (perlakuan 1) terdiri dari 5 ekor tikus putih (Rattus norvegicus) galur Wistar dengan diet tinggi lemak yang tidak dilakukan retriksi diet atau intermittent fasting. c. Kelompok O 2 (perlakuan 2) terdiri dari 5 ekor tikus putih (Rattus norvegicus) galur Wistar dengan diet tinggi lemak yang direstriksi diet dengan cara intermittent fasting. 3.4. Variabel Penelitian 3.4.1. Variabel Terikat/ dependent Jumlah adiposit sumsum tulang tikus putih (Rattus norvegicus) galur Wistar. 3.4.2. Variabel Bebas/ independen Intermittent fasting (sehari puasa selama 12 jam dari pukul 18:00-06.00 WIB, dan sehari makan normal ad-libitum) selama 72 hari. 3.4.3. Variabel pengganggu a) Variabel pengganggu yang dapat dikendalikan meliputi: 1. Jenis makanan yang diberikan adalah pellet BR2 konvit, dan kuning telur. Kuantitas dan kualitas makanan dikendalikan diberikan sama sesuai perlakuan. 2. Minuman ditambah setiap akan habis. 3. Jenis kelamin, umur dan berat badan dikendalikan dengan cara memilih hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus) galur Wistar jantan, umur 90 hari, dan berat badan 120-220 gram.
26 4. Variabel lingkungan Dikendalikan dengan bentuk, ukuran kandang yang sama dan mendapat pencahayaan secara alamiah siang dan malam. b) Variabel pengganggu yang tidak dapat dikendalikan, meliputi: 1. Pengaruh psikologis Tikus dapat mengalami stress akibat perlakuan, dan keadaan tersebut dapat mempengaruhi hasil penelitian. Dalam penelitian ini, adanya pengaruh psikologis tidak dapat dikendalikan sepenuhnya, namun dilakukan upaya untuk mengurangi kemungkinan terjadinya stress dengan dilakukan adaptasi sebelum percobaan dan pemisahan subjek penelitian dalam kandang yang terpisah. 3.5. Definisi Operasional a. Jumlah adiposit sumsum tulang adalah jumlah seluruh sel adiposit pada seluruh lapang pandang pada 1 irisan tulang vertebra L4 pada tikus putih (Rattus norvegicus) galur Wistar. Adiposit yang diamati mempunyai ciri-ciri: memiliki vakuola oval yang tampak kosong atau berwarna putih dan berbatas tegas, terletak diantara sel-sel pada sumsum tulang berukuran >30 µm. b. Diet tinggi lemak adalah pemberian makanan tinggi lemak berupa campuran pellet BR-2 konvit 40 gram dan kuning telur 8,45 gram selama 30 hari. c. Intermittent fasting (IF) adalah pembatasan makan selama 12 jam (dari jam 18.00-06.00) pada hari pertama, dan pada hari kedua diberi makan secara ad libitum. Dan selanjutnya diulang secara selang seling selama 72 hari. Minum diberikan secara ad libitum. 3.6. Alat dan Bahan 3.6.1. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: 1) Kandang tikus berukuran 30x20x15 cm, berserta tempat makan dan tempat minum; 2)
27 Cetakan blok; 3) Timbangan gram (untuk mengukur BB tikus); 4) Timbangan elektrik (untuk menimbang makanan); 5) Toples eter; 6) Set bedah minor; 7) Tabung organ; 8) Kaca objek dan kaca penutup; 9) Masker; 10) Sarung tangan; 11) Kapas; 12) Label; 13) Mikroskop Cahaya Olympus CX41 yang dilengkapi kamera Optilab; 14) Komputer yang dilengkapi program penampil citra optilab, imageraster, dan SPSS. 3.6.2. Bahan Penelitian Bahan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: 1) Tikus wistar jantan (Rattus norvegicus) berusia 90 hari, berat badan 120-220 gram; 2) Akuades; 3) Pakan ayam pedaging pellet BR-2 konvit; 4) Mentega putih; 5) putih telur; 6) Nasi; 7) PBS formalin 10%; 6) Zat pewarna haematoxylin-eosin (HE); 7) Metil alkohol 70%; 8) Eter; 9) Silol; 10) Etanol 100%; 11) Parafin. 3.7. Alur Penelitian 3.7.1. Pelaksanaan penelitian Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 15 ekor tikus putih (Rattus norvegicus) galur Wistar jantan dengan berat badan awal 120-220 gram. Hewan coba dipelihara di kandang berukuran 30x20x15 cm. Suhu dalam kandang diatur pada suhu kamar. Pencahayaan dalam kandang diatur dengan siklus terang gelap selama 12 jam. Siklus terang dimulai pukul 07.00 WIB dan sikluas gelap dimulai pukul 19.00 WIB. Setiap harinya diberi makan berupa pellet BR2 konvit dan air minum secara ad libitum. Sebelum dilakukan penelitian, tikus percobaan ditempatkan dalam kandang diadaptasikan terhadap pakan dan lingkungan selama satu minggu, setelah itu tikus ditimbang untuk memastikan terdapat adaptasi yang baik antara tikus dan lingkungan. Pada minggu kedua, tikus dibagi dalam dua kelompok secara random. Kelompok pertama adalah kelompok kontrol (P 1 ) yang diberi makan pelet
