14 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian serta di Rumah Kaca University Farm, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilakukan pada bulan Desember 2011 sampai bulan Juli 2012. Pembiakan dan Pemeliharaan Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) Isolat PGPR yang digunakan adalah P. fluorescens RH4003 (P1), B. substilis AB89 (B12), dan F8yang diremajakan pada media King s B Agar. Mulanya isolat diremajakan sebelumnya terlebih dahulu pada medianutrient Agar (NA) dengan metode penggoresan kuadran kemudian dipindahkan pada media King s B Agar dengan metode penggoresan merata. Tujuan pembiakan dan pemeliharaan tiga jenis bakteri rizosfer ini adalah sebagai bahan dasar pada uji pemacuan pertumbuhan dan penghambatan busuk pangkal batang padaa kedelai. a b c Gambar 4 Biakan murni dan bentuk koloni (a) P. fluorescens RH4003, (b) B. subtilis AB89, dan (c) F8 pada media King s B Agar Isolat yang diremajakan pada media NA dengan metode penggoresan kuadrankemudian diinkubasi selama 24 sampai 48 jam. Koloni tunggal bakteri diambil dengan menggunakan jarum isolasi kemudian digores secara merata pada media King s B (Gambar 4).Masing-masing biakan bakteri yang tumbuh setelah
15 diinkubasi selama 12 jam sampai 24 jam pada media King s B kemudian dipindahkan kedalam media Nutrient Broth (NB).Permukaan media King s B yang telah ditumbuhi dengan koloni bakterikemudian dimasukkan 5 ml air steril. King s B yang telah bercampur dengan air steril di-scrub hingga koloni bakteri pada permukaan media terpisah dengan agar dan larut dalam air steril sehingga membentuk suspensi. Suspensi diambil 1 ml kemudian dimasukkan ke dalam 250 ml NB dan diinkubasi pada inkubator bergoyang selama 24 sampai 72 jam. Persiapan ini dilakukan untuk pengujian pemacuan pertumbuhan. Pengujian penghambatan busuk pangkal batang membutuhkan volume suspensi yang lebih sedikit dibandingkan dengan pengujian sebelumnya, yaitu hanya 100 ml NB. Volume suspensi bakteri yang digunakan lebih sedikit karena jumlah perlakuan yang akan dilakukan pada pengujian penghambatan penyakit busuk pangkal batang juga lebih sedikit dibandingkan dengan pengujian sebelumnya.artinya adalah perlakuan pada pengujiaan penghambatan penyakit busuk pangkal batang merupakan perlakuan dengan hasil terbaik berdasarkan pengujian pemacuan pertumbuhan. Oleh karena itu, persiapan suspensi bakteri untuk masing-masing pengujian dilakukan pada waktu yang tidak bersamaan. Pembiakan dan Pemeliharaan Sclerotiumrolfsii BiakanS. rolfsiiyang digunakan adalah koleksi Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman.S. rolfsii diremajakan pada media Potato Dextrose Agar (PDA). Sklerotia yang berasal dari biakan tersebut diambil dengan menggunakan pinset yang telah disterilkan dengan alkohol 70%, kemudian diletakkan di atas permukaan media PDA. Metode peletakan sklerotia ini dilakukan dengan meletakkan satu sklerotia per cawan atau dua sampai tiga sklerotia per cawan. Selain dengan menggunakan sklerotia, miselium yang tumbuh dari biakan terdahulu juga dapat dimanfaatkan. Miselium cendawan dan media agar yang berada di bawahnya diambil dengan jarum isolasi dan diletakkan di permukaan media PDA. Inkubasi selama 4-5 hari sampai miselium tumbuh dan memenuhi permukaan cawan. Jumlah biakan yang digunakan dalam uji antagonisme adalah 40 cawan, maka peremajaanya di lakukan secara bertahap.
