BAB III METODE PENELITIAN A. Alat dan Bahan 1. Alat Spektrofotometer UV-visibel (Genesys 10), cawan conway dengan penutupnya, pipet ukur, termometer, neraca analitik elektrik C-200D (Inaba Susakusho), botol fermentor, alat-alat gelas, kompor listrik, panci. 2. Bahan Pereaksi-pereaksi jika tidak disebut lain yang dimaksud adalah pereaksi murni (Merck). Bahan-bahan yang digunakan adalah : Ubi jalar varietas putih, kuning, ungu (dari pasar), ragi (cap matahari), akuabidestilata (Wida), iodium, NaOH, piperazina P, asam oksalat, asam fosfat, kalium permanganat, asam asetat, asam sulfat, kalium bikromat, asam kromotropat, larutan besi (III) klorida, etanol absolut, natrium bikarbonat, dinatrium pentasianonitrosilferat (II), silicon grease. B. Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kimia Organik Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto, Laboratorium Biokimia dan Kimia Analisis Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. C. Batasan Variabel Operasional 1. Pengumpulan Sampel Sampel dikumpulkan dari Pasar Sokaraja. 2. Variabel Penelitian Variabel bebas : ubi jalar varietas putih, kuning, ungu Variabel tergantung : kadar etanol yang dihasilkan Variabel terkendali : larutan baku etanol, pelarut, metode penelitian, lama fermentasi, dan konsentrasi ragi yang ditambahkan. 3. Pengumpulan Data Data diperoleh dari artikel ilmiah, buku teks, internet yang mendukung judul, dan data hasil penelitian di laboratorium.
D. Caraa Kerja 1. Determinasi Determinasi dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Fakultas Biologi Univeritas Jenderal Soedirman Purwokerto. 2. Preparasi sampel Masing-masing 250 g ubi dikupas, dicuci bersih dengan air, diparut. Ditambahkan air 1200 ml, dimasak sampai matang, didinginkan. Ditambahkan ragi 5% dari bobot sampel. 3. Proses Fermentasi Sampel yang telah dipreparasi difermentasi selama 5 hari dalam botol fermentor. Setelah 5 hari, ambil cairan hasil fermentasi untuk diuji kualitatif dan kuantitatif. Gambar 5. Botol fermentor (Yap,1989). Keterangan : 1. Botol fermentor 2. Sampel yang difermentasi 3. Tutup botol fermentor yang diikat dengan Sampagne Knop 4. Selang pembuangan gas CO 5. Botol yang berisi air untuk mencegah masuknya O 2 O 2 4. Uji Kualitatif Cairan hasil fermentasi yang diperoleh dilakukan uji kualitatif terhadap ada tidaknya : a. Etanol 1) Pada 5 ml larutan (1 dalam 10) tambahkan 1 ml NaOH 1N dan perlahan-lahan (setelah 3 menit) tambahkan 2 ml iodium 0,1N, timbul bau iodoform dan
terbentuk endapan kuning dalam waktu 30 menit jika terdapat etanol dan aseton (Reaksi Iodoform). 2) Campur 5 tetes dalam gelas piala dengan 1 ml larutan kalium permanganat P (1 dalam 10) 5 tetes asam sulfat 2N, tutup gelas piala dengan kertas saring yang dibasahi dengan larutan segar 100 mg natrium nitroferisianida P dan 250 mg piperazina P dalam 5 ml air, terjadi warna biru intensif pada kertas saring, warna akan memucat setelah beberapa menit (Anonim, 1995). b. Aseton Lima ml cairan sampel ditambahkan 1 ml larutan dinatrium pentasianonitrosilferat (II) 2,5% dan 0,5 ml NaOH 3N. Jika reaksi positif, maka akan terbentuk warna merah coklat. Setelah diasamkan dengan CH 3 COOH 6N warna tersebut menjadi ungu (percobaan legal) (Yap, 1989). c. Metanol Sejumlah 0,2 ml larutan sampel direaksikan dengan 5 ml larutan kalium permanganat 1% dan 0,5 ml asam fosfat, 15 menit kemudian ditambahkan 2 ml larutan asam oksalat 5% dalam asam sulfat 50%. Sesudah ditambahkan asam kromotropat, jika ada metanol maka akan terbentuk warna merah (Anonim, 1995). d. Asam asetat 1) Campuran 1 ml sampel dan 5 ml NaOH 3N direaksikan dengan 1 ml larutan besi (III) klorida 10%. Jika positif ada asam asetat, maka akan terbentuk warna merah (Yap, 1989). 2) 1 ml larutan sampel dipanaskan bersama 1 ml etanol 96% dan 1 ml asam sulfat pekat. Jika ada asam asetat dalam sampel tersebut maka akan tercium bau etil asetat (Yap, 1989). e. Asetaldehid 1) Sampel diteteskan pada spot plate kemudian ditambahkan setetes larutan dinatrium pentasianonitrosilferat (II) 2,5%. Jika dalam sampel ada asetaldehid maka timbul warna biru pada campuran (Yap, 1989). 2) Sampel dilarutkan dalam air, diasamkan dengan HCl 3N, ditambahkan asam kromatropat dengan volume sama banyak. Setelah beberapa waktu, jika ada asetaldehid maka akan terbentuk warna ungu sampai merah (Yap, 1989).
