Penentuan Kandungan Logam erat Penentuan kandungan logam-logam berat pada sampel green coke dilakukan dengan menggunakan metode uji TCLP (Testing Characteristic Leaching Procedure) yang mengacu pada US EP (1992). Pada uji TCLP ini, sampel green coke digerus sampai ukuran ± 9,5 mm, kemudian dilarutkan dalam larutan pengestrak (asam lemah dengan ph 4,9 ± 0,05 ), dengan perbandingan campuran cairan : padatan 20:1 kemudian diaduk dalam rotari ekstraktor pada kecepatan 30 rpm dan 22±2 C selama 18±2 jam. Setelah diaduk, sampel disaring. Filtrat yang diperoleh, yang disebut dengan ekstrak TCLP, kemudian dianalisis kandungan logam beratnya dengan menggunakan metode S. HSIL DN PEMHSN
Kandungan Logam erat green coke (S) Kandungan logam berat green coke hasil analisis S dapat dilihat pada Tabel 6. Tabel tersebut memperlihatkan kandungan logam berat pada sampel yang konsentrasinya jauh dibawah ambang batas minimal LD 50. Hal ini menunjukkan bahwa green coke selain tidak bersifat toksik secara tidak langsung juga dapat dikatakan tidak berbahaya bagi lingkungan. Tabel 6. Kandungan logam berat green coke (S) No Konsentrasi Logam Unsur Logam Green Coke (ppm) erat 2459 2460 LD 50 Standar* 1 Krom (Cr) 1,5 1,4 80 2 Tembaga (Cu) 2,1 2,1 300 3 Seng (Zn) 3,0 3,0 350 4 Kadmium (Cd) 1,5 2,0 72 5 Timbal (Pb) 15 16 50 6 Nikel (Ni) 4,1 4,1 50 7 Kobalt (Co) 7,2 7,3 80 8 Mangan (Mn) 20 20,5 1484 9 Perak (g) 0 0 50 10 Raksa (Hg) 0 0 18 * Sumber : Lewis 2000 Walaupun tidak berbahaya, pengujian keamanan green coke terhadap manusia dan hewan masih tetap dilakukan mengingat kebanyakan logam berat baru akan memiliki efek toksik bila telah mengalami akumulasi dalam tubuh dalam waktu tertentu. Untuk melihat pengaruh akumulasi logam berat terhadap tubuh, maka dibawah ini dipaparkan data yang menghubungkan pengaruh pemberian green coke terhadap respon bobot badan mencit. Data laju pertumbuhan bobot badan mencit diperoleh dengan dua cara, pertama dari mencit hasil uji toksisitas akut, tujuannya untuk melihat pengaruh green coke dosis tertentu terhadap laju pertumbuhan, dalam hal ini apakah sejumlah sampel green coke yang diberikan langsung menghambat laju pertumbuhan atau tidak dan seberapa besar/lama daya penghambatannya itu, data kedua diperoleh dari mencit yang diberi pakan formulasi green coke untuk melihat pengaruh akumulasi yang ditimbulkan terhadap laju pertumbuhan bobot badan mencit. Uji Toksisitas kut (Penentuan LD 50 )
Penentuan toksisitas akut dilakukan melalui dua tahap percobaan. Pertama adalah uji pendahuluan, dilakukan untuk melihat sejauh mana tingkatan bahaya yang ditimbulkan oleh limbah green coke (penentuan kategori), dalam hal ini akan diketahui apakah green coke termasuk limbah 3 atau bukan. cuan yang digunakan dalam penentuan uji ini adalah Peraturan Pemerintah Nomor 85 Tahun 1999 tentang Pengelolaan Limbah 3. pabila dalam hasil pengujian toksisitas akut, nilai LD 50 sampel 50 mg/kg, maka sampel dikategorikan limbah 3 dengan maksimum dosis green coke yang dicekokkan adalah 2000 mg/kg. Kedua adalah uji lanjutan, dilakukan untuk menentukan secara pasti nilai numerik aktual LD 50 green coke berdasarkan acuan OECD dan maksimum dosis yang digunakan adalah 5000 mg/kg, sehingga total seri dosis yang digunakan dalam uji toksisitas akut ini adalah 0 mg/kg, 5 mg/kg, 50 mg/kg, 300 mg/kg, 2000 mg/kg, dan 5000 mg/kg. Tabel 7. Tingkat kematian mencit jantan pada uji toksisitas akut green coke Dosis Perlakuan Jumlah kematian Persentase Kematian (%) 0 mg/kg 0 0 5 mg/kg 0 0 50 mg/kg 0 0 300 mg/kg 0 0 2000 mg/kg 0 0 erdasarkan uji pendahuluan terhadap sampel mencit jantan yang dicekok green coke dengan pengamatan respon kematian selama interval waktu 1, 3, 5, 7, dan 24 jam hingga hari ke-14, diperoleh data sebagaimana Tabel 7. Tabel tersebut memperlihatkan bahwa hingga dosis 2000 mg/kg, green coke tidak memiliki efek toksik, ditandai dengan tidak adanya mencit yang mati, baik itu pada perlakuan cekok dengan sampel 2459 maupun sampel 2460. Informasi sementara yang didapat adalah bahwa sampel green coke tidak bersifat toksik dan nilai LD 50 -nya dipastikan di atas 50 mg/kg. elum dapat ditentukan apakah green coke termasuk limbah 3 atau bukan karena nilai LD 50 sampel lebih besar dari 50 mg/kg. Untuk memastikan apakah sampel termasuk limbah 3 diperlukan data evaluasi kronis (sebagaimana penjelasan pasal 7 ayat (4) PP No
85 Tahun 1999: dalam mengidentifikasi suatu limbah/bahan apakah termasuk kategori limbah 3 atau bukan, maka apabila nilai LD 50 akut limbah lebih besar dari 50 mg/kg, maka diperlukan evaluasi kronis ). Penentuan evaluasi kronis diperlukan terhadap limbah yang mengandung bahan pencemar logam berat dengan alasan logam berat lebih bersifat kronis karena pengaruh sifat akumulatifnya dan paparan toksisitas kronis yang ditimbulkannya membutuhkan waktu yang relatif lama, sehingga dalam mengidentifikasi limbah tersebut tidak cukup hanya sampai pada penentuan sifat akutnya saja, namun diperlukan pula penentuan toksisitas sub akut/sub kronis dengan mengamati laju pertumbuhan dan gejala klinis yang timbul pada hewan uji, seperti: perubahan perilaku, kelainan fungsi organ dan gangguan-gangguan fisiologis lainnya. Informasi yang didapat selanjutnya dapat dianalogikan untuk mengetahui pengaruh