BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Sediaan Apus Darah Tepi Sediaan apus darah tepi adalah suatu cara yang sampai saat ini masih digunakan pada pemeriksaan di laboratorium. Prinsip pemeriksaan sediaan apus ini adalah dengan meneteskan darah lalu dipaparkan di atas objek glass, kemudian dilakukan pengecatan dan diperiksa dibawah mikroskop. Guna pemeriksaan apusan darah: 1. Evaluasi morfologi dari sel darah tepi (eritrosit, trombosit, dan leukosit) 2. Memperkirakan jumlah leukosit dan trombosit 3. Identifikasi parasit (misal : malaria. Microfilaria, dan Trypanosoma). Sediaan apus darah tepi dapat diwarnai dengan berbagai macam metode termasuk larutan-larutan yang sederhana antara lain: pewarnaan Giemsa, pewarnaan acid fast, pewarnaan garam, pewarnaan wright, dan lainlain. Pewarnaan Giemsa disebut juga pewarnaan Romanowski. Metode pewarnaan ini banyak digunakan untuk mempelajari morfologi sel-sel darah, sel-sel lien, sel-sel sumsum dan juga untuk mengidentifikasi parasit-parasit darah misal Tripanosoma, Plasmodia dan lain-lain dari golongan protozoa. (Maskoeri, 2008) Pewarnaan Giemsa ( Giemsa Stain) adalah teknik pewarnaan untuk pemeriksaan mikroskopis yang namanya diambil dari seorang peneliti malaria yaitu Gustav Giemsa. Pewarnaan ini digunakan untuk pemeriksaan sitogenetik 5
6 dan untuk diagnosis histopatologis parasit malaria dan juga parasit jenis lainnya. (Jason and Frances, 2010 ) Dasar dari pewarnaan Giemsa adalah presipitasi hitam yang terbentuk dari penambahan larutan metilen biru dan eosin yang dilarutkan di dalam metanol. Yaitu dua zat warna yang berbeda yaitu Azur B ( Trimetiltionin ) yang bersifat basa dan eosin y ( tetrabromoflurescin ) yang bersifat asam seperti kromatin, DNA dan RNA. Sedangkan eosin y akan mewarnai komponen sel yang bersifat basa seperti granula, eosinofili dan hemoglobin. Ikatan eosin y pada azur B yang beragregasi dapat menimbulkan warna ungu, dan keadaan ini dikenal sebagai efek Romanowsky giemsa. Efek ini terjadi sangat nyata pada DNA tetapi tidak terjadi pada RNA sehingga akan menimbulkan kontras antara inti yang berwarna dengan sitoplasma yang berwarna biru. ( Arjatmo Tjokronegoro, 1996) Pewarnaan giemsa adalah teknik pewarnaan yang paling bagus dan sering digunakan untuk mengidentifikasi parasit yang ada di dalam darah ( blood-borne parasite ). ( Ronald dan Richard, 2004 ) Bahan pemeriksaan yang terbaik adalah darah segar yang berasal dari kapiler atau vena, yang dihapuskan pada kaca obyek. Pada keadaan tertentu dapat pula digunakan EDTA (Arjatmo Tjokronegoro, 1996) Jenis apusan darah : 1. Sediaan darah tipis Ciri- ciri apusan sediaan darah tipis yaitu lebih sedikit membutuhkan darah untuk pemeriksaan dibandingkan dengan sediaan apus darah tebal,
7 morfologinya lebih jelas. bentuk parasit plasmodium berada dalam eritrosit sehingga didapatkan bentuk parasit yang utuh dan morfologinya sempurna. Serta lebih mudah untuk menentukan spesies dan stadium parasit dan perubahan pada eritrosit yang dihinggapi parasit dapat dilihat jelas. 