3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari 2012 sampai Juli 2012. Pengambilan sampel dilakukan di Perairan Lampung Selatan, analisis aktivitas antioksidan dilakukan di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku, analisis fitokimia di Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan, dan Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan; Laboratorium Kimia Analitik, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam; dan Laboratorium Biologi- Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan untuk penelitian ini adalah bintang laut Culcita sp. Bahan-bahan yang diperlukan dalam proses ekstraksi dan evaporasi sampel meliputi pelarut heksana (p.a), etil asetat (p.a) dan metanol (p.a). Bahanbahan yang dibutuhkan untuk uji aktivitas antioksidan, yaitu ekstrak kasar bintang laut dari 3 jenis pelarut, kristal diphenylpicrylhydrazyl (DPPH), metanol (p.a), BHT (butil hidroksi toluen) sebagai kontrol positif, α-tokoferol, β-karoten, asam askorbat sebagai antioksidan pembanding. Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk uji fitokimia meliputi pereaksi Wagner (uji alkaloid), pereaksi Meyer (uji alkaloid), pereaksi Dragendorff (uji alkaloid), kloroform, anhidra asetat, asam sulfat pekat (uji steroid), serbuk magnesium, amil alkohol (uji flavonoid), air panas, larutan HCl 2 N (uji saponin), etanol 70%, larutan FeCl3 5% (uji fenol hidrokuinon), dan larutan ninhidrin 0,10% (uji ninhidrin). Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk pengujian kromatografi lapis tipis meliputi pelarut etil asetat dan kloroform. Alat-alat yang diperlukan dalam penelitian ini meliputi pisau, sudip, cawan porselen, timbangan digital, aluminium foil, oven, kompor listrik, kertas saring Whatman 42, bulb, kapas, pipet volumetrik, pipet mikro, labu Erlenmeyer 250 ml dan 500 ml, gelas ukur, blender, orbital shaker WiseShike SHO-1D, rotary vacuum evaporator Heidolph VV2000, corong kaca, botol gelas, gelas piala,
17 tabung reaksi, spektrofotometer UV-VIS Hitachi U-2800, pipet tetes, vortex, sendok plastik, silika GF254 Merck, pipa kapiler, gelas, alat semprot, dan pensil. 3.3 Metode Penelitian Penelitian ini terdiri dari beberapa tahapan, yaitu tahapan pengambilan dan preparasi bahan baku, tahapan pembuatan ekstrak senyawa aktif dari bintang laut, pengujian fitokimia (alkaloid, steroid, flavonoid, saponin, fenol hidrokuinon, dan ninhidrin), pengujian aktivitas antioksidan dengan metode DPPH, dan pengujian kromatografi lapis tipis (KLT). Analisis aktivitas antioksidan (metode DPPH) untuk mengetahui aktivitas antioksidan dari ekstrak masing-masing pelarut dan uji fitokimia untuk menentukan senyawa kimia yang terdapat dalam bintang laut. 3.3.1 Tahapan pengambilan dan preparasi bahan baku Pada tahap pengambilan sampel, bintang laut Culcita sp. berasal dari Perairan Lampung Selatan. Bintang laut kemudian dikeringkan dengan suhu rendah menggunakan freeze dryer dengan suhu kurang dari -40 o C. Tujuan dari proses pengeringan ini adalah untuk mengurangi kadar air dalam bahan yang dikandungnya. Kadar air yang rendah menunjukkan bahwa air bebas dalam bahan berada dalam jumlah yang rendah, sehingga proses pembusukan, hidrolisis komponen aktif dan oksidasi dalam sampel selama dilakukan maserasi dapat dihindari (Winarno 2008). Bintang laut yang telah kering kemudian dihaluskan dengan hammer mills, sehingga didapat tekstur yang halus. Ukuran sampel yang lebih kecil (bubuk atau tepung) diharapkan dapat memperluas permukaan bahan yang dapat berkontak langsung dengan pelarut, sehingga proses ekstraksi komponen aktif dapat berjalan dengan maksimal. Bubuk atau tepung bintang laut akan digunakan dalam proses ekstraksi. 3.3.2 Tahapan pembuatan ekstrak senyawa bioaktif dari bintang laut Metode ekstraksi komponen aktif yang digunakan adalah metode ekstraksi bertingkat dan ekstraksi tunggal. Metode ini menggunakan pelarut heksana (p.a), etil asetat (p.a), dan metanol (p.a). Masing masing sampel sebanyak 50 g dimaserasi selama 3x24 jam dengan pelarut secara bertingkat heksana, etil asetat, metanol dan pelarut secara tunggal metanol dengan perbandingan 1:3 (b/v),