limbah beracun tersebut terhadap manusia (William & urson 1995). Untuk memastikan hal tersebut, dalam penelitian ini telah dilakukan pula pengamatan perilaku mencit, laju pertumbuhan dan fungsi organ (hati, limpa, dan ginjal) dengan melihat perubahan respon bobot akibat perlakuan cekok dan pakan formulasi green coke. Penentuan Nilai Numerik ktual LD 50 Hasil uji lanjutan toksisitas akut pada penentuan nilai numerik aktual LD 50 tertera pada Tabel 8. erdasarkan data pada tabel tersebut terlihat bahwa pencekokkan dengan dosis 5000 mg/kg, mencit tetap dapat hidup normal (pengamatan dilakukan hingga hari ke-14). Hasil ini sekaligus memperlihatkan bahwa sampel green coke tidaklah toksik. Merujuk kepada kriteria penentuan tes LD 50 terhadap bahan berbahaya versi peraturan OECD, dinyatakan bahwa: apabila tidak ditemukan adanya kasus kematian pada hewan uji pada dosis perlakuan 5000 mg/kg, tidak disarankan Tabel 8. Tingkat kematian mencit jantan pada penentuan nilai numerik aktual LD 50
Dosis Perlakuan Jumlah kematian Persentase Kematian (%) Kontrol 0 0 5000 mg/kg 0 0 15000 mg/kg 0 0 untuk memberikan dosis perlakuan di atas kisaran angka tersebut. Pemberian dosis lebih dari 5000 mg/kg dapat dilakukan pada situasi apabila ada dugaan kuat sampel/bahan tersebut dapat menimbulkan bahaya bagi populasi manusia/hewan pada skala besar (OECD 2003). Dan untuk lebih memastikan apakah green coke benar-benar berbahaya atau tidak, maka dalam hal ini telah dilakukan pengujian pada dosis perlakuan hingga 15000 mg/kg. Hasil yang diperoleh ternyata memperlihatkan hingga pengamatan hari ke-14, pencekokan dengan dosis 3x dari yang disarankan OECD tetap menunjukkan tidak satupun mencit yang mati. Hasil ini sekaligus memastikan bahwa sampel green coke tidaklah toksik dan nilai numerik aktual LD 50 tidak dapat ditentukan dengan cara ini. Cara pendekatan yang dapat diterapkan untuk mengetahui nilai LD 50 estimasi dari suatu sampel adalah melalui perhitungan numerik sebagaimana yang telah dilakukan oleh Sax dalam Lewis (2003) melalui perhitungan UK Formula. Dengan UK Formula, estimasi nilai LD 50 suatu senyawa yang mengandung logam berat (green coke mengandung logam berat, Tabel 6) ditentukan melalui pendekatan konservatif berdasarkan nilai LD 50 unsur logam pencemar (merujuk penelitian Sax dalam Lewis, 2000). Perhitungan estimasi LD 50 green coke selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 3. erdasarkan perhitungan sebagaimana Lampiran 3, diperoleh nilai LD 50 estimasi untuk sampel green coke 2459 sebesar 349.366 g/kg dan sampel 2460 sebesar 313.974 g/kg (tidak berbeda nyata). Nilai ini menunjukkan bahwa green coke tidak bersifat toksik. Laju Pertumbuhan (obot adan) Mencit Selama Uji Toksisitas kut
Hasil pengamatan perubahan bobot badan mencit selama uji toksisitas akut pada seri dosis 0 mg/kg, 50 mg/kg, 300 mg/kg, 2000 mg/kg, 5000 mg/kg, dan 15000 mg/kg selengkapnya disajikan pada Lampiran 1 dan 2. Pengamatan fluktuasi bobot badan dilakukan setiap hari mulai dari jam 09 00-10 00 hingga hari ke-14, sedangkan pengamatan perubahan bobot badan rataan terhadap hari terakhir masa adaptasi diilustrasikan dalam Gambar 2 dan 3. Data pada lampiran memperlihatkan, baik pada kontrol (0 mg/kg ) maupun pada dosis 15000 mg/kg telah terjadi kenaikan bobot badan, perbedaannya hanya terletak pada seberapa besar peningkatan bobot badan yang terjadi, sedangkan Gambar 2 dan 3 memperlihatkan secara jelas bahwa kontrol menduduki peringkat teratas dalam penambahan bobot badan. Pada mencit kontrol tanpa perlakuan cekok green coke 2459 penambahan bobot badan terhadap hari terakhir masa adaptasi sebesar 4,63 gram sedangkan pada sampel green coke 2460 penambahan mencapai 4,97 gram. Secara umum terlihat bahwa laju penambahan bobot badan mencit yang dicekok dengan green coke lebih rendah dibandingkan kontrol. Hal ini menandakan bahwa green coke memiliki efek dalam menahan laju penambahan bobot badan. Gambar 2. Perubahan bobot badan mencit hari ke-14 terhadap hari terakhir masa adaptasi dalam uji toksisitas akut green coke 2459
Gambar 3. Perubahan bobot badan mencit hari ke-14 terhadap hari terakhir masa adaptasi dalam uji toksisitas akut green coke 2460 Penahanan laju bobot badan paling kuat terjadi pada mencit yang dicekok green coke dosis 15000 mg/kg, data ini sekaligus menginformasikan bahwa semakin tinggi dosis yang diberikan, semakin lambat pula laju penambahan bobot badan yang terjadi. Penahanan laju bobot badan pada perlakuan dosis 300 mg/kg menyimpang dari seri yang lainya, baik pada sampel green coke 2459 maupun 2460, terlihat bahwa penambahan bobot badan yang terjadi lebih rendah dibandingkan dengan dosis di atasnya (2000 mg/kg ). Salah satu faktor yang dapat menjadi penyebab hal ini adalah akibat pengaruh keragaan genetik mencit disamping faktor lingkungan yang mempengaruhi mood mencit (penempatan kandang kelompok dosis 300 mg/kg terjauh dari ventilasi udara). Hasil pengamatan secara umum tidak memperlihatkan adanya penurunan nafsu makan akibat pengaruh green coke, terbukti dengan habisnya pakan yang diberikan setiap harinya. Penahanan laju bobot badan kemungkinan besar terjadi akibat pengaruh senyawa dalam sampel (Pb dan hidrokarbon) yang memiliki daya diuretik dan laksatif sehingga pencekokkan menaikkan frekwensi buang air mencit. Pengamatan perilaku mencit untuk mengamati adanya gejala-gejala klinis yang mengacu kepada kecenderungan timbulnya gejala toksisitas sub akut/sub kronis tidak menunjukkan adanya penyimpangan perilaku. Mencit kontrol maupun mencit perlakuan menunjukkan aktivitas harian yang normal. Tidak ada gejala-gejala seperti perilaku gelisah/stress, bulu berdiri, lesu/hilang kesadaran ataupun tremor yang merupakan salah satu ciri adanya gejala keracunan. Hasilhasil diatas jika digabungkan dengan bobot badan mencit serta gejala klinis yang