16 a b Gambar 5Morfologi cendawan S. rolfsii,(a) sklerotia tumbuh membentuk miseliumdan miselium tumbuh hampir menutupi permukaan cawan, (b) sklerotia sebagai alat pemencarann dan pertahanan diri Uji Pemacuan Pertumbuhan Persiapan Media Tanam Media tanam yang digunakan adalah tanah steril dan pupuk kandang dengan perbandingan 1:1. Tanah disterilkan terlebih dahulu untuk mencegah patogen yang dapat menyerang benih kedelai yang akan ditanam. Media tanam tersebut dimasukkan ke dalam polybag ukuran 25 cm x 25 cm.persiapan media tanam dilakukan pada minggu ke-4 bulan Desember 2011. Penanaman dilakukan pada 31 Desember 2011 di Rumah Kaca, University Farm. Perendaman Benih Benih kedelai yang digunakan adalah varietas Anjasmoro. Varietas ini umumnya banyak digunakan oleh petani dan juga cocok ditanami pada lahan di lingkungan kampus IPB.Pemilihan benih yang sehat dan tidak cacat dilakukan terlebih dahulu.benih juga harus dalam keadaan yang kering.perendaman dilakukan dengan cara memasukkan benih yang telah dibungkus dengan kain perca ke dalam masing-masing suspensi isolat bakteri (P1, B12, F8) 250 ml NB (Gambar 6) ). Perlakuan ditambah dengan memasukkan benih kedelai juga ke dalam 250 ml air steril sebagai perlakuan perendaman tanpa aplikasi PGPR, namun perlakuan ini tidak disebut sebagai kontrol. Perlakuan kontrol adalah perlakuan baik tanpa perendaman maupun tanpa aplikasi PGPR, artinya adalah benih langsung ditanam pada media tanam. Benih perlu dibungkus dengan kain
17 perca karena di dalam suspensi bakteri akan dimasukkan berbagai perlakuan perendaman dalam kurun waktu yang berbeda-beda.perendaman benih dilakukan selama 5, 10, 15, dan 20 jam. Perendaman pertama yang dilakukan adalah perendaman 20 jam, benih dimasukkan kedalam suspensi bakteri dan air steril dimulai pada pukul 11.00. Perendaman kedua adalah 15 jam dan benih dimasukkan pada pukul 16.00. Perendaman selanjutnya adalah 10 jam dan benih dimasukkan pada pukul 21.00. Perendaman yang terakhir adalah 5 jam dan benih dimasukkan pada pukul 02.00. Perendaman benih dalam perlakuan 4 waktu yang berbeda tersebut selesai tepat pada pukul 07.00 dan benih siap ditanam. Perlakuan pada uji pemacuan pertumbuhan adalah 17 dengan 3 kali ulangan dan menggunakan 5 unit benih kedelai dalam setiap perlakuannya. Perlakuanperlakuan tersebut yaitu: P1 5 = Benih kedelai dengan aplikasi P. fluorescens RH4003 melalui perendaman 5 jam P1 10 = Benih kedelai dengan aplikasi P. fluorescens RH4003 melalui perendaman 10 jam P1 15 = Benih kedelai dengan aplikasi P. fluorescens RH4003 melalui perendaman 15 jam P1 20 = Benih kedelai dengan aplikasi P. fluorescens RH4003 melalui perendaman 20 jam B12 5 = Benih kedelai dengan aplikasi B. subtilis AB89 melalui perendaman 5 jam B12 10 = Benih kedelai dengan aplikasi B. subtilis AB89 melalui perendaman 10 jam B12 15 =Benih kedelai dengan aplikasi B. subtilis AB89 melalui perendaman 15 jam B12 20 = Benih kedelai dengan aplikasi B. subtilis AB89 melalui perendaman 20 jam F8 5 = Benih kedelai dengan aplikasi F8 melalui perendaman 5 jam F8 10 =Benih kedelai dengan aplikasi F8 melalui perendaman 10 jam F8 15 = Benih kedelai dengan aplikasi F8 melalui perendaman 15 jam F8 20 = Benih kedelai dengan aplikasi F8 melalui perendaman 20 jam
18 A 5 = Benih kedelai melalui perendaman 5 jam tanpa aplikasi PGPR A10 = Benih kedelai melalui perendaman 10 jam tanpa aplikasi PGPR A 15 = Benih kedelai melalui perendaman 15 jam tanpa aplikasi PGPR A 20 = Benih kedelai melalui perendaman 20 jam tanpa aplikasi PGPR Kontrol = Benih kedelai tanpa aplikasi PGPR dan perendaman a b Gambar 6Persiapan perendamanbenih pada uji pemacuan pertumbuhan, (a) benih kedelai dibungkus kain perca dan diberi labelwaktu perendaman dan (b)benih kedelai akan dimasukkan ke dalam suspensi bakteri dan air Pemeliharaan Tanaman Pemeliharaan dilakukan dengan menyiram tanaman kedelai secara teratur dan membersihkan sekitar pertanaman dari serangan gulma. Gulma yang tidak