FORMULASI BAKTERI PERAKARAN (PLANT GROWTH PROMOTING RHIZOBACTERIA-PGPR) Pendahuluan Pemanfaatan bakteri perakaran atau PGPR dalam bidang perlindungan telah banyak dilaporkan pada beberapa tanaman dan dilaporkan memiliki efektivitas yang cukup baik. Liu et al. (1995) menyuntikkan pseudomonas pendar fluor pada kotiledon daun untuk mengendalikan bakteri patogen pada ketimun. Namun, cara penyuntikan maupun metode lain yang menggunakan suspensi bakteri agensia pengendali hayati akan sulit dilakukan dalam skala luas untuk mengendalikan penyakit-penyakit daun di lapangan (Capper and Higgins, 1993). Kondisi tersebut memberikan gagasan untuk dilakukannya pengembangan agensia pengendali hayati yang dapat diaplikasi pada skala luas dalam bentuk formulasi (Jones and Burges, 1998; Gerhardson, 2002). Formulasi dalam bentuk penyelimutan benih (seed coating), bentuk tepung dan dalam bentuk cair telah dilakukan untuk pengembangan upaya pengendalian patogen tumbuhan dalam skala luas. Namun kemampuan dan daya tahan agensia pengendali hayati dalam formulasi sangat tergantung pada bentuk, komposisi dan kondisi bioformulasi (Kloepper et al., 1981). Beberapa penelitian telah dilakukan untuk memperbaiki kemampuan antagonistik dan daya tahan agensia pengendali hayati baik dengan penambahan sumber karbon, sumber mineral maupun bahan-bahan tertentu. Addy and Nurcahyanti (2006) dalam Addy (2007) mengatakan bahwa sumber karbon dan mineral mampu meningkatkan produksi senyawa antimikrobia secara in vitro. Peningkatan senyawa antimikrobia sangat berhubungan erat dengan kemampuan penghambatan. Berdasarkan hal tersebut dilakukan pengujian formulasi PGPR untuk membantu ketersediaan produk agensia pengendali hayati pada tanaman cengkeh yang mudah diaplikasikan.
Metodologi Persiapan Media biakan PGPR Media yang dibutuhkan adalah media Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB) dan media King s B. Media dibuat mengikuti aturan standard pembuatan media yang selanjutnya disterilkan pada autoclave pada suhu 121 C, 1 atm selama 20 menit. Media dapat disimpan pada suhu 4 C hingga digunakan. Persiapan Isolat dan perbanyakan PGPR Isolat PGPR dimudakan pada media yang sesuai kemudian dimurnikan pada media cair (NB) dengan cara mengambil satu koloni tunggal bakteri, selanjutnya diinkubasikan pada suhu ruang selama 24 jam dengan penggojokan 150 rpm, dan kemudian dihitung jumlah koloni yang tumbuh (terutama pada pengenceran 10-6, 10-7 dan 10-8. Perbanyakan massal dilakukan dengan cara menyiapkan masing-masing 10 ml (kerapatan 10 8 cfu/ml) kultur murni isolat rhizobacteria yang berumur 24 jam, kemudian dimasukkan ke dalam bioreactor (fermentor sederhana) yang berisi 18 Liter media NB dan diinkubasikan selama 3 hari pada kondisi pompa udara bekerja dan di suhu ruang dengan penerangan lampu. Setelah itu, kultur tersebut dipanen dengan menggunakan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm dan dicuci dengan air steril (sebanyak 2 kali) untuk menghilangkan sisa media yang kemungkinan masih bercampur dengan kultur bakteri. Selanjutnya pellet yang terbentuk di suspensikan dengan air steril untuk menghasilkan kerapatan bakteri 10 12 cfu/ml. Suspensi ini yang kemudian digunakan untuk formulasi. Formulasi cair PGPR Suspensi bakteri pada kerapatan 10 12 cfu/ml yang telah dipersiapkan sebelumnya, dimasukan ke dalam botol penyimpan (kapasitas 1 liter) yang selanjutnya ditambahkan beberapa bahan yang mampu meningkatkan aktivitas antagonism bakteri PGPR (bahan stimulant PGPR) yaitu manitol 1% dan seng (Zn) dengan konsentrasi akhir 0,1 mm (Addy, 2007).
Formulasi Tepung PGPR Formulasi ini dilakukan dengan tambahan bahan (bahan stimulant PGPR) yaitu manitol 1% dan seng (Zn) dengan konsentrasi akhir 0,1 mm. Sebanyak 100 ml suspensi bakteri pada kerapatan 10 12 cfu/ml yang telah ditambahkan larutan stimulant (manitol dan seng) dicampurkan dengan 10 Kg komponen formula tepung yang terdiri dari bubuk talc (montmorilonite), CaCO 3, dan karboksi metil selulosa (CMC) yang sebelumnya telah disterilkan dengan autoklaf selama 30 menit pada suhu 121 o C. Campuran komponen formula kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 80 C sebelum dicampur dengan suspensi PGPR. Campuran formula pembawa dan PGPR kemudian dikeringanginkan (hingga kelembaban mencapai 35%) yang selanjutnya dikemas dalam alumunium foil (masing-masing 500 g) dan disimpan pada suhu ruang hingga siap digunakan. Analisa viabilitas PGPR dalam formulasi Analisa viabilitas PGPR dalam formulasi dilakukan dengan cara menghitung jumlah total populasi bakteri PGPR dalam formulasi tersebut setiap gram formula tepung atau 1 ml formula cair menggunakan metode pengenceran berseri. Secara singkat, 1 g / 1 ml formula diencerkan dengan air steril hingga pengenceran 10-7, kemudian sebanyak 10 L suspensi tersebut diratakan pada media NA untuk kemudian dihitung jumlah koloni. Koloni terhitung kemudian dikonversikan ke dalam satuan cfu/g atau cfu/ml formula. Hasil Formulasi PGPR dibuat dalam dua bentuk, yaitu bentuk cair dan padat. Pada formulasi bentuk cair menggunakan bahan pembawa air, sedangkan pada formulasi bentuk padat berupa tepung menggunakan bahan pembawa talk. Produk formulasi cair memiliki karakteristik keruh dan tidak berbau, sedangkan formulasi padat berbentuk tepung halus, kering, tidak berbau, berwarna putih (gambar 1).