diamati selama perlakuan menunjukkan kecenderungan tidak adanya/tidak timbulnya gejala-gejala keracunan subakut maupun subkronis pada mencit perlakuan. erdasarkan hasil analisis statistik nova eka arah yang dilanjutkan dengan Uji Tukey untuk melihat ada tidaknya perbedaan antar ulangan (4 ulangan setiap seri dosis) baik pada sampel mencit yang dicekok green coke 2459 maupun 2460 menunjukkan hasil tidak berbeda nyata pada selang kepercayaan 95%, sehingga nilai penambahan bobot badan yang diperoleh dapat dirata-ratakan dan fluktuasi bobot badan yang terjadi terhadap hari terakhir masa adaptasi dapat dibuat berdasarkan nilai rataan tersebut (Gambar 4 dan 5). Contoh analisis stastistik tertera pada Lampiran 4. Gambar 4. Fluktuasi bobot badan mencit cekok green coke 2459 terhadap hari terakhir masa adaptasi dalam uji toksisitas akut Gambar 4 memperlihatkan terjadinya penurunan bobot pada mencit yang dicekok geen coke 2459 seri dosis 300-15000 mg/kg. Penurunan bobot badan terjadi sejak hari pertama pencekokkan, penurunan bobot badan tidak terjadi pada seri dosis 0-50 mg/kg. Penurunan bobot badan mencit dosis 300 mg/kg terjadi hingga hari ke-2 mencapai -0,27 gram dan pada hari ke-3 berbalik naik mencapai rataan 0,26 gram. Selengkapnya data dapat dilihat pada Lampiran 1. Sementara itu pada pencekokkan dengan dosis 2000 mg/kg, penurunan bobot
badan dibawah normal terjadi hingga hari ke-3 setelah pencekokkan, maksimum penurunan bobot badan terjadi pada hari ke-2 (-0,34 gram) dan memasuki hari ke- 3 bobot badan mencit naik perlahan. Gambar 5. Fluktuasi bobot badan mencit cekok green coke 2460 terhadap hari terakhir masa adaptasi dalam uji toksisitas akut Waktu penurunan bobot badan relatif lama terjadi pada mencit yang dicekok dosis 5000-15000 mg/kg. Penurunan bobot berlangsung hingga hari ke-4 pada dosis 5000 mg/kg dan pada dosis 15000 mg/kg penurunan bobot terjadi hingga hari ke-7. Gambar 4 sekaligus menginformasikan bahwa semakin tinggi dosis green coke yang diberikan semakin lama pula efek penahanan laju bobot badan yang terjadi. Hasil analisis statistika nova eka arah yang dilanjutkan dengan Uji Tukey pada selang kepercayaan 95% terhadap penurunan bobot badan pada seri dosis 2000-15000 mg/kg menunjukkan hasil berbeda nyata (data tidak dilampirkan), hasil ini menginformasikan bahwa pemberian green coke 2459 hingga dosis 300 mg/kg tidak memiliki efek apapun dan pemberian dosis 2000-1500 mg/kg berpengaruh terhadap bobot badan. Hal serupa terjadi pada mencit yang dicekok green coke 2460 (Gambar 5). Penurunan bobot badan terjadi pada mencit yang dicekok dosis 300-15000 mg/kg dan penurunan bobot badan paling lama terjadi pada pemberian dosis 15000 mg/kg. erdasarkan hal ini maka dapat dikatakan green coke mempengaruhi
laju penambahan bobot badan, semakin tinggi dosis yang diberikan semakin tinggi pula penahanan laju bobot badan yang terjadi (efek green coke bergantung dosis) dan diduga kuat green coke dapat mempengaruhi sistem absorpsi pada lumen, selain itu diduga bahwa pemberian green coke dalam waktu yang lama akan memiliki efek yang sama dengan pemberian langsung pada dosis yang lebih tinggi (efek akumulasi). Untuk menguji adanya pengaruh efek akumulasi, di bawah ini dipaparkan data laju pertumbuhan (bobot badan) mencit selama uji toksisitas subkronis. Pada uji ini, mencit diberikan pakan formulasi green coke dengan dosis 2000 ppm selama 27 hari dan pengamatan dilakukan setiap 2 hari sekali. Laju Pertumbuhan (obot adan) Mencit Selama Uji Toksisitas Subkronis Laju pertumbuhan (bobot badan) mencit selama uji toksisitas subkronis secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 5 sedangkan rataan laju pertumbuhan dari setiap kelompok diringkas dan diilustrasikan sebagaimana Gambar 6 dan 7. Lampiran 5 memperlihatkan selama 6 hari masa adaptasi baik mencit kontrol maupun perlakuan sama-sama mengalami kenaikan bobot badan (secara umum kenaikannya tidak berbeda nyata, data tidak dilampirkan). Hal sebaliknya terjadi ketika mencit perlakuan diberikan pakan formulasi green coke, baik pada mencit yang diberikan green coke 2459 maupun 2460 sama-sama mengalami penurunan bobot badan. Penurunan bobot badan terjadi sejak hari pertama pakan formulasi green coke diberikan, penurunan bobot badan pada mencit betina berkisar antara 0,22-0,39 gram sedangkan pada mencit jantan antara 0,40-0,63 gram. Terlihat bahwa sejak hari pertama pemberian pakan formulasi, penurunan bobot badan jantan terjadi lebih besar dibandingkan betina, hal ini berlangsung hingga 27 hari pengamatan. Pada hari terakhir pengamatan, penurunan bobot badan mencit betina mencapai 4,83 gram dan pada mencit jantan hingga 5,60 gram (Gambar 6 dan 7).