dibersihkan akan tumbuh sebagai tanaman yang tidak diinginkan dan bersaing dengan kedelai dalam memperoleh nutrisi dari dalam tanah.penyiraman dilakukan setiap 2hari sekali. Penyiraman dilakukan pada pagi hari. Tanaman kedelai yang telah berumur 2 minggu setelah tanam (MST) dipasangi ajir agar dapat berdiri tegak. Kedelai yang ditanam tersebut tidak memerlukan penyiangan karena penanaman dilakukan di dalam rumah kaca. Peubah yang Diamati Uji pemacuan pertumbuhan dilakukan untuk mengamati laju pertambahan tinggi tanaman kedelai dan interaksi antara jenis PGPR dengan waktu perendaman yang dilakukan selama 7 minggu setelah tanam (MST).Peubah yang diamati
adalah laju pertambahan tinggi tanaman, nilai total laju pertambahan tinggi tanaman (AUHPGC), bobot basah akar, bobot kering akar, dan bobot kering tajuk. 19 Pengukuran Tinggi Tanaman Tinggi tanaman diukur setiap empat hari sekali. Pengukuran tinggi tanaman pertama dilakukan pada 4 Januari 2012 dan pengukuran terakhir dilakukan pada 25 Februari 2012. Data tinggi tanaman yang diperoleh kemudian digunakan dalam penghitungan nilai Area Under Height of Plant Growth Curve (AUHPGC).AUHPGC adalah total laju pertumbuhan tanaman. Nilai AUHPGC dapat dihitung menggunakan rumus yang dinyatakan oleh Van der Plank (1963 dalamcooke1998) sebagai berikut: Keterangan: AUHPGC = Area Under Height of Plant Growth Curve(cm hari) Yi+t = Data pengamatan ke-i+1 ti+1 = Waktu pengamatan ke-i+1 Yi = Data pengamatan ke-1 ti = Waktu pengamatan ke-1 Penghitungan Bobot Basah dan Kering Tanaman Bobot yang dihitung dalam uji pemacuan pertumbuhan ini adalah bobot basah akar, bobot kering akar, dan bobot kering tajuk. Tanaman kedelai berumur 7MST yang telah dipanen kemudian dipisahkan bagian akar dan tajuknya. Akar ditimbang untuk memperoleh data bobotbasah akar. Akar yang telah ditimbang tersebut beserta tajuk kemudian dijemur selama 2 minggu dan dimasukkan dalam oven 24 sampai 48 jam. Pengeringan di dalam oven bertujuan untuk memperoleh bobot kering akar dan tajuk yang konstan.
20 Uji Penghambatan Penyakit Busuk Pangkal Batang Persiapan Media Tanam Media tanam yang digunakan adalah tanah steril dan pupuk kandang dengan perbandingan 1:1. Tanah disterilkan terlebih dahulu untuk mencegah patogen lain yang dapat menyerang benih kedelai yang akan ditanam. Media tanam tersebut dimasukkan ke dalam polybag ukuran 25 cm x 25 cm. Media tanam dalam polybagdibagi menjadi 3 bagian. Bagian bawah adalah tanah steril non patogen, bagian tengah adalah tanah steril dengan infestasi patogen S. rolfsii, dan ditutupi bagian atas oleh tanah steril non patogen seperti bagian bawah.jumlah biakan S. rolfsiiyang diinfestasi pada media tanam bagian tengah adalah 40 cawan. Setiap biakan cendawan dapat digunakan untuk infestasi ke dalam 3 polybag. Persiapan media tanam dilakukan pada minggu ke-4 bulan Mei 2012. Penanaman dilakukan pada 9 Juni2012 di Rumah Kaca, University Farm. Perendaman Benih Benih kedelai yang digunakan adalah varietas Anjasmoro, yaitu varietas yang sama seperti pada pengujian pemacuan pertumbuhan.perendaman dilakukan dengan cara memasukkan benih yang telah dibungkus dengan kain perca ke dalam suspensi bakteri 100 ml NB (Gambar 7). Perendaman benih di dalam air steril tidak dilakukan pada uji penghambatan penyakit.berdasarkan hasil uji pemacuan, pertumbuhan kedelai pada perlakuan perendaman di dalam air steril menunjukkan hasil yang tidak berbeda dengan kontrol.perlakuan perendaman benih dilakukan selama 5 dan 10 jam. Kedua perlakuan ini merupakan perlakuan dengan hasil terbaik dari perlakuan lainnya pada pengujian pemacuan pertumbuhan yang telah dilaksanakan sebelumnya.perendaman pertama yang dilakukan adalah perendaman 10 jam, benih dimasukkan ke dalam suspensi bakteri dimulai pada pukul 20.00. Perendaman kedua adalah 5 jam dan benih dimasukkan pada pukul 01.00. Perendaman benih dalam perlakuan 2waktu yang berbeda tersebut selesai tepat pada pukul 06.00 dan benih siap ditanam.
