Karakterisasi Enzim Fibrinolitik dari Cacing Tanah Perionyx excavatus Characterization of Earthworm Fibrinolytic Enzyme from Perionyx excavatus SKRIPSI ANGGI MARIA GUNITA 105 03 021 PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2007
ABSTRACT Peryonix excavatus is a local earthworm that abundant in tropic area like Indonesia. As shown previously, P. excavatus possess fibrinolytic activities that very useful for trombolytic agent. The aim of this research is further characterizing optimum condition of enzyme activity from this earthworm. Isolation and partially purification using fractionation of 60% saturated amonium sulphate and gel filtration chromatrography was used to obtain the enzyme. Then, enzyme was identified by fibrinolytic assay and SDS-PAGE. In order to determine optimum condition and to analysis of purification degree, the activities of the enzyme were performed by the azocaseinolytic method. The enzyme, with molecular weight between 25 30 kda, showed a fibrinolytic activity by diluting fibrin clots. The optimum of proteolytic activity of the enzyme was at 55 o C and broad range ph between 6 and 12. The purified enzymes showed azocaseinolytic activity by 12% in yield, with purity 2.5 fold higher to that of crude extract. ii
ABSTRAK Peryonix excavatus merupakan cacing tanah galur lokal yang banyak terdapat di Indonesia. Berdasarkan penelitian sebelumnya, P. excavatus memiliki kandungan enzim fibrinolitik yang dapat diaplikasikan sebagai agen trombolitik dalam dunia medis. Penelitian ini bertujuan untuk mengaraktersasi kondisi optimum aktivitas enzim. Tahapan yang dilakukan untuk mendapatkan enzim fibrinolitik adalah isolasi enzim, dan pemurnian parsial dengan fraksinasi amonium sulfat 60% dan kromatografi filtrasi gel. Identifikasi enzim dilakukan dengan pengujian fibrinolitik dan SDS-PAGE. Analisis aktivitas enzim dilakukan dengan metode azokaseinolitik. Identifikasi enzim fibrinolitik pada ekstrak kasar dan hasil filtrasi gel menunjukkan bahwa sampel mampu melarutkan gumpalan darah. Enzim fibrinolitik dari P. excavatus memiliki keadaan aktivitas enzim optimum pada suhu 55 0 C dan rentang ph 6-12. Hasil pemurnian menunjukkan bahwa enzim hasil filtrasi gel memiliki yield sebesar 12% dan pelipatan kemurnian sebesar 2,5 kali dari ekstrak kasarnya. iii
Program Studi Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Bandung Menerangkan bahwa Skripsi yang disusun oleh: Nama : Anggi Maria Gunita NIM : 105 03 021 Telah disetujui sebagai persyaratan untuk mendapatkan gelar Sarjana Kimia Bandung, September 2007 Pembimbing Zeily Nurachman, D.Sc. NIP. 131835236 iv
Allah sanggup melimpahkan segala kasih karunia kepada kamu, supaya kamu senatiasa berkecukupan di dalam segala sesuatu dan malah berkelebihan di dalam pelbagai kebajikan. ( 2 Kor 9: 8) Kupersembahkan karya ini untuk Mama dan Papa v
UCAPAN TERIMA KASIH Puji syukur yang tiada terhingga untuk Tuhan Yesus Kristus atas berkat dan limpahan kasih- Nya sehingga akhirnya penulis dapat menyelesaikan penelitian tugas akhir dan penulisan skripsi ini. Adapun terselesaikannya tulisan ini adalah berkat dan dukungan dari banyak pihak. Oleh karena itu pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan rasa terma kasih yang sedalam-dalamnya kepada : 1. Bapak Zeily Nurachman, D.Sc, atas bimbingan, pengarahan, motivasi dan kesabaran yang diberikan kepada penulis selama menjalani penelitian. Terimakasih pula untuk wejangan dan dorongan semangat yang berguna bagi bekal hidup penulis. 2. Dr. Aminuddin Sulaeman sebagai dosen wali atas bimbingan dan perhatiannya. 3. Seluruh staf dosen di Program Studi Kimia yang telah menyalurkan pengetahuan yang bermanfaat kepada penulis. 4. Seluruh karyawan Program Studi Kimia ITB khususnya Pak Yayat, Pak Edi, Pak Dadan, Bu Esar, Bu Tini, Bu Sony, Pak Wandi, Pak Aep, Pak Ajat dan Pak Toto yang banyak membantu dalam penelitian tugas akhir penulis. 5. Pak Wikanda dan Pak Wawan atas foto SEM nya dan semangatnya kepada penulis untuk melakukan penelitian lebih baik lagi. 6. Papa dan Mama tercinta yang selalu memberikan dukungan, nasehat, juga kasih sayang yang tiada terukur pada penulis sampai akhirnya penulis dapat sampai pada tahap ini. 7. Keluarga besar Soeprapto dan Soeparno, atas bantuan dan dukungannya pada penulis sehingga dapat menyelesaikan kuliah. 8. Kakak dan Adikku yang tercinta, trims ya buat doa dan canda tawa penghilang stres selama ini. vi