Gambar 6. Laju perubahan bobot badan mencit jantan perlakuan pakan formulasi green coke 2000 ppm pada uji toksisitas subkronis Gambar 7. Laju perubahan bobot badan mencit betina perlakuan pakan formulasi green coke 2000 ppm pada uji toksisitas subkronis Gambar 6 dan 7 memperlihatkan green coke 2459 memiliki pengaruh yang lebih besar dalam menurunkan bobot badan mencit dibandingkan 2460, terutama pada mencit jantan, namun berdasarkan analisis statistika (nova dilanjutkan Tukey) diketahui bahwa pada selang kepercayaan 95%, baik mencit jantan yang diberi perlakuan pakan formulasi green coke 2459 maupun 2460 menunjukkan
hasil tidak berbeda nyata (contoh perhitungan dapat dilihat pada Lampiran 6), demikian halnya dengan mencit betina. Hasil ini sekaligus menyimpulkan bahwa pengaruh yang ditimbulkan oleh kedua jenis pakan formulasi ini adalah sama atau dengan kata lain, green coke 2459 adalah sama dengan green coke 2460 walaupun dalam pengambilannya 2459 diperoleh dari dalam drum truk pengangkut dan 2460 dari container kapal laut. Untuk memperkuat pendapat ini, selengkapnya diukur kandungan senyawa dan unsur dalam kedua sampel. Data selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 8 dan 9. Data pada tabel menunjukkan bahwa komposisi nutrisi dan logam yang terkandung dalam green coke 2459 dan 2460 (Tabel 8) adalah sama. Tabel 9. Perbandingan nutrisi pakan standar dan pakan formulasi green coke Nutrisi Pakan Standar Pakan Green coke 2459 2460 Protein Kasar (%) 20,54 20,32 20,30 Lemak (%) 5,71 5,65 5,70 Serat Kasar (%) 7,20 8,07 8,01 bu (%) 8,13 7,45 7,80 Kalsium 1,52 1,52 1,50 Fosfor 1,29 1,25 1,25 Hasil analisis statistika anova eka arah pada selang kepercayaan 95% terhadap mencit yang diberi perlakuan pakan green coke dibandingkan mencit kontrol menunjukkan hasil berbeda nyata. Pada mencit jantan pakan green coke 2459 penurunan badan yang signifikan baru terjadi pada hari ke-3 pengamatan, sedang pada mencit dengan pakan 2460 penurunan signifikan baru terjadi pada pengamatan hari ke-5. Hal serupa terjadi pada mencit betina, perlakuan pakan 2459 menunjukkan penurunan yang berarti pada pengamatan hari ke-3 sedang pakan 2460 pada hari ke-11. Perbedaan hari ini diduga kuat dipengaruhi oleh perbedaan awal bobot badan mencit. erdasarkan hal ini diketahui bahwa green coke benar-benar menurunkan bobot badan dan laju penurunan yang terjadi dikatakan sebanding dengan besarnya akumulasi green coke dalam tubuh, artinya semakin banyak green coke yang terakumulasi, semakin kuat penurunan bobot badan yang terjadi, singkatnya dapat dikatakan bahwa green coke memiliki efek
akumulasi yang cukup kuat, terbukti dengan memberikan efek hambatan pertumbuhan di atas 70% (berdasarkan rataan laju pertumbuhan antara perlakuan dibandingkan kontrol, Gambar 6 dan 7). erdasarkan pengamatan terhadap tingkah laku mencit selama perlakuan, diketahui bahwa mencit tidak menunjukkan gejala stres, namun mengalami kecenderungan penurunan nafsu makan. danya campuran green coke pada pakan menyebabkan penurunan nilai organoleptik pakan, pakan tidak lagi berbau khas ataupun gurih melainkan hambar. danya penurunan nilai organoleptik ini diduga kuat menjadi faktor lain yang bertanggung jawab dalam menurunkan bobot badan selain adanya kandungan senyawa dalam green coke yang memberikan efek laksatif dan diuretik Data sisa pakan selama uji toksisitas kronis pada mencit perlakuan selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 7. Untuk melihat pengaruh pemberian green coke terhadap jenis kelamin, telah dilakukan analisis statistik mengunakan nova (two way) pada selang kepercayaan 95%, dilihat adanya interaksi antara pakan formulasi yang diberikan dengan respon penurunan bobot badan maupun perbedaan kelamin. Walaupun sekilas terlihat pada Gambar 6 dan 7 penurunan bobot badan mencit jantan lebih besar dibandingkan mencit betina, namun hasil analisis statistik menyatakan terhadap keduanya tidak ada perbedaan atau dengan kata lain pemberian pakan formulasi green coke 2000 ppm memiliki efek yang sama baik terhadap mencit jantan maupun mencit betina. Contoh perhitungan statistik dapat dilihat pada Lampiran 8. Uji Reproduksi pada Mencit Untuk lebih memberikan gambaran dan bukti yang kuat tentang dugaan sifat toksik limbah green coke telah dilakukan uji reproduksi pada mencit, uji reproduksi dilakukan bersamaan dengan uji toksisitas subkronis. Mencit betina dan jantan selama uji toksisitas subkronis dikawinkan dalam satu kandang dan terhadapnya diberikan pakan formulasi green coke 2000 ppm. Dari hasil pengamatan diketahui bahwa mencit betina yang diperlakukan dengan pakan formulasi mengalami keterlambatan kelahiran antara 5-6 hari dibandingkan kontrol dan tidak semua mencit betina dapat melahirkan. Selain itu berdasarkan
