BAB III. METODE PENELITIAN 3.1. Jenis dan rancangan penelitian Penelitian ini menggunakan rancangan penelitian eksperimental laboratorium untuk menguji aktivitas antibakteri ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum) terhadap Staphylococcus aureus dengan metode dilusi cair. Pada pengujian ini, kemampuan aktivitas antibakteri ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum) diperoleh dari Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM). 3.2. Waktu dan tempat penelitian Pembuatan ekstrak dilakukan di laboratorium Biologi-Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Islam Indonesia pada bulan Februari 2016. Sedangkan untuk penelitian ini telah dilaksanakan di laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia pada rentang bulan Februari-Maret 2016. 3.3. Subjek penelitian Subjek penelitian menggunakan bakteri standar Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan bahan uji ekstrak etanol daun sirih merah dengan pelarut tween dan aquades. Bakteri yang dipakai untuk uji coba adalah bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 koleksi laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia 3.3.1. Bakteri Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif koagulase positif yang merupakan flora normal pada manusia dan bakteri yang epidemiologinya paling sering menyebabkan penyakit infeksi di Indonesia dibandingkan dengan bakteri gram positif koagulase positif lainnya. 3.3.2. Bahan uji Untuk penelitian ini, bahan uji yang peneliti gunakan dalam percobaan adalah ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum) dengan pelarut Tween 80 21
22 dan aquades yang pembuatannya dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi Universitas Islam Indonesia. Daun sirih merah yang digunakan diambil dari tanaman sirih merah yang ada di wilayah Sleman, Yogyakarta. 3.4. Variabel penelitian Dalam penelitian ini didapatkan 3 variabel, yaitu variabel bebas, variabel terikat dan variabel terkendali, berikut penjabaran dari variabel-variabel terkait: 3.4.1. Variabel bebas Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum) dengan pelarut Tween 80 dan konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum) dengan pelarut aquades. Nantinya ekstrak diencerkan secara serial dengan beberapa konsentrasi. 3.4.2. Variabel terikat Variabel terikat pada penelitian ini adalah pertumbuhan dan perkembangbiakan bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 yang dilihat dari hasil Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM). Nilai KHM didapatkan dengan membandingkan kekeruhan masing-masing tabung yang disebabkan oleh pertumbuhan dan perkembangbiakan bakteri Staphylococcus aureus dengan tabung kontrol. Sedangkan nilai KBM didapatkan dengan cara melihat pertumbuhan dan perkembangbiakan bakteri pada media agar darah dengan konsentrasi tertentu. 3.4.3. Variabel terkendali Untuk menjaga kevaliditasan penilaian, diperlukan pengendalian variabel yang dapat mempengaruhi hasil penelitian, variabel tersebut antara lain: 1. Subyek penelitian dijaga keakuratannya dengan cara melakukan biakan murni bakteri uji yang diperoleh dari koleksi laboratorium Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia. 2. Bahan uji antibakteri dijaga kevaliditasannya dengan memilih tanaman sirih merah yang berumur minimal 4 bulan dan umur daun minimal 1 bulan. 3. Uji kepekaan dilakukan menurut pedoman kerja laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia.
23 3.5.Definisi Operasional 1. Ekstrak etanol sirih merah dengan pelarut Tween adalah ekstrak pekat yang menggunakan bahan daun sirih merah sebagai bahan dasar pelarut etanol dan pada pengenceran digunakan pelarut tween80. 2. Ekstrak etanol sirih merah dengan pelarut aquades adalah ekstrak pekat yang menggunakan bahan daun sirih merah sebagai bahan dasar pelarut etanol dan pada pengenceran digunakan pelarut aquades. 3. Bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 adalah bakteri yang telah distandarisasi dan bukan bakteri yang diambil dari isolat klinik. 4. Kadar Hambat Minimal (KHM) adalah konsentrasi terkecil yang dapat menghambat pertumbuhan dan perkembangbiakan bakteri yang ditunjukkan dengan ada tidaknya kekeruhan dalam tabung reaksi yang dibandingkan dengan tabung kontrol 5. Kadar Bunuh Minimal (KBM) adalah kadar terkecil bahan uji yang mampu membunuh bakteri yang dibuktikan tidak terdapat perkembangbiakan bakteri dalam media agar darah 3.6.Pengumpulan data Data penelitian secara langsung dikumpulkan dari hasil penelitian yang di lakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia. Untuk kemampuan antibakteri ditunjukkan dengan diperolehnya nilai Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM).