2. Sediaan darah tebal Ciri- ciri apusan sediaan darah tebal yaitu membutuhkan darah lebih banyak untuk pemeriksaan dibanding dengan apusan darah tipis, sehingga jumlah parasit yang ditemukan lebih banyak dalam satu lapang pandang, sehingga pada infeksi ringan lebih mudah ditemukan. Sediaan ini mempunyai bentuk parasit yang kurang utuh dan kurang begitu lengkap morfologinya. (Sandjaja, 2007) B. Giemsa pewarna Giemsa 10% sebagai pewarna yang umum digunakan agar sediaan terlihat lebih jelas. Pewarnaan ini sering disebut juga pewarnaan Romanowski. Metode pewarnaan ini banyak dipakai untuk mempelajari morfologi darah, sel-sel sumsum dan juga untuk identifikasi parasit-parasit darah misalnya dari jenis protozoa. Zat ini tersedia dalam bentuk serbuk atau larutan yang disimpan di dalam botol yang gelap. (Kurniawan, 2010). Zat warna yang digunakan dalam metode Romanovsky adalah Giemsa yang sebelumnya telah diencerkan dengan aquades. Semakin lama pewarnaan yang dilakukan maka intensitasnya menjadi semakin tua. Preparat apus yang yang telah selesai dibuat kemudian diamati dibawah mikroskop dengan
8 perbesaran 100x. Gambar yang didapat dalam hasil menunjukan sel-sel butir darah baik eritrosit, leukosit, trombosit, atau jenis parasit yang lain (Maskoeri, 2008). Sediaan apus darah secara rutin diwarnai dengan campuran zat warna khusus. Pewarnaan ini disebabkan karena oksidasi methylen blue dan pembentukan senyawa baru dalam campuran yang dinamakan azure. Setelah pemberiaan campuran jenis Romanosky, diferensiasi sel-sel dapat dilakukan Berdasarkan 4 sifat pewarnaan yang menyatakan afinitas struktur sel oleh masing-masing zat warna dari campuran, yaitu: 1. Afinitas untuk methylen blue 2. Afinitas untuk azure dikenal sebagai azurefilik ( ungu). 3. Afinitas untuk eosin (suatu zat warna asam ) dikenal sebagai asidofilik atau eosinofilia.(merah muda kekuningan ). 4. Afinitas untuk komplek zat warna yang terdapat dalam campuran, secara tidak tepat dianggap netral, dikenal sebagai neutrofilia (salmon-pink smplilac ). ( Safar, 2009 ). Giemsa adalah zat warna yang terdiri dari eosin dan metilen azur memberi warna merah muda pada sitoplasma dan metilen biru memberi warna pada inti leukosit. Ketiga jenis pewarna ini dilarutkan dengan metil alkohol dan gliserin. Larutan ini dikemas dalam botol coklat ( 100 500 1000 cc ) dan dikenal sebagai giemsa stock dengan ph 7. ( Depkes RI, 1993 ).
9 Pedoman pemakaian Giemsa 1. Giemsa stock baru boleh diencerkan dengan aquadest, air buffer atau air sesaat akan digunakan agar diperoleh efek pewarnaan yang optimal. 2. Encerkan gimesa sebanyak yang dibutuhkan, sebab bila berlebihan terpaksa harus dibuwang. 3. Untuk mengambil stock giemsa dari botolnya, gunakan pipet khusus agar stock giemsa tidak tercemari. 4. Methanol dapat menarik air dari udara, sebab itu stock giemsa harus ditutup rapat dan tidak bboleh sering dibuka. 5. Tolak ukur sebagai dasar perhitungan : a. 1cc = 20 tetes b. Seluruh permukaan kaca sediaan dapat ditutupi cairan sebanyak 1 cc c. Berdasarkan tolak ukur ini dapat dihitung banyaknya giemsa encer yang harus digunakan sesuai dengan kebutuhan terutama bila melakukan pewarnaan. 6. Takaran pewarnaan, Untuk melakukan pewarnaan individu pada stock giemsa 1 tetes dapat ditambah dengan pengencer sepuluh tetes lama pewarnaan 15 20 menit ( giemsa 10 % ) atau stock giemsa 1 tetes ditambah pengencer 1 cc ( 20 tetes ) dengan lama pewarnaan 45 60 menit ( giemsa 20 % ). 7. Gunakan air pengencer yang mempunyai ph 6.8 7.2 ( paling ideal dengan ph 7.2). ( Depkes RI, 1993 ).