hasil penimbangan terhadap bayi mencit yang dilahirkan dari induk perlakuan pakan formulasi green coke diketahui bahwa bobotnya lebih kecil dibandingkan kontrol. Data selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 10. Tabel 10. Perbandingan bobot janin mencit kontrol dan perlakuan pada uji reproduksi No obot ayi Mencit (gram) Kontrol Green coke 2459 Green coke 2460 1 0,76 0,45 0,51 2 0,81 0,56 0,47 3 0,79 - - 4 0,80 - - Hasil analisis statistika terhadap bobot bayi kontrol (nova eka arah, selang kepercayan 95%) dibandingkan perlakuan menunjukkan hasil berbeda nyata, sedangkan pada sesama bayi baik itu yang diberikan pakan formulasi green coke 2459 maupun 2460 menunjukkan hasil tidak berbeda nyata. Hasil yang diperoleh ini sekaligus menguatkan data pada toksisitas subkronis yang menyatakan bahwa green coke 2459 adalah sama dengan green coke 2460. Menurut Eisen et al (1980) dikatakan bahwa tingkat kesuburan mencit dipengaruhi oleh faktor kualitas dan kuantitas pakan yang dikonsumsi, kondisi induk saat dikawinkan, dan sistem perkawinan. Salah satu faktor penting adalah adanya asupan nutrisi yang baik atas induk mencit. Data penentuan bobot badan menunjukkan adanya keterkaitan antara penurunan bobot badan induk mencit dengan bobot bayi yang dilahirkan. Induk yang mengalami penurunan bobot badan berakibat terhadap penurunan bobot badan bayi, kurang dari kisaran bobot bayi mencit normal antara 0,5-1,0 gram (Smith, 1988). Diduga kuat rendahnya bobot bayi mencit yang lahir dari induk perlakuan pakan green coke adalah akibat malnutrisi sebagai dampak dari penurunan nafsu makan. nalisis Organ (Hati, Ginjal dan Limpa) pada Mencit Hasil Uji Toksisitas kut
nalisis organ diperlukan untuk melihat adanya pengaruh pencekokkan green coke terhadap bobot organ dan histologinya. nalisis ini diperlukan untuk menyimpulkan apakah green coke bersifat toksik atau tidak dan apakah green coke terakumulasi dalam organ ini atau tidak. Data bobot organ selengkapnya dapat dilihat pada Gambar 8 sedangkan hasil histopat (analisis histologi) dapat dilihat pada Gambar 9-10. Gambar 8. Pengaruh green coke terhadap bobot organ mencit Gambar 8 menunjukkan bahwa pemberian green coke tidak berpengaruh terhadap bobot organ, data ini diperkuat dari hasil analisis statistik nova eka arah yang dilanjutkan dengan Uji Tukey pada selang kepercayaan 95% yang menunjukkan hasil tidak berbeda nyata (data tidak dilampirkan). Hasil yang didapat ini sekaligus menjelaskan bahwa green coke selain tidak bersifat toksik juga pada dosis 15000 mg/kg tidak berbahaya bagi organ atau secara tidak langsung penurunan bobot badan yang terjadi akibat paparan green coke tidak sampai berpengaruh terhadap perubahan organ (bobotnya). Data penurunan organ selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 9. Histologi Organ Hati dan Ginjal
Hati dan ginjal merupakan organ yang rentan terhadap senyawa toksik. Hati merupakan organ tubuh yang paling sering menerima jejas. Hal ini karena hati merupakan pintu gerbang semua bahan yang masuk ke dalam tubuh melalui saluran cerna. Zat makanan, sebagian besar obat-obatan serta toksikan yang masuk ke tubuh melalui saluran cerna setelah diserap oleh epitel usus akan dibawa melalui vena porta ke hati. Oleh sebab itu, hati menjadi organ yang sangat potensial menderita keracunan lebih dahulu sebelum organ lain (Robbin & Kumar 1995) Ginjal merupakan organ yang kompak, terikat pada dinding dorsal dan terletak retroperitoneal. Ginjal menghasilkan urin yang merupakan jalur utama ekskresi toksikan. Ginjal mempunyai volume aliran darah yang tinggi, mengkonsentrasi toksikan pada filtrat, dan membawa toksikan melalui sel tubulus, serta mengaktifkan toksikan tertentu. kibatnya ginjal merupakan organ sasaran utama dari efek toksik (Lu1995). Ginjal merupakan organ yang beratnya kurang dari 1% berat tubuh. Walaupun demikian, organ ini menerima sekitar 20% curah jantung. liran darah ginjal tersebut didistribusikan ke korteks ginjal melalui cabang-cabang arteri ke glomerulus yang melekat pada tubulus. Fungsi glomerulus sebagai penyaring dan tubulus sebagai tempat mengkoleksi bahan buangan dan kelebihan air. Oleh karena itu tubuli dan jaringan interstitium korteks ginjal lebih mudah terkena toksin yang bersirkulasi dibandingkan dengan jaringan-jaringan lainnya. Indikator adanya gangguan pada ginjal dapat diketahui dengan mengamati adanya proliferasi glomerulus yang berasal dari pembengkakan maupun penambahan sel-sel endotel dan epitel (Churg & Sobin 1982; Spargo et al. 1980). Hal yang sama juga dikemukakan oleh Kincaid-Smith & Whitworth (1987) yang menyatakan bahwa penghitungan jumlah sel-sel glomerulus dan diameter glomerular ginjal dapat digunakan untuk menentukan adanya gangguan pada ginjal. Meskipun demikian standar ketebalan dan potongan yang melalui inti atau vascular pole glomerulus normal sering memberikan rentang jumlah sel-sel serupa dengan yang menderita gangguan ginjal. Oleh sebab itu Kincaid-Smith & Whitworth (1987) menyatakan bahwa untuk menentukan adanya gangguan pada ginjal diperlukan gambaran selular dari korteks ginjal yang dikombinasikan dengan penghitungan glomerulus dan diameter glomerular ginjal.