5. Pembuatan Pereaksi a. Pembuatan Larutan Standar Sebanyak 0,5 g etanol absolut ditambah dengan akuabidestilata sampai volume 100 ml. Didapatkan konsentrasi larutan standar etanol 0,5 g/dl (Widia, 2001). b. Pembuatan Larutan Dikromat Asam Sebanyak 4,26 g kalium bikromat ditambah dengan akuabidestilata sampai 100 ml, kemudian tambahkan 500 ml asam sulfat pekat lambat-lambat sampai dingin (Widia, 2001). c. Pembuatan Larutan Na 2 CO 3 20% Sebanyak 20 g natrium bikarbonat dilarutkan dengan akuabidestilata sampai 100 ml (Widia, 2001). 6. Optimasi Panjang Gelombang Optimasi panjang gelombang dimaksudkan untuk menentukan panjang gelombang maksimal sampel sehingga sampel bisa memberikan serapan yang maksimal pula. Optimasi panjang gelombang dilakukan pada daerah visibel, yaitu antara 400-800 nm. 1 ml dikromat asam dimasukkan ke dalam labu takar 10 ml, ditambah dengan akuabidestilata. Dibaca serapannya dengan Spektrofotometer Ultraviolet Visibel. 7. Penentuan Operating Time Operating time dimaksudkan untuk menentukan lamanya waktu sampel bereaksi dengan pereaksi sehingga didapatkan serapan yang konstan. 1 sampel larutan dibaca serapannya di spektrofotometer UV pada panjang gelombang yang sudah didapatkan pada optimasi. 3 ml dikromat asam dimasukkan di bagian tengah cawan conway. Sebanyak 0,5 ml larutan standar (konsentrasi 0,5g/dL) dan 1 ml larutan Na 2 CO 3 20% dipipetkan bersebelahan pada bagian (lingkaran) luar cawan conway. Cawan conway ditutup dengan penutupnya yang telah diberi silicon grease, dikeram pada 90 C selama 20 menit. Larutan dikromat asam yang terdapat di bagian cawan diambil kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml. Dibilas tempat tadi sebanyak 2x dengan akuabidestilata kemudian hasil bilasan
dimasukkan ke dalam labu takar, diencerkan sampai 25 ml. Dibaca serapannya dengan Spektrofotometer Ultraviolet Visibel pada λ maksimal dengan variasi waktu 5, 10, 15, 20, dan 25 menit. 8. Pembuktian Hukum Lambert Beer Sejumlah seri konsentrasi larutan baku 0,1g/dL; 0,2g/dL; 0,4g/dL; 0,6g/dL; dan 0,9g/dL masing-masing dibaca serapannya pada λ maksimal, didapatkan kurva hubungan konsentrasi larutan sampel dengan absorbansi. Larutan baku dibuat dengan cara menimbang 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; dan 0,9 g etanol absolut dalam botol timbang kemudian ditambah dengan akuabidestilata sampai volume 100 ml. Kurva tersebut digunakan untuk membuktikan apakah absorbansi sampel yang diperoleh mengikuti hukum Lambert-Beer. 3 ml dikromat asam dimasukkan di bagian tengah cawan conway. Masing-masing sebanyak 0,5 ml larutan dari masing-masing konsentrasi dan 1 ml larutan Na 2 CO 3 20% dipipetkan bersebelahan pada bagian (lingkaran) luar cawan conway. Cawan conway ditutup dengan penutupnya yang telah diberi silicon grease, dikeram pada 90 C selama 20 menit. Larutan dikromat asam yang terdapat di bagian cawan diambil kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml. Dibilas tempat tadi sebanyak 2x dengan akuabidestilata kemudian hasil bilasan dimasukkan ke dalam labu takar, diencerkan sampai 25 ml. Dibaca serapannya dengan Spektrofotometer Ultraviolet Visibel pada λ maksimal. 9. Validasi Metode Spektrofotometri Ultraviolet-Visibel a. Penentuan Akurasi Sejumlah larutan standar dengan masing-masing konsentrasi yang telah dibuat pada kurva baku dibaca serapannya pada λ maksimal. Kadar dihitung dari persamaan regresi linear dari kurva baku. Akurasi dilakukan dengan metode duplo. 3 ml dikromat asam dimasukkan di bagian tengah cawan conway. Satu sampel cairan hasil fermentasi diambil untuk tiga replikasi kemudian masing-masing replikasi dibagi dua dengan volume yang sama. Tiga sampel (masing-masing 0,3 ml) ditambah dengan 0,2 ml larutan standar 0,5g/dL sedangkan sampel lainnya tidak ditambah dengan