18 kemudian disaring dengan kertas saring Whatman 42. Filtrat ekstrak pelarut masing-masing yang diperoleh kemudian dievaporasi sehingga semua pelarut terpisah dari ekstrak menggunakan rotary vacuum evaporator pada suhu 50ºC, 500 mmhg, kemudian residu yang tersisa dibuang. Proses ini akan menghasilkan ekstrak heksana, etil asetat, dan metanol yang kental. Proses ekstraksi bertingkat ini ditunjukkan pada Gambar 4. Bintang Laut Culcita sp. Penimbangan 1:3 b/v (50 g sampel : 150 ml pelarut) Maserasi selama 3x24 jam dengan heksana Penyaringan Filtrat I Residu Evaporasi Maserasi 3x24 jam dengan etil asetat Ekstrak heksana Penyaringan Filtrat II Residu Evaporasi Maserasi 3x24 jam dengan metanol Ekstrak etil asetat Penyaringan Filtrat III Residu Evaporasi Ekstrak metanol Gambar 4 Diagram alir ekstraksi bertingkat bintang laut Culcita sp.
19 3.3.3 Uji fitokimia (Harbone 1987) Analisis fitokimia dilakukan untuk mengetahui keberadaan komponen aktif secara kualitatif yang terdapat pada ekstrak kasar bintang laut. Analisis fitokimia ditujukan untuk mengetahui keberadaan alkaloid, steroid, saponin, flavonoid, fenol hidrokuinon, dan ninhidrin. 1) Alkaloid Sejumlah sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid, yaitu pereaksi Dragendorff, Meyer, dan Wagner dengan cara menambahkan 1,36 HgCl2 dengan 0,5 g kalium iodida lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 100 ml dalam labu takar. Pereaksi ini tidak berwarna. Pereaksi Wagner dibuat dengan cara 10 ml akuades dipipet kemudian hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan, dengan pereaksi Wagner membentuk endapan coklat dan dengan pereaksi Dragendorff membentuk endapan merah sampai jingga. Pereaksi Meyer dibuat ditambahkan 2,5 g iodin dan 2 g kalium iodida, kemudian dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 200 ml dalam labu takar. Pereaksi ini berwarna coklat. Pereaksi Dragendorff dibuat dengan cara 0,8 g bismut subnitrat ditambahkan dengan 10 ml asam asetat dan 40 ml air. Larutan ini dicampur dengan larutan yang dibuat dari 8 g kalium iodida dalam 20 ml air. Sebelum digunakan, 1 volume campuran ini diencerkan dengan 2,3 volume campuran 20 ml asam asetat glasial dan 100 ml air. Pereaksi ini berwarna jingga. 2) Steroid Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi. Anhidrida asetat sebanyak 10 tetes dan asam sulfat pekat sebanyak 3 tetes ditambahkan ke dalam campuran tersebut. Hasil uji positif sampel mengandung steroid dan triterpenoid yaitu terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau. 3) Flavonoid Sejumlah sampel ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol (campuran asam klorida 37% dan etanol 95% dengan volume sama) dan 4
20 ml alkohol, kemudian campuran dikocok. Hasil uji positif sampel mengandung flavonoid, yaitu terbentuknya warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol. 4) Saponin Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan sampel mengandung saponin. 5) Fenol Hidrokuinon Sampel sebanyak 1 g diekstrak dengan 20 ml etanol 70%. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3 5%. Hasil uji positif sampel mengandung senyawa fenol, yaitu terbentukya larutan berwarna hijau atau hijau biru. 6) Ninhidrin Larutan sampel sebanyak 2 ml ditambahkan beberapa tetes larutan ninhidrin 0,1%. Campuran dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Hasil uji positif sampel mengandung asam amino, yaitu terbentuknya larutan berwarna biru. 3.3.4 Uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH Ekstrak kasar bintang laut dari hasil ekstraksi bertingkat menggunakan pelarut heksana, etil asetat, dan metanol, dilarutkan dalam metanol (p.a) dengan konsentrasi 200, 400, 600 dan 800 ppm. Antioksidan pembanding yang digunakan yaitu antioksidan sintetik BHT dan antioksidan alami berupa α-tokoferol, β-karoten, dan asam askorbat dan kontrol positif, dibuat dengan cara dilarutkan dalam pelarut metanol p.a. dengan konsentrasi 2, 4, 6, dan 8 ppm. Larutan DPPH yang digunakan, dibuat dengan melarutkan kristal DPPH dalam pelarut metanol dengan konsentrasi 1 mm. Proses pembuatan larutan DPPH 1 mm dilakukan dalam kondisi suhu rendah dan terlindung dari cahaya matahari. Larutan ekstrak dan larutan antioksidan pembanding yang telah dibuat dengan masing-masing tiga kali ulangan, diambil 4,5 ml dan direaksikan dengan 500 µl (0,5 ml) larutan DPPH 1 mm dalam tabung reaksi yang berbeda dan telah diberi label. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 30
21 menit dan diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 517 nm. Absorbansi dari larutan blanko juga diukur untuk melakukan perhitungan persen inhibisi. Larutan blanko dibuat dengan mereaksikan 4,5 ml pelarut metanol dengan 500 µl (0,5 ml) larutan DPPH 1 mm dalam tabung reaksi. Larutan blanko ini dibuat hanya satu kali ulangan saja. Proses pengenceran konsentrasi ekstrak ini ditunjukkan pada Gambar 5. Ekstrak 0,04 g Pembuatan larutan induk dengan penambahan metanol 50 ml Pengenceran dengan metanol 200 ppm (5 ml) 400 ppm (10 ml) 600 ppm (15 ml) 800 ppm (20 ml) Larutan sampel 4,5 ml dicampurkan dengan larutan DPPH 0,5 ml Inkubasi 30 menit pada suhu 37 o C Ukur absorbansi dengan Spektrofotometri UV-VIS panjang gelombang 517 nm Gambar 5 Diagram alir uji aktivitas antioksidan bintang laut Culcita sp. Diagram alir pada Gambar 4 berlaku untuk setiap ekstrak kasar bintang laut dengan pelarut heksana, etil asetat, dan metanol. Pengujian kualitatif dari metode DPPH yaitu dengan melihat warna larutan sampel ketika dicampurkan dengan DPPH. Adanya perubahan warna ungu pada DPPH menjadi ungu yang lebih muda atau adanya warna kuning ketika pencampuran dilakukan yang menandakan terdapatnya aktivitas antioksidan pada larutan sampel bintang laut tersebut. Proses pengenceran konsentrasi pembanding ini ditunjukkan pada Gambar 6.
22 BHT, asam asrkorbat, α- tokoferol, β-karoten (@ 0,0004 g) Pembuatan larutan induk dengan penambahan metanol 50 ml Pengenceran dengan metanol 2 ppm (5 ml) 4 ppm (10 ml) 6 ppm (15 ml) 8 ppm (20 ml) Larutan sampel 4,5 ml dicampurkan dengan larutan DPPH 0,5 ml Inkubasi 30 menit pada suhu 37 o C Ukur absorbansi dengan Spektrofotometri UV-VIS panjang gelombang 517 nm Gambar 6 Diagram alir uji aktivitas antioksidan pembanding Pengujian kuantitatif metode DPPH dilakukan dengan cara menghitung nilai persen inhibisi dan dilanjutkan dengan perhitungan nilai IC50. Setelah itu, aktivitas antioksidan dari masing-masing sampel dan antioksidan pembanding BHT, asam askorbat, ά-tokoferol, β-karoten dinyatakan dengan persen inhibisi (IC50). Nilai konsentrasi sampel (ekstrak ataupun antioksidan pembanding) dan persen inhibisinya diplot masing-masing pada sumbu x dan y pada persamaan regresi linear. Persamaan regresi linear yang diperoleh dalam bentuk persamaan y = a + bx, digunakan untuk mencari nilai IC50 (inhibitory concentration 50%) dari masing-masing sampel dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x yang akan diperoleh sebagai IC50. Nilai IC50 menyatakan besarnya konsentrasi larutan sampel (ekstrak ataupun antioksidan pembanding) yang dibutuhkan untuk mereduksi radikal bebas DPPH sebesar 50%.