9. Juanda Evan Sirait yang telah memberikan dukungan, doa, perhatian, bantuan, dan cinta yang sangat besar pada penulis. 10. Teman-teman sebimbingan: Dian, Ferra, Syifa, Frisda, Teh Indi, Mbak Dini, Edo, dan Iman Nduth atas kebersamaan dalam menjalani penelitian tugas akhir ini. Semuanya jadi lebih mudah kalau bisa berbagi tips dengan kalian. Makasih ya... 11. Teman-teman penelitian Biokimia : Dea, Bambang, Mira, Wichi, Icha, Yesi, Yogi, Iman Ceking, Anna, Keni, Bu Fe, Mas Tunjung, Teh Tina,Teh Ita, dan Bu Prim, atas semangat, kerjasama, kebersamaan, dan canda tawa pelipur lara. 12. Sahabat-sahabat penulis: Felicia, Ocha, Sissy, Margie, Mita, atas kebersamaan, keceriaan, dan hari-hari yang indah di Kimia. 13. Ladybird : Tutu, Ninit, Nisa, Dani atas dukungan semangat, bantuan dan doanya. Thanks to be my bestfriends.. 14. Semua rekan mahasiswa Kimia ITB angkatan 2003 atas moment yang tidak akan pernah dilupakan seumur hidup penulis. 15. Pihak-pihak lain yang telah membantu penulis, yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Akhir kata, penulis menyadari bahwa tulisan ini jauh dari sempurna. Akan tetapi, penulis berharap tulisan ini dapat bermanfaat dan memberi wawasan bagi semua pihak. Bandung, September 2007 Penulis vii
DAFTAR ISI Abstract... ii Abstrak... iii Ucapan Terima Kasih... vi Daftar Isi... viii Daftar Tabel... x Daftar Gambar... xi Daftar Lampiran... xii 1 Pendahuluan... 1 1.1 Latar belakang... 1 1.2 Tujuan Penelitian... 2 2 Tinjauan Pustaka... 3 2.1 Penyakit trombosis... 3 2.1.1 Mekanisme pembekuan darah... 5 2.1.2 Mekanisme pencairan darah beku... 7 2.2 Enzim fibrinolitik dari cacing tanah... 8 2.2.1 Lumbrokinase... 9 2.2.2 Protease serin... 12 2.3 Cacing tanah Perionyx excavatus... 14 2.4 Pemurnian enzim... 15 2.4.1 Fraksinasi amonium sulfat... 15 2.4.2 Filtrasi gel... 16 2.5 Uji aktivitas protease...17 2.6 Elektroforesis SDS-PAGE... 17 3 Metode Penelitian...19 3.1 Bahan... 19 3.1.1 Bahan penelitian... 19 3.1.2 Bahan kimia... 19 3.2 Alat... 20 3.3 Metode... 20 viii
3.3.1 Pembiakan dan induksi cacing P. exavatus... 22 3.3.2 Isolasi enzim fibrinolitik dari cacing tanah P. excavatus... 22 3.4 Pemurnian enzim... 22 3.4.1 Fraksinasi (NH 4 ) 2 SO 4... 22 3.4.2 Kromatografi filtrasi gel... 23 3.5 Uji aktivitas fibrinolitik...23 3.6 Uji aktivitas azokaseinolitik... 23 3.7 SDS-PAGE... 24 3.7.1 Penyiapan bahan...24 3.7.2 Prosedur SDS-PAGE... 25 3.8 Penentuan kadar protein dengan metode Bradford... 26 3.9 Optimasi suhu dan ph... 26 4 Hasil dan Pembahasan... 27 4.1 Isolasi enzim fibrinolitik... 27 4.2 Pemurnian enzim fibrinolitik... 28 4.3 Uji aktivitas fibrinolitik...30 4.4 SDS-PAGE... 31 4.5 Optimasi suhu... 32 4.6 Optimasi ph... 33 4.7 Analisis kuantitatif terhadap pemurnian enzim... 34 5 Kesimpulan... 36 Daftar Pustaka... 37 Lampiran A... 39 Lampiran B... 41 Lampiran C... 44 ix
DAFTAR TABEL Tabel 2.1 Perbandingan beberapa sifat streptokinase dan t-pa... 4 Tabel 2.2 Faktor pembekuan darah, nama umum, dan fungsi... 6 Tabel 3.1. Komposisi gel poliakrilamid... 25 Tabel 4.1 Analisis kuantitatif pemurnian enzim... 35 x
DAFTAR GAMBAR Gambar 2.1 Proses pembekuan darah... 5 Gambar 2.2 Proses pencairan darah beku... 8 Gambar 2.3 Aktivitas fibrinolitik cacing tanah... 9 Gambar 2.4 Kurva kestabilan enzim pada berbagai suhu dan ph... 10 Gambar 2.5 Kurva Aktivitas enzim pada berbagai ph... 11 Gambar 2.6 Mekanisme katalitik enzim protease serin kimotripsin... 13 Gambar 2.7 Cacing tanah P. excavatus... 14 Gambar 3.1 Diagram alir penelitian... 21 Gambar 4.1 Grafik hasil kromatografi filtrasi gel... 30 Gambar 4.2 Hasil uji fibrinolitik... 31 Gambar 4.3 Benang fibrin... 31 Gambar 4.4 Hasil SDS-PAGE... 32 Gambar 4.5 Kurva optimasi suhu... 33 Gambar 4.6 Kurva optimasi ph... 34 xi
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran A Penentuan Kadar Protein......39 Lampiran B Penentuan Aktivitas Enzim...41 Lampiran C Optimasi Suhu dan ph...44 xii