larutan standar. 1 ml larutan Na 2 CO 3 20% dipipetkan bersebelahan pada bagian (lingkaran) luar cawan conway. Cawan conway ditutup dengan penutupnya yang telah diberi silicon grease, dikeram pada 90 C selama 20 menit. Larutan dikromat asam yang terdapat di bagian cawan diambil kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml. Dibilas tempat tadi sebanyak 2x dengan akuabidestilata kemudian hasil bilasan dimasukkan ke dalam labu takar, diencerkan sampai 25 ml. Dibaca serapannya dengan Spektrofotometer Ultraviolet Visibel pada λ maksimal. Recovery b. Penentuan Presisi Sejumlah larutan sampel pada suatu seri konsentrasi diukur serapannya pada λ maksimal. Kadar dihitung dari persamaan regresi linear. replikasi 6x. 3 ml dikromat asam dimasukkan di bagian tengah cawan conway. Sebanyak 0,5 ml larutan standar (konsentrasi 0,1 g/dl) dan 1 ml larutan Na 2 2CO 3 20% dipipetkan bersebelahan pada bagian (lingkaran) luar cawan conway. Cawan conway ditutup dengan penutupnya yang telah diberi silikon grease, dikeram pada 90 C selama 20 menit. Larutan dikromat asam yang terdapat di bagian cawan diambil kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml. Dibilas tempatt tadi sebanyak 2x dengan akuabidestilata kemudian hasil bilasan dimasukkan ke dalam labu takar, diencerkan sampai 25 ml. Dibaca serapannyaa dengan Spektrofotometer Ultraviolet Visibel pada λ maksimal. Replikasi 6 kali. c. Penentuann Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Batas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linear dari kurva kalibrasi. Nilaii pengukurann akan sama dengan b pada persamaan garis linear y = a + bx, sedangkan simpangan baku blanko sama dengan simpangan baku residual (Sy/x). 3 ml dikromat asam dimasukkan di bagian tengah cawan conway. Sebanyak 0,5 ml dari masing-masing seri konsentrasi larutan baku dan 1
ml larutan Na 2 CO 3 20% dipipetkan bersebelahan pada bagian (lingkaran) luar cawan conway. Cawan conway ditutup dengan penutupnya yang telah diberi silikon grease, dikeram pada 90 C selama 20 menit. Larutan dikromat asam yang terdapat di bagian cawan diambil kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml. Dibilas tempat tadi sebanyak 2x dengan akuabidestilata kemudian hasil bilasan dimasukkan ke dalam labu takar, diencerkan sampai 25 ml. Dibaca serapannya dengan Spektrofotometer Ultraviolet Visibel pada λ maksimal. Batas deteksi (LOD) Batas quantitasi (LOQ) Sy/x 10 Sy/x Sy/x = simpangan baku respon analitik dari blanko Sl = arah garis linear (kepekaan arah kurva) dari kurva antara respon terhadap konsentrasi = slope (b dari persamaan garis linear). (Harmita, 2004). 10. Uji Kuantitatif Cairan hasil fermentasi yang terbentuk ditentukan kadar etanolnya. Etanol ini kemudian ditetapkan kadarnya dengan metode Spektrofotometri Ultraviolet Visibel pada λ maksimal dengan pereaksi K 2 Cr 2 O 7. Disediakan 5 cawan conway dengan penutupnya, diisi di bagian tengahnya dengan 3 ml larutan dikromat asam. Sebanyak 0,5 ml larutan yang diperiksa atau 0,5 ml larutan standar dan 1 ml larutan Na 2 CO 3 20% dipipetkan bersebelahan pada bagian (lingkaran) luar cawan conway. Cawan conway ditutup dengan penutupnya yang telah diberi silikon grease, dikeram pada 90 C selama 20 menit. Larutan dikromat asam yang terdapat di bagian cawan diambil kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml. Dibilas tempat tadi sebanyak 2x dengan akuabidestilata kemudian hasil bilasan dimasukkan ke dalam labu takar, diencerkan sampai 25 ml. Sebagai blanko, 3 ml larutan dikromat asam diencerkan dengan akuabidestilata sampai 25 ml. Dibaca serapannya dengan Spektrofotometer Ultraviolet Visibel pada λ maksimal. (Widia, 2001)
Standar Uji Dikromat asam 0,5 ml standar 0,5 ml larutan yang diperiksa 1 ml Na2CO3 20% 1 ml Na2CO3 20% Gambar 6. Cawan Conway (Widia, 2001). 11. Analisis Hasil Untuk melihat ada tidaknya perbedaan kadar etanol yang dihasilkan, maka dilakukan analisis variansi satu arah dengan taraf kepercayaan 95%. Jika terdapat perbedaan kadar etanol (F hitung > F tabel) maka dilakukan uji BNT (Beda Nyata Terkecil). Analisis hasil dilakukan dengan metode SPSS.