17 3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan dari Januari sampai April 2010. Keong pepaya dibeli dari nelayan di sekitar Perairan Cirebon. Analisis proksimat keong ini dilakukan di Laboratorium Konservasi Satwa Langka dan Harapan, Pusat Antar Universitas (PAU), Institut Pertanian Bogor. Analisis aktivitas antioksidan dan uji fitokimia dilakukan di Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Laboratorium Pengetahuan Bahan Baku Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan antara lain pisau, timbangan digital, timbangan analitik. Alat-alat yang digunakan dalam uji proksimat yaitu gegep, kompor listrik, cawan porselen, oven, desikator, tanur pengabuan, labu kjehdal, kondensor, buret, dan alat soxhlet. Alat-alat yang digunakan untuk uji aktivitas antioksidan yaitu sudip, aluminium foil, gelas ukur, gelas piala, corong terpisah, vortex, elenmeyer, kapas, shaker, kertas saring whatman 42, evaporator, vakum evaporator, botol ekstrak, freezer, tabung reaksi, pipet tetes, pipet volumetrik, pipet mikro, inkubator, spektrofotometer UV-VIS Hitachi U-2800. Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari bahan utama dan bahan pembantu. Bahan utama dalam penelitian ini yaitu daging dan jeroan keong pepaya (Melo sp.) segar yang telah dikeringkan dengan panas matahari. Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk analisis proksimat meliputi akuades, kristal K 2 SO 4, kjeltab jenis HgO, larutan H 2 SO 4 pekat, larutan H 2 O 2, asam borat (H 3 BO 3 ) 4% yang mengandung indikator bromcherosol green 0,1% dan methyl red 0,1% (2:1), larutan NaOH-Na 2 S 2 O 3, larutan HCl 0,2 N, pelarut lemak (n-heksana), larutan HCl 10%, larutan AgNO 3 0,1 N, dan akuades. Bahan-bahan yang digunakan pada tahap ekstraksi yaitu kloroform, etil asetat, dan metanol. Bahanbahan yang dibutuhkan untuk uji aktivitas antioksidan, yaitu ekstrak daging dan jeroan keong pepaya, kristal Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH), metanol, antioksidan sintetik BHT (Butylated Hydroxytoluena) sebagai pembanding dan es. Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk uji fitokimia meliputi pereaksi Wagner,
18 pereaksi Meyer, pereaksi Dragendroff (uji alkaloid), kloroform, anhidra asetat, asam sulfat pekat (uji steroid), serbuk magnesium, amil alkohol (uji flavonoid), air panas, larutan HCl 2 N (uji saponin), etanol 70%, larutan FeCl 3 5% (uji fenol hidrokuinon), peraksi Molisch, asam sulfat pekat (uji Molisch), pereaksi Benedict (uji Benedict), pereaksi Biuret (uji Biuret), dan larutan Ninhidrin 0,1% (uji Ninhidrin). 3.3 Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan melalui 4 tahap, yaitu: (1) pengambilan bahan baku dan preparasi bahan baku; (2) karakterisasi bahan baku; (3) ekstraksi komponen antioksidan; dan (4) uji komponen fitokimia 3.3.1 Pengambilan bahan baku dan preparasi bahan baku Bahan baku keong pepaya (Melo sp.) diambil dari perairan pantai Cirebon. Keong pepaya (Melo sp.) dibeli dari berbagai nelayan di tempat pelelangan ikan perairan Cirebon. Keong pepaya diambil dengan cara mengumpulkan keong selama beberapa hari. Keong pepaya tidak terlalu banyak diperjual belikan karena merupakan hasil tangkapan samping di wilayah perairan Cirebon, tetapi keong pepaya merupakan salah satu komoditi favorit di lingkungan masyarakat. Pengambilan keong pepaya dilakukan setiap 2 hari sekali setelah nelayan menurunkan hasil tangkapannya dari kapal. Ukuran panjang keong pepaya yang digunakan dalam penelitian ini berkisar antara 10-16 cm. Cangkang keong pepaya dipecahkan terlebih dahulu. Daging dan jeroan keong pepaya dipisahkan. Daging dan jeroan tersebut dipotong kecil-kecil kemudian dijemur di bawah sinar matahari selama 1 minggu. Proses pengeringan berlangsung lama karena pada saat pengeringan merupakan musim penghujan sehingga sulit dalam tahapan pengeringan. Jeroan keong pepaya yang sudah kering dihancurkan dengan mengunakan blender sehingga diperoleh serbuk. Daging tidak mengalami proses penghancuran dengan menggunakan blender karena agak keras, sehingga untuk mengatasinya, daging keong pepaya dipotong tipis-tipis saja. Serbuk jeroan keong pepaya dan irisan tipis daging keong pepaya akan digunakan dalam proses ekstraksi dengan pelarut non polar, semi polar dan polar, serta analisis proksimat.