21 Perlakuan pada uji penghambatanpenyakit busuk pangkal batang adalah 7 dengan 3 kali ulangann dan menggunakan 5 unit benih kedelai dalam setiap perlakuannya.perlakuan-perlakuan tersebut yaitu: P1 5 P1 10 B12 5 B12 10 F8 5 F8 10 Kontrol = Benih kedelai dengan aplikasi P. fluorescens RH4003 melalui perendaman 5 jam (S. rolfsii) = Benih kedelai dengan aplikasi P. fluorescens RH4003 melalui perendaman 10 jam (S. rolfsii) =Benih kedelai dengan aplikasi B. subtilis AB89 melalui perendaman 5 jam (S. rolfsii) = Benih kedelai dengan aplikasi B. subtilis AB89 melalui perendaman 10 jam (S. rolfsii) = Benih kedelai dengan aplikasi F8 melalui perendaman 5 jam (S.rolfsii) = Benih kedelai dengan aplikasi F8 melalui perendaman 10 jam (S.rolfsii) = Benih kedelai tanpa aplikasi PGPR dan perendaman (S. rolfsii) a b c Gambar 7Persiapan perendaman benih pada uji penghambatan penyaki busuk pangkal batang, (a) persiapan benih, (b) perendaman benih sesuai waktu perendamannya, dan (c) benih kedelai siap ditanam
22 Peubah yang Diamati Uji penghambatanini dilakukan untuk mengamati kejadian penyakit busuk pangkal batang kedelai selama 6 MST. Peubah yang diamati adalah persentase kejadian penyakit dan nilai total persentase kejadian penyakit (AUDPC). Penghitungan Kejadian Penyakit Kejadian penyakit merupakan indikator penting untuk mengetahui perkembangan suatu penyakit pada pertanaman. Pengamatan masa inkubasi penyakit dilakukan saat benih ditanam sampai munculnya gejala pertama. Setelah itu, dilakukan pengamatan kejadian penyakit (KP) setiap minggunya. Kejadian penyakit dapat dihitung dengan rumus (Cooke 1998): 100% Keterangan: KP = Kejadian penyakit (%) n = Jumlah tanaman yang terserang patogen N = Jumlah tanaman yang diamati Data kejadian penyakit kemudian digunakan untuk memperoleh nilai AUDPC (Area Under Disease Progress Curve). AUDPC adalah total tingkat kejadian penyakit pada perlakuan. AUPDC dapat dihitung dengan rumus yang dinyatakan oleh Van der Plank (1963 dalamcooke 1998) sebagai berikut: Keterangan: AUDPC = Area Under Disease Progress Curve(% hari) Yi+1 = Data pengamatan ke-i+1 ti+1 = Waktu pengamatan ke-i+1 Yi = Data pengamatan ke-1 ti = Waktu pengamatan ke1
23 Rancangan Percobaan dan Analisis Data Uji pemacuan pertumbuhan dan penghambatan penyakit busuk pangkal batang kedelai yang dilakukan di rumah kaca ini menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) dua faktor (Two Factors Experiments in Completely Randomized Design). Kemudian data yang diperoleh dilakukan analisis ragam (Anova) dengan menggunakan program Minitab versi 14 dan Statistical Analysis System (SAS) versi 9.1 pada taraf nyata 5%.