10 Menguji mutu giemsa Apakah stock giemsa yang akan digunakan masih baik, perlu diadakan pengujian. Ada 2 cara menguji mutu Giemsa : 1. Dilakukan pewarnaan sel darah 1-2 sel darah lalu diperiksa mikroskop. Jika hasilnya dengan kriteria yang ada, berarti giemsa dan air pengencernya masih baik. Pengujian seperti ini perlu dilakukan setiap kali akan melakukan pewarnaan. 2. Dilakukan tes menggunakan kertas saring dan metil alkohol a. Meletakkan kertas saring di atas gelas supaya bagian tengah kertas saring tidak tersentuh apapun. b. Meneteskan 1 2 stock giemsa pada kertas saring, menunggu sampai meresap dan melebar, kemudian meneteskan 3 5 tetes metil alkohol absolute dipertengahan bulatan giemsa satu persatu dengan jarak waktu beberapa detik, sampai garis tengah giemsa menjadi 5 7 cm maka akan berbentuk bulatan biru ( metilen blue ) di tengah, lingkaran cincin ungu ( metilen azure ) berada di luarnya, serta lingkaran tipis warna merah ( eosin ) dipinggir sekali. Jika warna ungu atau merah tidak terbentuk berarti giemsa sudah rusak dan tidak boleh dipakai lagi. ( Depkes RI, 1993 ). C. Pewarnaan Sediaan Darah Sediaan darah tebal biasanya di hemolisis terlebih dulu sebelum pewarnaan, sehingga parasit tidak lagi tampak dalam eritrosit. Kelebihan dari
11 sediaan ini yaitu dapat menemukan parasit lebih cepat karena volume darah yang digunakan lebih banyak. Jumlah parasit lebih banyak dalam satu lapang pandang, sehingga pada infeksi ringan lebih mudah ditemukan. Sedangkan kelemahan dari sediaan darah tebal bentuk parasit yang kurang lengkap morfologinya. (Safar, 2009) a. Ciri-ciri sediaan yang baik : Sediaan yang dibuat harus bersih yaitu sediaan tanpa endapan zat pewarnaan. Sediaan juga tidak terlalu tebal, ukuran ketebalan dapat dinilai dengan meletakkan sediaan darah tebal di atas arloji. Bila jarum arloji masih dapat dilihat samar-samar menunjukkan ketebalan yang tepat. Selain menggunakan arloji dapat juga dengan cara meletakkan sediaan darah tebal di atas koran, kalau tulisan di bawah koran sediaan masih terbaca, berarti tetesan tadi cukup baik. (Sandjaja, 2007) b. Hasil sediaan darah tebal yang baik : Inti sel darah putih biru lembayung tua, granula biasanya tidak tampak, hanya granula eosinofil. Trombosit berwarna lembayung muda dan sering berkelompok. Parasit tampak kecil, batas sitoplasma sering tidak nyata. Titik Maurer dan titik Ziemen ( P. malariae) biasanya hilang. Titik Scuffner sering masih terlihat sebagai zona merah. Bentuk cincin sering tampak sebagai koma, tanda seru, atau burung terbang, terutama pada P. falciparum. Tropozoit yang sudah agak besar tampak pigmen. Sitoplasma P. Vivax dapat terlihat jelas seperti amuboid. Sitoplasma pada
12 P. malariae mulai mengumpul disekitar inti, dan bentuk schizon tampak jelas. (Irianto, 2009) c. Parasit yang ada dalam sediaan darah tebal 1. Plasmodium Vivax Ciri khas dari Plasmodium vivax yaitu eritrosit yang dihinggapi membesar, bila tropozoid tumbuh maka bentuknya tidak teratur, berpigmen halus. Tropozoid yang sedang berkembang biak dari Plasmodium vivax berbeda-beda dan tidak beratur bentuknya. Eritrosit yang terinfeksi oleh parasit ini mengalami pembesaran dan pucat karena kekurangan hemoglobin.tropozoit muda tampak sebagai cincin dengan inti pada satu sisi.tropozoit tua tampak sebagai cincin amuboid akibat penebalan sitoplasma yang tidak merata. Dalam waktu 36 jam parasit akan mengisi lebih dari setengah sel eritrosit yang membesar. Proses selanjutnya inti sel parasit akan mengalami pembelahan dan menjadi bentuk schizont yang berisi merozoit berjumlah antara 16 18 buah. Gametosit mengisi hampir seluruh eritrosit. Mikrogametosit berinti besar dalam pewarnaan Giemsa akan berwarna merah muda sedangkan sitoplasma berwarna biru. Makrogametosit berinti padat berwarna merah letaknya biasanya di pinggir.terdapat bintik-bintik merah yang disebut titik Schuffner pada eritrosit yang terinfeksi parasit ini. ( Sungkar S, 1994 )