19 3.3.2. Karakterisasi bahan baku Karakterisasi keong pepaya dilakukan melalui perhitungan rendemen dan uji proksimat. a. Rendemen Perhitungan rendemen dilakukan untuk mengetahui persentase rendemen daging dan jeroan keong pepaya baik dalam keadaan kering maupun segar. Perhitungan rendemen secara matematik adalah sebagai berikut: b. Uji Proksimat Analisis proksimat yang dilakukan terhadap keong pepaya pada keong kering baik pada daging maupun jeroan. Daging dan jeroan keong pepaya tersebut dikeringkan dengan menggunakan sinar matahari, kemudian dihaluskan dengan dipotong-potong tipis untuk daging dan dihancurkan dengan blender untuk jeroan. Analisis proksimat yang dilakukan adalah: 1) Kadar air (AOAC 2005) Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah cawan porselen dikeringkan dalam oven pada suhu 102-105 o C selama 30 menit. Cawan tersebut diletakkan dalam desikator (kurang lebih 40 menit) hingga dingin kemudian ditimbang hingga beratnya konstan, kemudian daging dan jeroan keong pepaya ditimbang sebanyak 1-2 gram yang dimasukkan ke dalam cawan. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 150 o C selama 8 jam. Cawan tersebut diletakkan dalam desikator dan kemudian ditimbang. Kadar air ditentukan dengan rumus: 2) Kadar abu (AOAC 2005) Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar abu yaitu sebanyak 1 gram sampel daging dan jeroan keong pepaya (Melo sp.) ditempatkan dalam cawan abu. Cawan tersebut dibakar sampai berasap dan berhenti ketika sampel sudah tidak mengeluarkan asap. Setelah itu cawan abu porselen diletakkan
20 dalam tanur pada suhu 600 o C selama 2 jam. Cawan abu didinginkan selama 30 menit kemudian ditimbang beratnya. Kadar abu ditentukan dengan rumus: 3) Analisis kadar abu tidak larut asam menurut SNI 01-3836-2000 (BSN 2000) Abu hasil penetapan kadar abu total dilarutkan dalam 25 ml HCl 10% dan dididihkan selama 5 menit. Larutan tersebut kemudian disaring dengan kertas saring Whatman bebas abu dan dicuci dengan air suling sampai bebas klorida (dengan peraksi AgNO 3 ). Kertas saring Whatman kemudian dikeringkan dalam oven. Abu yang telah kering kemudian diabukan kembali dalam tanur dengan menggunakan wadah cawan porselen. Cawan porselen tersebut kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang hingga beratnya tetap (BSN 2000). Kadar abu tidak larut asam ditentukan dengan rumus: 4) Kadar protein (AOAC 2005) Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga: yaitu destruksi, destilasi dan titrasi. (1) Tahap destruksi Daging dan jeroan keong pepaya ditimbang sebanyak 0,25 gram, kemudian dimasukkan ke dalam tabung kjelhdal. Selanjutnya ditambahkan 0,25 gram selenium dan 3 ml H 2 SO 4 pekat ke dalam tabung tersebut. Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas. Proses destruksi dilakukan sampai larutan berwarna bening. (2) Tahap destilasi Isi labu dituangkan ke dalam labu destilasi, lalu ditambahkan akuades 50 ml. Air bilasan juga dimasukkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan larutan NaOH 40% sebanyak 20 ml. Cairan dalam ujung tabung kondensor ditampung dalam erlenmeyer 10 ml berisi larutan H 3 BO 3 dan 2 tetes indikator (cairan methyl red dan brom creosol green)