Pada penelitian ini hanya dilakukan pengamatan jaringan organ secara deskriptif tanpa adanya penghitungan sel. Hal ini dikarenakan pada sejumlah preparat histologi yang dibuat, terdapat kesalahan dalam proses pembuatannya, terutama dalam proses pemotongan/pengirisan jaringan yang ketebalannya tidak seragam. Kondisi ini menyebabkan ada bagian jaringan ginjal yang tidak / kurang dapat diamati dengan baik karena bagian sel yang pengirisannya terlalu tebal. Ini terutama ketika dilakukan pengamatan sel glomerulus maupun bagian epitel, terjadi penumpukan sel sehingga tidak dapat diamati adanya kelainan atau tidak. Gambar 9. Ginjal normal Gambar 10. Hati normal Secara histologis ginjal terdiri dari tiga unsur utama (Nabib 1987). Glomerulus merupakan suatu gelung pembuluh darah kapiler yang masuk melalui arteriol afferents dan keluar melalui arteriol efferents. Tubuli sebagai parenkim yang bersama glomerulus membentuk nefron, suatu unit fungsional terkecil dari ginjal. Terakhir adalah interstitium berikut pembuluh-pembuluh darah, limfe dan syaraf. Secara histologis, sel hati(hepatosit) berbentuk polihedral, intinya bulat terletak di tengah, nukleolus dapat satu atau lebih dengan kromatin yang menyebar. Kadang-kadang ditemukan inti sel hati lebih dari satu akibat pembelahan sitoplasma yang tidak sempurna (Hartono 1992). Unit fungsional dasar hati adalah lobulus hati yang berbentuk silindris. Lobulus hati terbentuk mengelilingi sebuah vena sentralis yang mengalir ke vena hepatika dan kemudian ke vena cava. Lobulus sendiri dibentuk terutama dari banyak lempeng sel hati yang tebalnya satu sampai dua sel (Guyton 1994)
Saluran portal (segitiga kiernan) merupakan unit fungsional yang terpusat pada saluran empedu di daerah portal yang dibentuk antara tiga sampai enam lobulud hati (Hartono 1992). Di dalam segitiga kiernan ditemukan percabanganpercabangan vena porta disamping pembuluh empedu dan percabangan daripada arteri hepatika. Darah dari cabang-cabang arteri hepatika dan vena porta ini masuk ke dalam sistem kapiler-kapiler hati yang disebut sinusoid (Ressang, 1984). Sinusoid vena dilapisi oleh dua tipe sel yaitu sel endotel khas dan sel kupfer besar yang merupakan makrofag jaringan yang mampu memfagositosis bakteri dan benda asing dalam darah (Guyton 1994) Gambaran Histologi Ginjal pada Uji Toksisitas kut Sampel Green coke 2459 ( Pembesaran 400x )
Gambaran Histologi Ginjal pada Uji Toksisitas akut Sampel Green coke 2460 ( Pembesaran 400x )
Dosis 5 mg/kg Keterangan:. kongesti Dosis 50 mg/kg Keterangan:. kongesti Dosis 300 mg/kg Keterangan:. kongesti. edema glomerulus Dosis 2000 mg/kg Keterangan:. edema glomerulus. kongesti C Dosis 5000 mg/kg Keterangan:. kongesti. edema glomerulus C. peradangan Dosis 15000 mg/kg Keterangan:. edema glomerulus. kongesti Pengamatan secara histopatologi pada organ ginjal mencit yang mengalami uji toksisitas akut baik pada sampel green coke 2459 maupun 2460 menunjukkan adanya perubahan perubahan baik yang terjadi pada glomerulus maupun pada daerah tubuli ginjal. Pada semua dosis perlakuan terlihat adanya kongesti yang kemungkinan besar disebabkan oleh penggunaan eter untuk euthanasia. Kongesti adalah adanya darah dalam jumlah berlebih dalam jaringan.
Menurut brams (1992), kongesti adalah keadaan dimana terdapat darah secara berlebihan di dalam pembuluh darah tertentu. danya kongesti diduga diakibatkan oleh teknik euthanasia menggunakan eter. Menurut Ganiswara (1995), eter merupakan anestetik yang sangat kuat, dapat menekan kontraktilitas otot jantung, menyebabkan dilatasi pembuluh darah kulit, dan juga menyebabkan vasodilatasi pada pembuluh darah organ. Pada organ ginjal mencit, hampir pada semua dosis perlakuan, baik pada sampel green coke 2459 dan 2460, terdapat perbesaran diameter kapsula owman, dan glomerulus diduga mengalami edema. Ini adalah salah satu indikasi adanya gangguan pada ginjal (Wilson 2005). Edema glomerulus yang terjadi kemungkinan disebabkan adanya kerusakan filter glomerulus (kapiler darah) pada kelompok perlakuan, yang diduga disebabkan oleh senyawa senyawa yang mungkin bersifat toksik yang ada pada green coke, yang mencederai membran glomerulus. Rusaknya filter/membran glomerulus menyebabkan gangguan permeabilitas membran dalam transpor natrium yang diikuti osmosis air ke dalam sel, sehingga mengakibatkan terjadinya penimbunan cairan dalam ekstrasel (Spector& Spector 1993). Edema glomerulus dapat ditandai oleh adanya penimbunan protein pada mesangium sehingga terjadi perluasan ruang owman (Hock & Elstner 2005). Tetapi menurut Corwin (2001), kejadian edema yang mencapai 90% belum menunjukkan gangguan fungsional ginjal. Hal ini disebabkan oleh senyawa toksik yang diduga terkandung dalam sampel green coke, mungkin dapat merusak pembuluh darah kapiler yang menyebabkan terjadinya gangguan permeabilitas membran, namun tidak menyebabkan terjadinya nekrosa. Secara keseluruhan, uji toksisitas akut pada berbagai dosis perlakuan diduga tidak menimbulkan efek yang mematikan bagi fungsi ginjal. Karena timbulnya perubahan perubahan seperti adanya edema glomerulus, peradangan pada dosis perlakuan tertentu (dosis 300 dan 5000 mg/kg pada sampel green coke 2460) belum menunjukkan adanya gangguan serius pada fungsi ginjal. Hal ini dikarenakan apabila pemberian bahan asing tersebut dihentikan, maka glomerulus dan tubuli ginjal dapat melakukan regenerasi untuk memulihkan kondisinya seperti semula. Lain halnya bila terjadi nekrosa (kematian sel), yang merupakan kelanjutan dari degenerasi dan bersifat reversibel. Timbulnya nekrosa