24 3.7.Alur penelitian Gambar 6. Alur Penelitian
25 3.8.Instrumen penelitian 3.8.1. Alat a. Tabung reaksi dan rak b. Inkubator c. Ose bulat d. Lampu spiritus e. Mikropipet f. Autoklaf g. Korek api h. Blue tip i. Yellow tip 3.8.2. Bahan a. Bahan awal yang diproses menjadi ekstrak etanol daun sirih merah b. Bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 c. Akuades steril d. Tween 80 1% e. Standart Mc Farland f. NaCl g. Media : - BHI ds - Agar darah - Mc Conkey - Agar Sabouraud h. Procaine Penicillin-G
26 3.9. Tahap Penelitian 3.9.1. Pengambilan bahan Pengambilan bahan uji yakni daun sirih merah yang diambil dari tanaman sirih merah yang ada di wilayah Sleman, Yogyakarta. Untuk pengambilan sebaiknya dilakukan di pagi hari dengan cara memetik dimulai dari bagian bawah menuju atas daun. Daun sirih yang dipetik harus berasal dari tanaman minimal usia 4 bulan dan umur daun minimal 1 bulan, daun dalam kondisi bersih dan terlihat mengkilat karena pada kondisi ini kadar zat aktif dalam daun sirih sudah tinggi dan efektif sebagai bahan antibakterial (Hidayat, 2013). Daun yang sudah dipetik sebaiknya langsung diproses untuk dijadikan ekstrak. Setelah dipetik, daun disortir dan direndam dalam air yang berfungsi untuk membersihkan daun dari debu dan kotoran yang masih menempel. 3.9.2. Pembuatan ekstrak a. Pembuatan serbuk simplisia Daun sirih merah yang telah dipetik dan dipilih kemudian dicuci dengan air bersih. Setelah itu dikeringkan dalam oven dengan suhu 40-50 C selama kurang lebih 6-8 jam hingga daun sirih menjadi kering. Tujuan dari pengeringan sendiri adalah untuk mengurangi kadar air yang terkandung dalam daun sirih. Pengeringan dianggap selesai apabila bahan sudah dapat dipecah atau patah apabila diremas dengan tangan. Setelah kering, daun sirih yang telah dikeringkan dapat dijadikan serbuk dengan menggunakan blender dengan kehalusan tertentu. Kemudian serbuk ditimbang menggunakan timbangan sesuai dengan kebutuhan penelitian b. Proses ekstraksi Ekstraksi menggunakan proses maserasi yaitu dengan merendam serbuk simplisia dengan pelarut etanol 70%. Banyaknya etanol yang digunakan disesuaikan dengan banyaknya serbuk yang akan digunakan. Masukkan satu bagian serbuk kering simplisia ke dalam maserator, tambahkan 10 bagian pelarut (perbandingan 1:10 untuk serbuk simplisia dan pelarut).
27 Rendam selama 6 jam pertama sambil sekali-sekali diaduk, kemudian diamkan selama 18 jam. c. Separasi dan pemurnian Tahap ini berfungsi untuk memperoleh ekstrak yang lebih murni dengan cara serbuk yang telah dimaserasi kemudian disaring dengan menggunakan corong Buchner yang bertujuan untuk memisahkan senyawa yang tidak dikehendaki dengan semaksimal mungkin tanpa mempengaruhi kandungan senyawa yang dikehendaki, hasil dari saringan ini dinamakan filtrat I. Sisa atau ampas dari penyaringan tersebut ditambah kembali dengan etanol (disesuaikan) dan kembali pada proses maserasi yang akan menghasilkan filtrat II. d. Pengentalan ekstrak Filtrat I dan II dicampur, kemudian diuapkan dan dipekatkan menggunakan rotary evaporator pada suhu kurang dari 50 C hingga tidak terdapat etanol yang menetes lagi yaitu sampai diperoleh ekstrak pekat. Ekstrak pekat yang diperoleh selanjutnya ditimbang sesuai kebutuhan dan siap digunakan (Depkes, 2008). 3.9.3. Uji sterilitas ekstrak Uji sterilisasi ekstrak ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak dalam kondisi yang steril atau tidak. Cara yang dapat dilakukan adalah dengan cara mengambil 1 ose ekstrak dan menggoreskan ose pada media biakan agar darah, Mc Conkey dan agar sabouraud. Pada agar darah dan Mc Conkey yang telah diberi goresan ekstrak diinkubasi pada suhu 37 C selama 18-24 jam. Sedangkan pada agar sabouroud diinkubasi pada suhu 25-30 C selama 24-48 jam. Adanya koloni kuman yang tumbuh pada agar darah, Mc Conkey dan agar sabouroud menunjukkan bahwa ekstrak tidak steril. Jika ekstrak tidak steril maka ekstrak akan disaring dengan menggunakan penyaring. 3.9.4. Persiapan bakteri Bakteri Staphylococcus aureus yang telah disediakan diambil beberapa koloni kuman kemudian digoreskan pada media agar darah. Media agar darah yang telah diberi goresan bakteri tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama
28 18-24 jam. Setelah diinkubasi, diambil dengan menggunakan ose 3-4 koloni kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 1 ml BHI ds lalu diinkubasi pada suhu 37 C selama 4 jam. Selanjutnya membuat larutan bakteri dengan kekeruhan 10 8 CFU/ml dengan cara memasukkan NaCl ke dalam suspensi Staphylococcus aureus sampai kekeruhannya sama dengan standar Mc Farland I. Bakteri dengan kekeruhan 10 8 CFU/ml diencerkan sebanyak 100x dengan cara mengambil 0,1 ml bakteri dengan kekeruhan 10 8 CFU/ml tersebut yang kemudian dimasukkan ke dalam BHI ds sebanyak 9,9 ml sehingga didapatkan kekeruhan 10 6 CFU/ml yang siap digunakan untuk percobaan dilusi. 3.9.5. Uji perbandingan aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun sirih merah dengan pelarut tween dan aquades terhadap Staphylococcus aureus Pengujian kemampuan antibakteri ekstrak daun sirih merah menggunakan metode dilusi cair dengan kadar ekstrak 100%. Sebelumnya ekstrak telah diencerkan menggunakan pelarut Tween 80 1-2% sehingga didapatkan konsentrasi tertentu. Metode dilusi ini diawali dengan menyiapkan 11 tabung steril, tabung pertama diisi dengan 2 ml ekstrak etanol sirih merah kadar 100%, sedangkan tabung ke-2 sampai tabung ke-11 diisi dengan 1 ml akuades masing-masing. Dengan menggunakan mikropipet sebanyak 1 ml ekstrak etanol daun sirih merah dipindahkan dari tabung pertama ke tabung ke-2 sehingga konsentrasi atau kadar tabung ke-2 setengah dari tabung pertama, kemudian dari tabung ke-2 diambil 1 ml untuk dipindahkan ke tabung ke-3, begitu seterusnya sampai pada tabung ke-7. Setelah sampai pada tabung ke-7, 1 ml ekstrak yang ada dalam tabung ke-7 dipindahkan ke dalam tabung 8 dan digunakan sebagai kontrol ekstrak. Pada tabung ke-9 yang sudah berisi 1 ml akuades kemudian ditambahkan dengan 1 ml BHI ds yang digunakan sebagai kontrol media. Dengan metode ini sehingga didapatkan konsentrasi ekstrak sirih merah berturut-turut 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13% dan 1,56%. Selanjutnya masing-masing dari tabung ke-1 sampai tabung ke-7, tabung ke 10 dan 11 dimasukkan 1 ml suspensi bakteri Staphylococcus aureus dalam media BHI ds dengan kekeruhan bakteri 10 6 CFU/ml sehingga volume masing-masing tabung menjadi 2 ml. Pada akhirnya konsentrasi akhir bahan uji menjadi setengah
29 dari konsentrasi awal yaitu berturut-turut menjadi 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56% dan 0,78%. Kemudian tabung-tabung tersebut diinkubasi pada suhu 37 C selama 18-24 jam untuk menilai apakah terdapat pertumbuhan dan perkembangbiakan bakteri dengan melihat adanya kekeruhan pada media yang telah dibuat tersebut. Terdapat empat macam kontrol dalam pengujian dalam penelitian ini, yang pertama tabung ke-8 yang merupakan kontrol ekstrak berisi 1 ml akuades dan sisa ekstrak dari tabung ke-7, kedua adalah tabung ke-9 yang merupakan kontrol media berisi 1 ml akuades dan 1 ml BHI ds, yang ketiga merupakan kontrol bakteri pada tabung ke-10 berisi 1 ml akuades dan 1 ml suspensi bakteri dengan kekeruhan 10 6 CFU/ml dalam BHI ds. Yang keempat adalah kontrol antibiotik pada tabung ke-11 yang berisi 1 ml suspensi Staphylococcus aureus ditambah dengan antibiotik penisilin G 0,24 μg/ml. Kadar suspensi antibiotik penisilin G yang mampu menghambat bakteri S. aureus adalah 0,06-0,12 μg/ml (Saad, 2007). Pada pelarut aquades juga diberikan empat macam kontrol yang serupa. Nilai kadar hambat minimal (KHM) ditentukan dengan melihat tingkat kejernihan tabung ke-1 dampai ke-7 kemudian dibandingkan dengan keempat kontrol yang telah dibuat. Tentunya hasil penelitian dapat dilihat dengan syarat tabung kontrol ke-8, 9 dan 11 jernih tidak terdapat perkembangbiakan bakteri sedangkan tabung ke 10 menunjukkan kekeruhan yang membuktikan adanya perkembangbiakan bakteri. Sedangkan untuk menilai kadar bunuh minimal (KBM) dilihat dari perkembangbiakan bakteri pada media agar darah, yaitu dengan cara mengambil 1 ose suspensi dari tabung 1-11 dan digoreskan pada media agar darah setelah proses metode dilusi selesai dilakukan. Dilakukan percobaan yang sama namun pelarut yang digunakan adalah aquades untuk mendapatkan perbandingan. 3.10. Analisis Data Pada penelitian eksperimental laboratorium ini digunakan analisis data dengan menggunakan metode deskriptif, yaitu dengan cara pengamatan terhadap perbandingan kemampuan ekstrak etanol daun sirih merah dengan pelarut tween dan aquades untuk menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus yang dinilai
30 dengan melihat Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM) yang konsisten. 3.11. Etika penelitian Penelitian ini telah memperoleh ethical clearance dari Komisi Etik Penelitian Kedokteran dan Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia. Nomor ethical clearance yang telah didapat untuk penelitian ini adalah 24/Ka.Kom.Et/70/KE/I/2016.