28 dan minum secara ad libitum selama 30 hari. Kelompok kedua adalah kelompok perlakuan (O) yang diberikan diet tinggi berupa campuran pellet BR-2 konvit dan kuning telur selama 30 hari. Pada saat penelitian, tikus kelompok perlakuan akan dibagi menjadi 2 kelompok yaitu kelompok perlakuan 1 (O 1 ) dan kelompok perlakuan 2 (O 2 ). Pada kelompok O 1 tikus diberi pakan pellet sebanyak 20 gram setiap pukul 06.00 dan 18.00 dan minum ad libitum. Pada kelompok O 2 tikus dipuasakan selama 12 jam dan selang seling setiap harinya atau dipuasakan pada hari pertama, tidak dipuasakan pada hari kedua, dipuasakan pada hari ketiga dan seterusnya. Saat dipuasakan, tikus diberi makan normal pada pagi hari pukul 06.00 dan pakan akan diambil pukul 18.00. Perlakuan ini dilakukan selama 72 hari. Setelah hari ke-72 penelitian, maka semua tikus percobaan dari ketiga kelompok dibawa ke laboratorium Fisiologi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia untuk dilakukan euthanasia. Setiap tikus percobaan dibius dengan cara dimasukan kedalam tabung yang berisi kapas dan larutan eter. Setelah tikus tertidur dilakukan pembedahan menggunakan scalpel dengan menginsisi linea mediana pada dinding abdomen, dilanjutkan insisi sepanjang linea aksilaris sampai dinding thoraks terbuka. Lalu dikeluarkan semua organ dalam, dan dilakukan pengambilan tulang vertebra dari torakal 12 sampai lumbal 4 dan tulang tersebut didehidrasi dengan cara dimasukan kedalam larutan PBS formalin 10% yang dilakukan pada suhu kamar. Potongan tulang dilakukan dehidrasi kembali dengan alkohol dosis bertingkat berturut-turut 70, 80, 90, 95 dan 100%. Masingmasing selama 15 menit, setiap larutan dimasukkan ke waterbath shaker. Setelah didehidrasi dilakukan proses penjernihan (clearing) dan penyerap larutan sebelumnya (alkohol) dengan dimasukan ke dalam larutan xylol sebanyak tiga kali. Terakhir jaringan diletakkan di dalam cetakan blok kemudian disiram parafin cair untuk memudahkan dalam pemotongan organ dan didinginkan pada suhu kamar sampai parafin membeku menjadi blok. Blok parafin jaringan tulang disayat setebal 6 µm sebayak tiga sayatan
29 menggunakan rotary microtome. Selanjutnya sayatan diwarnai menggunakan HE. Setelah terbentuk sediaan preparat HE untuk masing-masing tikus percobaan, dilakukan interpretasi dengan menggunakan mikroskop camera CX41 di laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia. Sel adiposit sumsum tulang vertebra pada masing-masing preparat tersebut dihitung di bawah mikroskop camera CX41 dengan pembesaran 10x dan hasil dari data yang diperoleh dihitung dengan menggunakan program SPSS (Andriyanto, 2009). 3.7.2. Alur Penelitian Secara singkat alur penelitian dapat digambarkan sebagai berikut: Subjek: tikus putih (Rattus novergicus) galur Wistar (15 ekor) Dinilai usia dan diukur BB Diadaptasikan (selama 1 minggu) Randomisasi Kelompok perlakuan diet tinggi lemak O: 10 ekor Diberi diet tinggi lemak (30 hari) Kelompok kontrol P1: 5 ekor Kelompok Perlakuan 1 O1: 5 ekor Kelompok O2: 5 ekor Diberi makan normal ad libitum (102 hari) makan normal ad libitum (72 hari) Intermittent fasting ( 72 hari) Euthanasia dan isolasi sumsum tulang vertebra T12 - L-4 Pembuatan sediaan preparat dengan HE Diperiksa dengan mikroskop dan dihitung jumlah sel adiposit
30 3.8. Analisis Data a. Untuk melihat perbedaan gambaran histologis sumsum tulang vertebra L4 pada tikus putih (Rattus norvegicus) galur Wistar antara kelompok, dengan cara menghitung sel adiposit dengan pembesaran 400x pada seluruh lapang pandang pada 1 irisan tulang vertebra L4 tikus putih (Rattus norvegicus) galur Wistar. b. Untuk meningkatkan validitas data yang didapatkan, peneliti melakukan blind pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan yang akan dihitung jumlah sel adiposit dalam setiap vertebra, sehingga peneliti tidak dapat mengetahui antara kelompok perlakuan dan kelompok kontrol. Serta peneliti menggunakan metode interpersonal dimana penghitungan sel adiposit dilakukan oleh dua orang peneliti yang dilakukan dalam waktu berbeda. c. Data yang didapatkan dianalisis dengan uji statistik menggunakan program komputer SPSS. Analisis data hasil penelitian yang dilakukan menggunakan analisis untuk melihat hubungan sebab-akibat antara variabel bebas dengan variabel tergantung. Dalam hal ini, yang dilihat adalah pengaruh intermittent fasting terhadap jumlah sel adiposit sumsum tulang vertebra L4 pada tikus putih (Rattus norvegicus) galur Wistar dengan diet tinggi lemak tanpa intermittent fasting (O1), tikus dengan diet tinggi lemak dan intermittent fasting (O2), serta kelompok tikus normal tanpa intermittent fasting (P1) diuji dengan uji One way ANOVA dengan kriteria pengujian berdasarkan probabilitas yaitu H 0 diterima apabila p value > 0,05 dan H o ditolak apabila p value < 0,05. Sebelum dilakukan uji One way anova, dilakukan uji normalitas dengan menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov dan uji homogenitas dengan uji Levene (Dahlan, 2011). 3.9. Etika Penelitian
31 Penelitian ini telah mendapatkan persetujuan dari Komite Etik Penelitian Kedokteran dan Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia nomor 02/Ketua/70/KEFKUII/III/2015.