13 Gambar 1. Plasmodium Vivax (http:/cara.mudah.mengidentifikasi.parasit.malaria.aak.pemda.aceh.html) 2. Plasmodium Malariae Plasmodium malariae ukurannya lebih kecil, berbentuk cincin apabila dicat dengan giemsa mirip cincin Plasmodium vivax hanya sitoplasma lebih biru dan parasit lebih kecil, teratur serta padat. Parasit ini juga dapat berbentuk pita yang melintang pada sel darah merah bentuk kromatin seperti benang ( Sungkar S, 1994 ) Gambar 2. Plasmodium malariae (http:/cara.mudah.mengidentifikasi.parasit.malaria.aak.pemda.aceh.html)
14 3. Plasmodium Falciparum Pasmodium falciparum, dapat menyebabkan penyakit tertian maligna ( malaria tropica ), infeksi oleh spesies ini menyebabkan parasitemia yang meningkat jauh lebih cepat dibandingkan spesies lain dan merozoitnya menginfesi sel darah merah dari segala umur ( baik muda maupun tua ). Hanya ditemukan bentuk tropozoit dan gametosit pada darah tepi, kecuali pada kasus infeksi yang berat. Schizogoni terjadi di dalam kapiler organ dalam termasuk jantung. Sedikit schizont di darah tepi, terkait berat ringannya infeksi. Schizont berisi merozoit berjumlah 16 20 buah. Eritrosit yang terinfeksi tidak mengalami pembesaran. Bisa terjadi multiple infeksi dalam eritrosit (ada lebih dari satu parasit dalam eritrosit), bentuk acolle (inti menempel dinding eritrosit) dan spliting (inti parasit terpecah dua). Gametosit berbentuk pisang, makrogametosit inti kompak (mengumpul) biasanya di tengah sedangkan makrogametosit intinya menyebar. Sitoplasma eritrosit terdapat terdapat bercak-bercak merah yang tidak teratur disebut titik Maurer. Gambar 3. Plasmodium Falciparum (http:/cara.mudah.mengidentifikasi.parasit.malaria.aak.pemda.aceh.html)
15 4. Plasmodium Ovale Plasmodium ovale merupakan parasit yang jarang terdapat pada manusia bentuknya mirip dengan plasmodium vivax sel darah merah yang dihinggapi akan sedikit membesar, bentuknya lonjong dan bergerigi pada satu ujungnya adalah khas plasmodium ovale. Plasmodium ovale menyerupai plasmodium malariae pada bentuk skizon dan tropozoid yang sedang tumbuh. ( Sungkar S, 1994 ) Gambar 4. Plasmodium Ovale (http:/cara.mudah.mengidentifikasi.parasit.malaria.aak.pemda.aceh.html) d. Faktor yang harus diperhatikan untuk mencapai pewarnaan yang baik 1. Kualitas dari stock giemsa yang digunakan standar mutu a) Stock giemsa yang belum tercemar air b) Zat warna giemsa masih aktif 2. Kualitas dari air pengencer giemsa a) Air pengencer harus jernih dan tidak berbau b) Derajat keasaman pengencer hendaknya berada 6,8-7,2 perubahan ph pada larutan giemsa berpengaruh pada sel-sel darah
16 3. Kualitas pembuatan sediaan darah Dalam pembuatan sediaan darah tebal yang perlu diperhatikan adalah tebalnya sediaan. Ketebalan dikatakan memenuhi syarat apabila disetiap lapang pandang terdapat 10 20 sel darah putih. 4. Kebersihan sediaan darah Zat warna yang mengendap dipermukaan pada akhir pewarnaan tertinggal pada sel darah dan akan mengotorinya. Oleh karna itu pada akhir pewarnaan larutan giemsa harus dibilas dengan air yang mengalir. 5. Syarat sediaan Kaca Kaca sediaan dipakai untuk menempelkan darah yang sering kali diambil dari tempat yang jauh, sediaan darah ini kemudian diproses, diperiksa dan kemudiaan disimpan atau dicuci kembali, maka penting sekali penggunaan kaca sediaan yang baik dan bermutu. Syarat untuk kaca sediaan yang baik adalah : a. Bening atau jernih b. Permukaan licin, tidak tergores-gores c. Bersih ( bebas dari lemak, debu, asam, atau alkalis ) d. Tebal antara 1,1 dan 1,3 mm e. Ukurannya sama ( Depkes RI, 1993) e. Prosedur pewarnaan darah tebal : 1) Teteskan darah pada sebuah slide bersih. 2) Tetesan darah dilebarkan sambil dengan kaca secara berputar, sampai menjadi sediaan darah dengan diameter 1-2 cm.