Gambar 1. Formulasi PGPR dalam bentuk cair (a) dan tepung (b). Formulasi PGPR dalam pengujian ini mengandung 8 isolat PGPR yang memiliki peran baik sebagai biostimulator, biofertiliser, dan bioprotektan. Formulasinya dicampur dengan beberapa bahan formulasi yaitu bahan pembawa, sumber karbon, sumber mineral, perekat, termasuk thermoprotektan. Masing-masing formula dimasukkan ke dalam wadah (botol untuk formula cair dan gelas ukur untuk formula tepung) dan diinkubasikan pada suhu ruang untuk perhitungan viabilitas. Secara umum, campuran PGPR dalam formulasi memiliki kandungan yang cukup tinggi yaitu mencapai 10 12 cfu/satuan formula atau sekitar 10.000-100.000 kali satuan aplikasi yang berkisar 10 7-10 8 cfu/ml. Hasil percobaan menunjukkan bahwa populasi total PGPR dalam formula menurun secara gradient selama penyimpanan pada suhu ruang hingga 1.000 kali pada bulan ke-4. Meskipun demikian populasi tersebut masih dalam kondisi yang cukup untuk diaplikasikan sekitar 10-100 kali pengenceran (Tabel 1). Tabel 1. Populasi PGPR dalam formulasi Penyimpanan pada suhu ruang (cfu/ml atau Formula cfu/gram) Awal 2 bulan 4 bulan Cair 1,75 10 12 2,82 10 11 8,30 10 9 Tepung 1,75 10 12 8,12 10 10 4,54 10 9
Pembahasan Formulasi PGPR merupakan salah satu cara untuk menjaga daya tahan bakteri PGPR selama penyimpanan. Salah satu tujuan formulasi adalah stabilisasi mikroorganisme selama dalam penyimpanan. Semakin baik formulasi yang digunakan, maka semakin stabil mikroorganisme tersebut. Dengan kondisi mikroorganisme yang stabil maka formulasi bakteri dapat disimpan dalam waktu yang lama. Parameter stabilisasi mikroorganisme dapat dilihat berdasarkan populasi mikroorganisme selama penyimpanan dalam jangka waktu tertentu. Pada pengujian ini, diketahui bahwa formula cair mampu mempertahankan populasi PGPR lebih baik dibandingkan formulasi padat, meskipun keduanya mampu menjaga viabilitas PGPR dalam formula pada kondisi populasi efektif yaitu berkisar 10 9 cfu/ml hingga waktu 4 bulan. Hasil ini mengindikasikan bahwa jumlah populasi PGPR dalam formula masih cukup tinggi dan dapat diencerkan sebanyak 10 kali menjadi suspensi siap aplikasi yang berkisar 10 8 cfu/ml. Bahkan pada saat diformulasi, kondisi populasi awal yang terkandung dalam masing-masing formula sangat tinggi atau sekitar 10 12 cfu/ml atau sekitar 10.000 kali suspensi aplikasi. Hal ini seperti yang disampaikan oleh Matinez-Viveros et al. (2010) bahwa aplikasi efektif bakteri PGPR pada tanah non steril adalah berkisar 10 8-10 9 cfu/ml, dan lebih rendah jika diaplikasi pada tanah steril yaitu 10 7-10 8 cfu/ml. Kesimpulan Formulasi PGPR dalam bentuk cair dan tepung mampu menjaga viabilitas PGPR hingga 4 bulan masa penyimpan dalam kondisi populasi aplikasi efektif.
Daftar Pustaka Addy, H.S. 2007.Pengaruh Sumber Mineral terhadap Penekanan Erwinia carotovora oleh Pseudomonas Pendar-fluor secara In Vitro. J.HPT Tropika. Vol.7,No.2:117-124 Capper A, and P Higgins. 1993. Application of Pseudomonas fluorescens isolates to wheat as potential biological control agents against take-all. Plant Pathology 42:560-567 Gerhardson B. 2002. Biological substitutes for pesticides. Trends Biotechnol 20:338 343. Jones KA, and HD Burges. 1998. Technology of formulation and application. Pages 7-30 in: Formulation of Microbial Biopesticides: Beneficial Microorganisms, Nematodes and Seed Treatments. H. D. Burges, ed. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, the Netherlands. Kloepper JW. 1993. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria as Biological Control Agents. Auburn University. Alabama. Liu L, JW Kloepper, and S Tuzun. 1995. Induction of systemic resistance in cucumber againstfusarium wilt by plant growth promoting rhizobacteria. Phytopathology 85:695 698. Oleh Fathul Mukaromah, SP. (POPT Muda BBPPTP Surabaya) Nurul Hidayah, SP.,MP. (POPT Muda BBPPTP Surabaya)