BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Mycobacterium tuberculosis adalah bakteri patogen penyebab tuberkulosis. Secara umum penyebaran bakteri ini melalui inhalasi, yaitu udara yang tercemar oleh penderita yang terinfeksi, terhirup oleh orang yang tidak terinfeksi. Pada tahun 2007, beberapa negara dengan prevalensi tertinggi, dari dua juta kasus adalah Cina (1,3 juta), Indonesia (530.000), Nigeria (460.000), dan Afrika Selatan (460.000) (Donald dan van Helden, 2009.). Masalah besar yang timbul saat ini pada penderita tuberkulosis adalah terjadinya resistensi terhadap beberapa Obat Anti Tuberculosis (OAT). Badan kesehatan dunia (World Health Organization ;WHO) bahkan telah mendefinisikan adanya multi-drug resistant M. tuberculosis (MDR-TB) yaitu jenis M. tuberculosis yang resisten terhadap pengobatan standar enam bulan dengan OAT lini pertama dalam suatu regimen kombinasi obat. Biasanya resistensi setidaknya terhadap rifampisin dan Isoniazid (INH), sudah dikategorikan sebagai kejadian MDR-TB (Thomas, 2008). Laporan tentang resistensi OAT di dunia berdasarkan informasi yang dikumpulkan WHO antara tahun 2002-2006 pada 90.000 pasien di 81 negara, menyatakan bahwa saat ini tidak hanya terjadi MDR tetapi juga fenomena yang disebut extensively drug-resistant tuberculosis (XDR-TB). XDR-TB adalah suatu bentuk TB yang disebabkan oleh resistensi bakteri terhadap hampir semua OAT yang efektif (misalnya MDR-TB dengan tambahan resistensi terhadap golongan 1
2 fluoroquinolon dan salah satu dari OAT injeksi lini kedua seperti amikacin, kanamycin atau capreomycin). Fenomena ini oleh WHO telah tercatat terjadi di 45 negara (Thomas, 2008). Berdasarkan analisis data hasil survey, WHO memperkirakan terdapat hampir setengah juta kasus MDR-TB baru, kira-kira 5 % dari 9.000.000 kasus TB, di seluruh dunia setiap tahunnya. Angka tertinggi tercatat di Baku, ibukota Azerbaijan, di mana hampir seperempat dari seluruh kasus TB baru (22,3 %) dilaporkan mengalami MDR. Proporsi MDR-TB di antara kasus TB baru dunia adalah 19,4% di Moldova,16% di Donetsk, Ukraina, 15% di Tomsk Oblast, Federasi Rusia, dan 14,8% di Tashkent, Uzbekistan. Angka ini menunjukkan tingkat-tingkat tertinggi dari resistensi OAT yang disebarluaskan oleh WHO tahun 2004. Beberapa penelitian di Cina juga menyebutkan bahwa kejadian MDR- TB sudah menyebar di negara tersebut (Thomas, 2008). Analisis pada ±500 strain M. tuberculosis dari berbagai penjuru dunia menemukan bahwa 96% isolat yang resisten Rifampisin (RMP) memiliki mutasi di segmen 81-bp gen rpob, suatu house-keeping gene yang menyandi sub-unitbeta dari RNA polimerase dan mampu menghalangi hibridisasi nukleotida pertama untuk mengaktifkan polymerase sehingga menghalangi sintesis mrna. Mutasi ini tidak ditemukan pada organisme yang rentan (susceptible). Sebagian besar mutasi missense penyebab resistensi RMP terjadi pada kodon 513, 526, atau 531 dari gen rpob, dan sebagian kecil pada posisi 514 atau 533. Diperkirakan 90% isolat resisten RMP juga resisten terhadap isoniazid, sehingga resistensi terhadap RMP dianggap mewakili (surrogate) terjadinya MDR (Rosilawati,2007 ; Syaifudin,2007).
3 Terjadinya mutasi pada suatu gen, akan menyebabkan terekspresinya protein mutan yang berbeda dengan wild type. Pengetahuan tentang ekspresi protein mutan, penting untuk diketahui berkaitan dengan fungsi protein terutama sebagai enzim dan pengembangan pemanfaatan protein tersebut. Apabila mutasi terjadi pada situs aktif enzim, maka protein tersebut tidak akan dapat berfungsi sebagaimana mestinya dan merugikan patogen. Dengan menggunakan teknik Deoxyribonucleic Acid (DNA) rekombinan, protein yang terekspresi dapat dipelajari dan dimanfaatkan untuk berbagai keperluan, di antaranya untuk produksi enzim, pembuatan vaksin, dan imunoassay (Whitford,2005). Analisis proteomik terhadap M.tuberculosis dimulai dengan diproduksinya tuberkulin sebagai reagen diagnostik dan penambahan komponen protein untuk mendapatkan protein murni. Penelitian-penelitian berikutnya, sebagian besar dilakukan untuk mengidentifikasi protein-protein antigen M.tuberculosis (Belisi et.al., 2005). Hingga saat ini analisis protein yang berfungsi secara fisiologik telah banyak dilakukan, akan tetapi belum banyak yang mempelajari protein yang terekspresi pada patogen yang resisten. Oleh karenanya, penelitian terhadap ekspresi protein dari gen M.tuberculosis yang bertanggung jawab terhadap resisten rifampisin, yaitu protein RpoB, menjadi menarik dan penting untuk dilakukan. Hal tersebut dilakukan dengan cara merekombinasi gen resisten ke dalam plasmid vektor ekspresi dan ditransformasi ke dalam sel kompeten agar protein dapat diproduksi. Analisis terhadap asam aminonya akan memberi informasi proteomik yang bermanfaat. Analisis asam amino dapat pula diprediksi dari urutan nukleotida.