21 yang ada di bawah kondensor. Destilasi dilakukan sampai diperoleh 10 ml destilat dan berwarna hijau kebiruan. (3) Tahap titrasi Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan erlenmeyer berubah menjadi merah muda. Kadar protein ditentukan dengan rumus: 5) Kadar lemak (AOAC 2005) Penentuan kadar lemak dilakukan dengan menggunakan metode ekstraksi soxhlet. Daging dan jeroan keong pepaya sebanyak 2 gram dimasukkan ke dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya dan disambungkan dengan tabung soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak berupa heksan sebanyak 150 ml. Tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi soxhlet, lalu dipanaskan selama 6 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 100 o C selama 1 jam, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan. Kadar lemak ditentukan dengan rumus:
22 3.3.3 Ekstraksi komponen antioksidan Ekstraksi komponen antioksidan dilakukan dengan menghasilkan ekstrak kasar terlebih dahulu. Komponen antioksidan diperoleh melalui ekstraksi bertingkat dengan menggunakan tiga jenis pelarut. Pelarut yang digunakan yaitu pelarut non polar (kloroform), semi polar (etil asetat), dan polar (metanol). Sampel kering (daging dan jeroan) yang telah dihancurkan masing-masing sebanyak 25 gram, dimaserasi dengan menggunakan pelarut kloroform terlebih dahulu sebanyak 100 ml selama 3x24 jam. Hasil maserasi yang berupa larutan disaring dengan menggunakan kertas saring whatman 42 sehingga dihasilkan residu dan filtratnya. Residu yang dihasilkan akan dimaserasi selama 3x24 jam dengan menggunakan pelarut etil asetat sebanyak 100 ml, kemudian disaring kembali dengan menggunakan kertas saring whatman 42 yang dihasilkan residu dan filtratnya. Residu dari ekstrak etil asetat ini akan dimaserasi dengan pelarut metanol sebanyak 100 ml selama 3x24 jam. Hasil larutan maserasi tersebut akan disaring kembali dengan menggunakan kertas saring whatman 42 sehingga dihasilkan residu dan filtratnya. Filtrat dari ekstraksi kloroform, etil asetat dan metanol akan dievaporasi sehingga pelarut terpisah dengan ekstraknya. Proses evaporasi menggunakan vakum evaporator pada suhu 40 C sehingga dihasilkan ekstrak kasarnya. Ekstrak kasar ini kemudian akan dimasukkan ke dalam botol ekstrak yang akan digunakan untuk dilakukan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (Bois 1958 diacu dalam Hanani et al. 2005) dan uji fitokimia secara kualitatif (Harborne 1987). Proses ekstraksi dapat dilihat pada Gambar 4.