23 3.3.5 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Bioautografi Kromatografi lapis tipis adalah suatu metode pemisahan suatu senyawa berdasarkan perbedaan distribusi dua fasa yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam berupa plat yang digunakan terbuat dari silika GF254, sedangkan fase gerak berupa larutan eluen yang digunakan. Plat KLT silika GF254 dioven pada suhu 105 o C selama 10 menit untuk menghilangkan air yang terdapat pada plat. Pemilihan pelarut untuk fraksinasi dilakukan dengan mencoba beberapa kombinasi untuk mengembangkan spot ekstrak terpilih pada kromatografi lapis tipis (KLT). Kombinasi yang digunakan adalah eluen campuran dari sampel hasil ekstrak yang terbaik etil asetat yaitu kloroform:etil asetat: asam format (1:9:0,05). Ekstrak terpilih sebanyak 0,02 g dilarutkan dalam 0,5 ml pelarutnya. Larutan ekstrak tersebut kemudian ditotolkan pada plat silika dengan panjang 10 cm lebar 1,5 cm. Kombinasi pelarut yang menghasilkan pengembangan spot terbaik digunakan sebagai eluen untuk memfraksinasi ekstrak terpilih dengan kromatografi lapis tipis. Penotolan dilakukan pada jarak ± 1 cm dari bawah plat KLT menggunakan pipa kapiler. Apabila noda telah kering, plat dengan panjang 10 cm dielusi dengan cara meletakkannya secara vertikal di dalam bejana pengembang atau gelas. Gelas ini berisi campuran eluen yang sesuai untuk senyawa yang akan dipisahkan. Plat KLT yang telah dimasukkan dalam gelas dibiarkan sampai terjadi pemisahan dengan atasnya ditutup. Pemisahan ini terjadi karena adanya perbedaan kepolaran senyawa dengan fase diam plat dan fase gerak yang digunakan. Proses elusi dihentikan bilamana eluen telah mencapai ¾ plat KLT. Noda-noda hasil pemisahan ini dapat diamati menggunakan lampu UV λ 254 nm. Uji bioautografi dilakukan untuk mengetahui nilai Rf senyawa aktif antioksidan menggunakan kromatografi lapis tipis. Prosedur uji bioautografi adalah sebagai berikut: fraksi aktif etil asetat yang telah dicampur dengan pelarutnya sebanyak 0,5 mg ditotolkan pada plat silika, kemudian dikembangkan dengan fase gerak yang sesuai untuk pemisahan senyawa-senyawa yang terdapat dalam fraksi, dalam penelitian ini digunakan fase gerak etil asetat:kloroform:asam format (9:1:0,05). Plat KLT kemudian disemprot dengan larutan DPPH 1 mm, kemudian setelah disemprotkan, plat KLT didiamkan dan dikeringkan sebentar.
24 Komponen aktif yang terdapat pada plat KLT ditunjukkan dengan adanya warna kuning / putih setelah penyemprotan dengan DPPH. 3.4 Analisis Data 3.4.1 Rendemen ekstrak Rendemen ekstrak adalah perbandingan antara bobot ekstrak yang dihasilkan (gram) dengan bobot sampel awal sebelum diekstraksi (gram). Rendemen ekstrak digunakan untuk menentukan berapa persen kandungan bioaktif yang terdapat pada suatu bahan. Persentase rendemen ekstrak dihitung dengan rumus sebagai berikut : Keterangan: Pr : Persen rendemen Be : Bobot ekstrak Bs : Bobot sampel awal 3.4.2 Persen inhibisi dan IC50 Persen inhibisi adalah perbandingan antara selisih dari absorbansi blanko dan absorbansi sampel dengan absorbansi blanko. Persen inhibisi digunakan untuk menentukan persentase hambatan dari suatu bahan yang dilakukan terhadap senyawa radikal bebas. Persen inhibisi dihitung dengan rumus berikut: Keterangan: Pi : Persen inhibisi Ab : Absorbansi blanko As : Absorbansi sampel Nilai persen inhibisi yang telah dihitung dari setiap konsentrasi (200-800 ppm) selanjutnya digunakan untuk perhitungan IC50. Inhibitory Concentration 50% (IC50) adalah nilai konsentrasi suatu bahan untuk menghambat aktivitas DPPH sebesar 50%. Nilai konsentrasi dari larutan yang telah diencerkan dari ekstrak dan persen inhibisi diplotkan masing-masing pada sumbu x dan y. Kemudian nilai IC50 dihitung dengan regresi linear y = a(x) + b, dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x sebagai IC50.