4 Proses rekombinasi DNA antara gen sisipan dengan plasmid merupakan tahapan yang relatif sulit. Kesulitan yang paling sering terjadi, berkaitan dengan sekuen gen asing yang harus diinsersi, dan adanya keterbatasan dari sel inang yang digunakan untuk sintesis protein (Brown, 1999; Brown, 2004). Rekonstruksi plasmid merupakan salah satu teknologi DNA rekombinan yang banyak digunakan untuk mempelajari gen dan hasil ekspresinya. Berbagai gen dapat dipelajari dengan menggunakan teknik ini, salah satunya yaitu gen yang bertanggung jawab terhadap terjadinya resistensi pada patogen. Terdapat berbagai macam sistem plasmid yang dapat digunakan untuk melakukan rekombinasi DNA. Sistem plasmid pet merupakan sistem plasmid yang banyak digunakan untuk keperluan kloning maupun sebagai vektor ekspresi. Secara umum, vektor pet adalah plasmid bakteri yang didesain agar produksi protein yang diinginkan berlangsung cepat, ketika sistem ini diaktivasi. Plasmid ini mengandung beberapa elemen penting, yaitu gen laci yang mengkode protein represor lac, promoter T7 yang hanya spesifik untuk T7 RNA polymerase (bukan RNA polymerase bakteri) dan juga tidak terjadi di sembarang tempat pada genom prokaryot, operator lac yang dapat menghalangi transkripsi, sebuah polylinker, f1 origin of replication (sehingga suatu plasmid untai tunggal dapat diproduksi ketika diinfeksi dengan M13 helper phage), dan gen resisten antibiotika sebagai marka (Blaber, 1998). Sistem plasmid pet-28a merupakan salah satu dari kelompok vektor pet yang telah mengalami berbagai modifikasi untuk mempermudah teknologi rekombinan DNA. Beberapa modifikasi yang dilakukan untuk sistem pet-28a
5 adalah, adanya multiple cloning site (MCS) dengan pilihan situs restriksi yang lebih beragam menggantikan polylinker, digantinya marka resistensi ampisilin dengan kanamisin, sehingga seleksi dapat lebih spesifik, serta adanya penanda His untuk keperluan purifikasi protein. Sebagai vektor kloning, sistem pet-28a mampu menggandakan dirinya hingga 40 copy pada sel kompeten yang sesuai (Novagen, 2003). Pada penelitian ini akan dilakukan rekonstruksi plasmid pet 28-a, dengan menginsersikan fragmen gen pada daerah MCS dan memilih dua situs pengenal enzim restriksi yang berbeda untuk ketepatan insersi. Rekonstruksi plasmid dilakukan untuk mempelajari mutasi yang terjadi pada urutan nukleotida dari fragmen gen rpob dari M.Tuberculosis yang resisten rifampisin, dengan cara mengeksplorasi perbedaan asam amino yang menyusun protein mutan tersebut dengan wild type. Urutan nukleotida dan prediksi urutan asam amino dari M.tuberculosis wild type diunduh dari data base yang ada pada URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Perbandingan homologinya akan menunjukkan kesesuaian antara sekuen nukleotida mutan dengan wild type. 1.2 RumusanMasalah Dari latar belakang tersebut di atas, maka dapat disusun beberapa rumusan masalah sebagai berikut: 1. Apakah gen mutan rpob isolat Multi Drug Resistance M.tuberculosis dapat diinsersikan ke dalam sistem plasmid pet-28-a?
6 2. Apakah terdapat perbedaan sekuen asam amino prediktif dari gen mutan rpob Multi Drug Resistance M.tuberculosis dengan urutan asam amino protein wild type? 1.3 TujuanPenelitian A. TujuanUmum Secara umum penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi vektor yang mengandung gen rpob yang resisten terhadap rifampisin, mengetahui informasi genetik prediktif pada tingkat protein serta mekanisme resistensi obat anti tuberculosis (OAT) lini pertama pada M.tuberculosis. B. TujuanKhusus Penelitian ini bertujuan untuk : 1. Menginsersikan gen mutan rpob dari Multi-drug resistance M.tuberculosis ke dalam plasmid vektor kloning, yaitu sistem pet 28-a 2. Mengetahui mutasi yang terjadi gen rpob Multi-drug resistance M.tuberculosis dengan membandingkan sekuen prediktif asam aminonya dengan data base wild type 1.4 Manfaat penelitian A. Manfaat keilmuan Penelitian ini diharapkan memiliki manfaat sebagai berikut : 1. Menambah khazanah ilmu pengetahuan tentang mekanisme terjadinya resistensi terhadap Rifampisin oleh adanya mutasi gen rpob pada isolate Multi drug resistance M.tuberculosis.
7 2. Menambah wawasan keilmuan tentang sekuen gen rpob M.tuberculosis yang resisten terhadap Rifampisin.sebagai marka MDR-TB B. Manfaat praktis Secara praktis hasil rekonstruksi plasmid dari penelitian ini akan dapat digunakan untuk penelitian-penelitian bioteknologi lain yang ingin menggunakan marka resistensi terhadap Rifampisin. Selain hal tersebut, enzim yang dihasilkan dapat dipergunakan untuk keperluan mempelajari aktivitas enzim di laboratorium.