menunjukkan adanya gangguan serius pada fungsi ginjal (Carlton & McGavin, 1995). Peradangan ginjal yang terjadi pada mencit dosis tertentu diduga bukan disebabkan secara langsung oleh bahan toksik yang mungkin terkandung pada sampel green coke, akan tetapi diakibatkan oleh kondisi individu dari hewan percobaan saat dilakukan uji toksisitas akut. Gambaran Histologi Ginjal pada Uji Toksisitas Subkronis Hasil pengamatan pada histopatologi ginjal mencit pada kelompok perlakuan dibandingkan dengan kelompok kontrol pada uji toksisitas subkronis menunjukkan adanya perubahan-perubahan baik pada glomerulus, tubulus ginjal maupun pada kapsula owman. Pada ginjal perlakuan jantan untuk sampel green coke 2459 dan 2460 terlihat adanya kongesti (perdarahan). pada pembuluh darah organ. Pada organ ginjal mencit jantan perlakuan baik pada sampel green coke 2459 dan 2460, terdapat perbesaran diameter kapsula owman, adanya kecenderungan edema (penimbunan cairan) pada glomerulus Histopatologi dari ginjal mencit betina perlakuan pada uji toksisitas subkronis agak susah untuk dideskripsikan, karena teknik pembuatan preparat histopat yang kurang baik, sehingga baik glomerulus maupun tubuli ginjal agak kurang jelas terlihat. Tetapi pada gambar dapat terlihat, adanya kecenderungan terjadinya piknotis (pengecilan inti sel), pada ginjal mencit betina perlakuan. Demikian juga ada kecenderungan terjadi kongesti. Juga terlihat adanya kecenderungan edema pada glomerulus, walaupun tidak begitu jelas terlihat. Pada ginjal mencit betina perlakuan, juga terlihat kecenderungan terjadinya sedikit peradangan Secara umum, seperti pada uji toksisitas akut, walaupun terjadi perubahan perubahan pada komponen utama ginjal seperti glomerulus dan ruang owman hal ini belum menunjukkan adanya gangguan fungsional ginjal yang serius. Ini disebabkan karena perubahan atau degenerasi yang mungkin timbul, belum mengarah kepada nekrosis
C Ginjal normal Keterangan:. glomerulus,. ruang owman C Ginjal perlakuan etina 2459 Keterangan:. piknotis,. kongesti, C. edema glomerulus Ginjal perlakuan etina 2460 Keterangan:. Piknotis,. kongesti, C. edema glomerulus Ginjal perlakuan Jantan 2459 Keterangan :. edema glomerulus,. kongesti Ginjal perlakuan Jantan 2460 Keterangan :. edema glomerulus,. kongesti Gambaran histologi hati pada uji toksisitas akut sampel green coke 2459 ( Pembesaran 400x ) C
Hasil pemeriksaan histopatologi hati pada perlakuan sampel green coke 2459 pada dosis 5 mg/kg menunjukkan adanya kongesti pada sinusoid. Seperti dijelaskan terdahulu kemungkinan kuat kongesti disebabkan oleh penggunaan eter
sebagai ethanusia yang mengakibatkan vasodilatasi pada pembuluh kapiler darah. Selain itu ditemukan adanya sel radang walapun sedikit, peradangan ini ditandai pula oleh hadirnya sel kupffer. Sel kupffer banyak terdapat pada dinding dinding kapiler dan sinusoid sinusoid, merupakan sel makrofag besar dan aktif yang berasal dari monosit (Hartono 1992). Demikian pula gambaran histopatologis hati mencit pada dosis 50 mg/kg, terdapat kongesti dan sedikit peradangan pada sel hepatosit. Pada dosis 300 mg/kg kondisi hepatosit hampir sama dengan dosis sebelumnya, akan tetapi disini mulai terdapat degenerasi sel hepatosit. Hal ini ditandai oleh adanya karyomegali (pembesaran inti) sel hepatosit. Menurut Ressang (1984), adanya degenerasi hepatosit selain ditandai dengan karyopiknotik (penyusutan inti sel), karyorheksis dan karyolisis, juga ditandai dengan adanya karyomegali. Kondisi yang hampir sama ditemui pada mencit perlakuan pada dosis 2000 mg/kg. Terdapat kongesti dan kemunculan sel radang. pabila tampilan preparat cukup baik, maka kemungkinan akan ditemukan juga sel sel kupffer sebagai reaksi adanya sel radang penyebab inflamasi. Pada dosis perlakuan 5000 mg/kg, mulai terlihat adanya degenerasi hepatosit yang ditandai dengan adanya nekrosis dengan inti piknotis. Nekrosa dapat dibedakan dari apoptosis dengan adanya kehadiran sel radang ( Lu 1995). Hal yang hampir sama dapat ditemukan pada mencit perlakuan dosis 15000 mg/kg dimana terlihat adanya kongesti dan munculnya sel-sel radang. pabila pembuatan preparat cukup baik, maka dapat juga dilihat adanya sel makrofag ( sel kupffer) disekitar sel radang. Pada hampir semua dosis perlakuan ditemukan adanya dilatasi (perluasan) sinusoid. kan tetapi hal ini kurang dapat dijadikan parameter karena besar kemungkinan timbulnya perluasan sinusoid ini disebabkan karena penggunaan eter untuk euthanasia pada proses pembiusan hewan percobaan dengan alasan seperti yang telah dijelaskan sebelumnya. Gambaran histologi hati pada uji toksisitas akut sampel green coke 2460 ( Pembesaran 400x ) C C
Mencit perlakuan pada dosis 5 mg/kg pada sampel green coke 2460 ternyata menunjukkan adanya gejala degenerasi sel hepatosit yang ditandai dengan adanya nekrosis dan munculnya sel radang serta sel kupffer. Tetapi hal ini belum menunjukkan adanya gejala kerusakan yang serius, karena organ hati memiliki kecepatan regenerasi sel yang mengagumkan. danya degenerasi hepatosit pada dosis ini diduga disebabkan oleh kondisi individu dari hewan