17 3) Biarkan mengering di udara. 4) Pengecatan sediaan darah tebal : - Rendam apusan darah dalam air untuk melisiskan sel darah merah. - Setelah darah lisis rendam atau genangi dengan giemsa selama 15-20 menit. - Biarkan sampai kering, periksa sediaan darah dibawah mikroskop. 5 ) Pemeriksaan darah tebal dilakukan dengan cara : - Siapkan mikroskup yang sudah dibersihkan dengan xylol. - Pasang sediaan dengan perbesaran 100x dengan diberi anisol. - Catat hasil pengamatan. f. Hal-hal yang perlu diperhatikan pada pewarnaan giemsa : - Perhatikan agar metanol tidak mengenai sediaan tetes tebal karena akan membuat bagian tersebut terfiksasi dan hasil pewarnaan tidak sesuai dengan hasil yang diinginkan. - Hati-hati pada saat membilas sediaan tetes tebal karena bagian tersebut tidak difiksasi dan tidak menempel dengan kuat ke slide kaca. (http://cabogun.blogspot.com) D. Sumber Kesalahan Dalam pemeriksaan laboratorium untuk mendapatkan hasil yang akurat harus mengacu kepada GLP ( Good Laboratory Procedure ) yaitu melalui 3 tahap prosedure antara lain: 1. Pre Analitik
18 Dapat dikatakan sebagai tahap persiapan awal, dimana tahap ini sangat menentukan kualitas sampel yang nantinya akan dihasilkan dan mempengaruhi proses kerja berikutnya. Faktor yang dapat mempengaruhi pemeriksaan seperti penyakit, puasa / tidak, diet, variasi diurnal, aktifitas fisik, obat obatan serta labeling. Sampel yang diambil haruslah sampel yang sesuai/tepat dengan jenis pemeriksaannya, cara pengambilan sampel pun harus benar. Penggunaan bahan pembantu yang tidak tepat tentunya akan merusak sampel. Kondisi lingkungan seperti suhu, kebersihan tentunya mempengaruhi stabilitas dan kualitas sampel sehingga dapat berakibat terhadap hasil pemeriksaan. Kualitas bahan pembantu juga mempengaruhi hasil karena jika kualitasnya tidak baik tentunya dapat merusak sampel dan atau menurunkan kualitas yang ada. 2. Analitik adalah tahap pengerjaan pengujian sampel sehingga diperoleh hasil pemeriksaan. Spesimen yang tepat mengenai jenis dan volume sampel, alat sesuai standar, reagen yang berkualitas, standar dan tidak kadaluarsa, giemsa yang digunakan pada proses pewarnaan adalah giemsa yang sesuai standar, penggunaan air sesuai dengan standar, pemeriksaan sesuai suhu, kalkulasi dan pelaporan yang tepat. 3. Pasca Analitik
19 ialah tahap akhir pemeriksaan yang dikeluarkan untuk meyakinkan bahwa hasil pemeriksaan yang dikeluarkan benar benar valid atau benar,meliputi : 1. Pencatatan hasil 2. Pelaporan hasil 3. Pengiriman hasil dari keluarnya hasil pemeriksaan, proses penyalinan hasil sampai diberikan kepada pasien. ( Buletin PRODIA, 2007) E. Kerangka Teori Kerangka teori sebagai berikut : Lama Pewarnaan Kualitas Alat Bantu Pemeriksaan Kualitas Pewarnaan Sediaan Darah Tebal Teknik Pewarnaan dengan Giemsa ph Larutan Pewarnaan
20 F. Kerangka Konsep Kerangka konsep sebagai berikut : Teknik Penggenangan dan Perendaman Kualitas Pewarnaan Sediaan Darah Tebal Variabel bebas Variabel terikat G. Hipotesa : Ada perbedaan kualitas pewarnaan sediaan darah tebal dengan teknik penggenangan dan perendaman.