23 Sampel kering Daging 25 gram Masing-masing 2 kali ulangan Jeroan 25 gram Maserasi dengan kloroform selama 3x24 jam Penyaringan Filtrat Evaporasi Residu Maserasi dengan etil asetat selama 3x24 jam Ekstrak kloroform Penyaringan Filtrat Evaporasi Residu Maserasi dengan metanol selama 3x24 jam Penyaringan Filtrat Ekstrak etil asetat Evaporasi Residu Ekstrak metanol Gambar 4 Tahapan proses ekstraksi daing dan jeroan keong pepaya Sumber: Quinn (1988) diacu dalam Darusman et al. (1995) yang dimodifikasi
24 a. Uji aktivitas antioksidan (DPPH) (Blois 1958 diacu dalam Hanani et al. 2005) Ekstrak kasar keong pepaya yang diperoleh dari ektraksi bertingkat dengan kloroform, etil asetat, metanol akan dilarutkan dengan pelarut metanol p.a dengan konsentrasi 200, 400, 600, 800 ppm. Antioksidan sintetik BHT digunakan sebagai pembanding dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8 ppm. Larutan DPPH yang akan digunakan, dibuat dengan melarutkan kristal DPPH dalam pelarut metanol dengan konsentrasi 1 mm. Proses pembuatan larutan DPPH 1 mm dilakukan dalam kondisi suhu rendah dan terlindung dari cahaya matahari. Sebanyak 4,5 ml larutan uji atau pembanding direaksikan dengan 0,5 ml larutan DPPH 1 mm dalam tabung reaksi. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit, kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri UV-VIS Hitachi U-2800 pada panjang gelombang 517 nm, aktivitas antioksidan dari masing-masing sampel dan antioksidan pembanding BHT dinyatakan dengan persen inhibisi, yang dihitung dengan rumus sebagai berikut: Nilai konsentrasi sampel (ekstrak ataupun antioksidan pembanding BHT) dan persen inhibisinya diplotkan masing-masing pada sumbu x dan y pada persamaan regresi linear. Persamaan regresi linear yang diperoleh dalam bentuk persamaan y = a + bx, digunakan untuk mencari nilai IC 50 (inhibitor concentration 50%) dari masing-masing sampel dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x yang akan diperoleh sebagai IC 50. Nilai IC 50 menyatakan besarnya konsentrasi larutan sampel (ekstrak ataupun antioksidan pembanding BHT) yang dibutuhkan untuk mereduksi radikal bebas DPPH sebesar 50%. b. Uji fitokimia (Harborne 1987) Uji fitokimia dilakukan untuk menentukan komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak kasar keong keong pepaya masing-masing pelarut. Uji fitokimia yang dilakukan terdiri dari uji alkaloid, steroid/triterpenoid, flavonoid, saponin, fenol hidrokuinon, molisch, benedict, biuret, dan ninhidrin. Metode uji ini berdasarkan Harborne (1987).
25 a) Uji Alkaloid Sejumlah sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid yaitu, pereaksi Dragendorff, pereaksi Meyer, dan pereaksi Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan, terbentuk endapan coklat dengan pereaksi Wagner dan terbentuk endapan merah hingga jingga dengan pereaksi Dragendorff. b) Uji Steroid/triterpenoid Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi. Anhrida asetat ditambahkan sebanyak 10 tetes kemudian ditambahkan asam sulfat pekat 3 tetes ke dalam campuran tersebut. Hasil uji positif mengandung steroid dan triterpenoid yaitu dengan terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau. c) Uji Flavonoid Sejumlah sampel ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol (campuran asam klorida 37% dan etanol 95% dengan volume yang sama) dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Hasil uji positif sampel mengandung flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol. d) Uji Saponin Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan adanya saponin. e) Uji Fenol hidrokuinon (pereaksi FeCl 3 ) Sejumlah sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70%. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl 3 5%. Hasil uji positif sampel mengandung Fenol hidrokuinon ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau atau hijau biru. f) Uji Molisch Sebanyak 1 ml larutan sampel diberi 2 tetes pereaksi Molish dan 1 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Uji positif yang menunjukkan adanya
26 karbohidrat ditandai terbentuknya kompleks berwarna ungu diantara 2 lapisan cairan. g) Uji Benedict Larutan sampel sebanyak 8 tetes dimasukkan ke dalam 5 ml pereaksi Benedict. Campuran dikocok dan dididihkan selama 5 menit. Hasil uji positif sampel mengandung gula pereduksi ditunjukkan dengan terbentuknya larutan berwarna hijau, kuning atau endapan merah bata. h) Uji Biuret Sebanyak 1 ml larutan sampel ditambahkan 4 ml pereaksi Biuret. Campuran dikocok dengan seksama. Hasil uji positif sampel mengandung senyawa peptida dengan terbentuknya larutan berwarna ungu. i) Uji Ninhidrin Sebanyak 2 ml larutan sampel ditambah beberapa tetes larutan ninhidrin 0,1%. Campuran dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Hasil uji positif sampel mengandung asam amino ditunjukkan warna biru.