percobaan yang kurang maksimal saat perlakuan berlangsung. Hal yang agak berbeda terjadi pada mencit perlakuan dengan dosis 50 mg / kg. Terlihat adanya kongesti, sel radang serta munculnya sel kupffer, tetapi tidak ditemukan adanya gejala degenerasi hepatosit. Pada dosis 300 mg/kg, kondisi yang sama terlihat seperti pada dosisdosis sebelumnya, akan tetapi disini terlihat pula terjadi degenerasi pada sel hati yang ditandai oleh inti sel yang menjadi pucat dan terjadi penyusutan ukuran sel hepatosit. Kemungkinan telah terjadi sedikit gejala nekrosis, karena ditemukan adanya sel radang disekitar sel hepatosit yang mengalami degenerasi. danya denegerasi sel hepatosit ditemukan juga pada pemberian dosis 2000 mg/kg yang ditandai dengan pembesaran ukuran sel (karyomegali). Secara proses pembuatan preparat, organ hati mencit perlakuan pada dosis 5000 mg/kg nampaknya kurang baik tampilan selnya, karena terlihat irisan jaringan yang kurang tipis, sehingga gambaran sel kurang terlihat jelas. Tetapi masih dapat dilihat pada dosis ini telah terjadi dilatasi (perluasan/pelebaran) sinusoid. pabila tampilan preparat pada dosis ini bagus, biasanya akan terlihat adanya proliferasi dari sel kupffer. Hal yang sama terlihat pada mencit perlakuan dengan dosis 15000 mg/kg. Pembuatan preparat histologis agak kurang baik, sehingga tidak dapat memberikan gambaran sel hepatosit secara jelas. kan tetapi masih dapat dilihat adanya dilatasi sinusoid serta adanya kongesti. Seperti pada sampel green coke 2459, semua organ hati pada semua dosis perlakuan menunjukkan kecenderungan terjadinya dilatasi sinusoid sehingga tidak dijadikan parameter adanya kelainan pada hati. Karena hal ini diduga akibat pembiusan dengan menggunakan eter (Ganiswara 2005) Gambaran Histologi Hati pada Uji Toksisitas Subkronis ( Pembesaran 400x) C
Hati perlakuan etina 2460 Keterangan:. dilatasi sinusoid. kongesti Hati perlakuan etina 2459 Keterangan:. dilatasi sinusoid Hati perlakuan Jantan 2459 Keterangan:. dilatasi sinusoid. hepatosit Hati perlakuan Jantan 2460 Keterangan:. dilatasi sinusoid. kongesti erdasarkan gambaran histologi organ hati pada uji toksisitas subkronis, terlihat keadaan umum yang terjadi pada semua perlakuan yaitu terjadinya kongesti (perdarahan) dan dilatasi sinusoid pada organ hati semua mencit perlakuan. Hal ini tidak menjadi parameter gangguan hati karena seperti pada pengamatan histologis jaringan pada perlakuan sebelumnya, ini diduga disebabkan oleh efek dari proses pembiusan dengan menggunakan eter. Sebagian besar preparat histologis yang dibuat hasilnya kurang baik. Kesalahan utama dari
proses pembuatan preparat histologi jaringan ini diduga diakibatkan dari proses pemotongan dengan menggunakan mikrotom yang terlalu tebal (irisan kurang tipis). Ini terlihat dari tidak jelasnya gambaran sel hati (hepatosit), maupun gambaran dari sel sel lain pada preparat jaringan hati, yang mungkin dapat dipakai untuk menjelaskan adanya gangguan pada organ ini. Pengamatan Perilaku Mencit selama Perlakuan Uji Toksisitas kut dan Subkronis Pengamatan perilaku mencit untuk mengamati adanya gejala-gejala klinis yang mengacu kepada kecenderungan timbulnya gejala toksisitas sub akut/ sub subkronis, juga tidak menunjukkan adanya penyimpangan perilaku. Mencit kontrol maupun mencit perlakuan menunjukkan aktifitas harian yang normal. Tidak ada gejala gejala seperti perilaku gelisah/stress, bulu berdiri, lesu/hilang kesadaran atau tremor yang merupakan salah satu ciri adanya gejala keracunan. Hasil-hasil diatas jika digabungkan dengan bobot badan mencit serta gejala klinis yang diamati selama perlakuan menunjukkan kecenderungan tidak adanya /tidak timbulnya gejala-gejala keracunan sub akut maupun subkronis pada mencit perlakuan. Uji Toksisitas Subkronis (Metode Perhitungan dengan UK Formula) Pengujian toksisitas (nilai LD 50 ) subkronis dilakukan dengan melakukan uji total konsentrasi logam berat yang terkandung dalam limbah, tanpa melakukan uji LD 50 terhadap hewan uji mencit. Hasil analisis uji total konsentrasi logam berat disajikan pada Tabel 6 erdasarkan data pada tabel 6 diatas, selanjutnya ditentukan nilai LD 50 sampel limbah green coke dengan menggunakan metode perhitungan (UK formula) yaitu dengan melakukan perhitungan nila LD 50 suatu limbah dengan melalui pendekatan konservatif atas nila LD 50 rujukan komponen kandungan bahan pencemar yang terendah (data rujukan oral dari Sax & CHRIS dalam Lewis 2000). Dari perhitungan sebagaimana yang tertera pada Lampiran 3, didapatkan
nilai LD 50 sampel limbah green coke sebesar 349.36gr/kg untuk sampel green coke 2459 dan 313.974 gr/kg untuk sampel green coke 2460 erdasarkan hasil yang didapat, diperoleh nilai LD 50 yang jauh di bawah ambang batas LD 50 yang tergolong kategori limbah 3 ( < 50 mg/kg ). Data ini memperkuat hasil LD 50 berdasarkan uji oral terhadap hewan percobaan mencit yang menunjukkan bahwa secara oral nilai LD50 sampel limbah green coke tidak teridentifikasi karena sudah melebihi ambang batas > 15000 mg/kg yang apabila mengacu kepada standar OECD, maka seharusnya tidak di sarankan untuk menaikkan dosis oral lebih tinggi dari 5000 mg/kg. Hasil penelitian yang diperoleh menuju kepada kesimpulan sementara bahwa proses pembuatan/pengilangan minyak di Indonesia umumnya sudah cukup baik dan memenuhi standar keamanan terutama yang terkait dengan pencemaran lingkungan. Sampai saat ini, green coke telah digunakan sebagai bahan bakar alternatif selain batubara. Keuntungan penggunaan green coke sebagai bahan bakar antara lain Nilai kalori (Nett Calori Value) cukup tinggi (7000 8000 Cal/kg) dibandingkan batu bara (5000 6000 Cal/kg), penimbunan mudah dan kurang polusi, proses pemecahan (grading) lebih mudah dan kandungan abu lebih rendah (menekan biaya pencemaran). Data yang diperoleh menunjukkan bahwa Pertamina telah memproduksi green coke sekitar 330.000 ton/tahun yang sebagian besar diekspor ke luar negeri. (pertamina 2005) KESIMPULN DN SRN Kesimpulan