16 BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan the post test only group design. Penelitian eksperimental bertujuan untuk mengetahui kemungkinan hubungan sebab akibat dengan cara memberikan dua atau lebih perlakuan kepada dua atau lebih kelompok, di mana kelompokkelompok tersebut dibedakan yaitu, kelompok eksperimen dan kontrol. B. Lokasi Penelitian Penelitian dilakukan di Pusat Antar Universitas (PAU) Bagian Gizi Universitas Gajah Mada Yogyakarta. C. Subjek Penelitian Hewan uji yang digunakan adalah Rattus norvegicus jantan galur Wistar, berumur 2-3 bulan dengan berat badan antara 160-200 g diperoleh dari PAU Universitas Gajah Mada Yogyakarta. Banyaknya jumlah sampel ditentukan dengan rumus Federer : (k-1) (n-1) > 15 k: jumlah kelompok n: jumlah sampel dalam tiap kelompok Besar sampel yang diperlukan dihitung dengan rumus: (k-1) (n-1) > 15 ; k = 5 (5-1) (n-1) > 15 4n-4 > 15 16
17 4n > 19 n > 4,75 Berdasarkan hasil perhitungan jumlah sampel minimal yang diperlukan untuk tiap kelompok sebanyak 5 ekor Rattus norvegicus galur Wistar. Dalam percobaan ini menggunakan 6 ekor tikus untuk mengantisipasi adanya drop out. Jadi jumlah sampel total adalah 30 ekor. 1. Kriteria Inklusi a. Rattus norvegicus jantan galur Wistar b. Umur 3 bulan c. Berat 200 + 20 g d. Tidak ada cacat fisik 2. Kriteria drop out Tikus dikeluarkan dari percobaan (drop out) bila selama penelitian tikus mati atau tidak DM setelah induksi STZ-NA. D. Teknik Sampling Teknik sampling menggunakan teknik purposive sampling. Pengambilan sampel dari populasi dilakukan secara sengaja sesuai dengan persyaratan sampel yang diperlukan (Mustafa, 2000). Sampel kemudian dibagi menjadi lima kelompok dengan teknik randomisasi sehingga masingmasing kelompok terdiri dari 6 ekor tikus. E. Identifikasi Variabel Penelitian 1. Variabel bebas : Ekstrak Daun Sukun (Artocarpus altilis F.) 2. Variabel terikat : Jumlah sel β pankreas 3. Variabel Luar :
18 a. Dapat dikendalikan : pakan yang diberikan selama perlakuan, umur, dan jenis kelamin, berat badan, suhu udara. b. Tidak dikendalikan : variasi kepekaan tikus terhadap suatu zat, stres. F. Definisi Operasional Variabel Penelitian 1. Ekstrak Daun Sukun (Artocarpus altilis F.) Ekstrak Daun Sukun adalah hasil ekstraksi dari Daun Sukun yang mempunyai sarat berwarna hijau dan basah. Pengekstrakan Daun Sukun menggunakan teknik maserasi dengan pelarut ethanol 70% karena cukup murah dan bersifat polar untuk menagkap senyawa flavonoid dan fenolik cukup baik. Hasil ekstrak berupa pasta. Tempat esktraksi di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas Gajah Mada (UGM) Yogyakarta. Dosis yang diberikan adalah dosis yang pernah dipakai untuk menurunkan kadar gula darah pada mencit model DM, yaitu 1,4 g/kgbb, 2,8 g/kgbb, dan 5,6 g/kgbb (Tanuwijaya, 2007). Faktor konversi mencit (20 g) ke tikus (200 g) adalah 7,0 (Suhardjono, 1995). Maka dosis ekstrak Daun Sukun yang digunakan dalam penelitian ini adalah: Dosis I pada tikus 200 g = Dosis/200 g BB x Faktor konversi =1,4 x x 7 = 0,28 x 7 = 0,196 g/200 g BB = 200 g/200 g BB Dosis II pada tikus 200 g = Dosis/200 g BB x Faktor konversi = commit 2,8x to user x 7
19 = 0,56 x 7 = 0,392 g/200 g BB = 400 mg/200g BB Dosis III pada tikus 200 g = Dosis/200 g BB x Faktor konversi =5,6 x x 7 = 1,12 x 7 = 0,784 g/200 g BB = 800 mg/200 g BB Skala pengukuran ekstrak Daun Sukun adalah skala ordinal. 2. Jumlah sel β pankreas normal. Jumlah sel β pankreas normal diperoleh dari pankreas yang diambil setelah 14 hari perlakuan. Pankreas yang diambil di Parafin kemudian dipotong dengan Parafin dengan ketebalan 7 µm dan di beri jarak 30 slice untuk preparat berikutnya. Kemudian difiksasi pada object glass. Dicat dengan metode Gomori. Hasil diamati pada mikroskop untuk mengetahui jumlah sel β pankreas normal. Perhitungan hasil diperoleh dari jumlah rata-rata sel β dari sepuluh pulau Langerhans dengan ukuran yang hampir sama. Sel β yang normal mempunyai kriteria sitoplasma masih utuh, dan inti yang cukup besar. Perhitungan dilakukan dalam kotak yang berukuran 350 x 350 µ dengan kriteria ukuran pulau Langerhans mayoritas terdapat di seluruh preparat dengan jumlah pulau minimal tiga. Data yang diperoleh dalam bentuk nominal.
20 3. Streptozotocin (STZ) - Nicotinamide (NA). Dosis STZ untuk tikus putih agar menjadi diabtes tipe 2 adalah 65 mg/200 g BB yang disuntikan secara intraperitoneal. Dosis Nicotinamide 230 mg/200 g. Nicotinamide diinjeksi 15 menit sebelum induksi STZ secara intraperitonial (Szkudelski, 2012). 4. Variabel luar yang dapat dikendalikan. a. Makanan. Makanan adalah salah satu sumber antioksidan dalam tubuh, sehingga pemberian makanan setiap perlakuan dibuat sama jumlah dan jenisnya, yaitu makanan buatan pellet dengan merk yang sama. b. Jenis kelamin tikus Dipilih tikus putih jenis kelamin jantan. c. Galur tikus. Faktor genetik berperan dalam menentukan gambaran sel-β pankreas. Heterogenitas genetik dapat memberikan perbedaan tingkat respon pada makanan, yang akan berpengaruh terhadap gambaran selβ pankreas. Untuk meminimalkan bias, digunakan tikus putih dari galur yang sama, sehingga sampel homogen. d. Umur tikus. Tikus putih yang dipakai berumur sekitar 3 bulan. e. Berat badan tikus. Tikus dipilih yang sudah mencapai berat badan 200 + 20 g sehingga memudahkan dalam konversi dosis.
21 f. Suhu udara. Tikus dikandangan dalam ruangan dengan suhu berkisar antara 25-28 o C. 5. Variabel luar yang sulit dikendalikan Kondisi psikologis tikus dipengaruhi lingkungan sekitar, seperti lingkungan yang terlalu ramai dan gaduh, pemberian perlakuan yang berulang kali, dan perkelahian antartikus. Stres juga dapat timbul dari dalam tikus itu sendiri sehingga dengan pengendailan faktor ekstrinsik tikus masih bisa mengalami stres. G. Instrumen Penelitian Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi: 1) kandang tikus; 2) tabung mikro hematokrit; 3) spuit injeksi; 4) spuit pencekok / oral 3 ml; 5) beaker glass; 6) STZ; 7) aquadest dan 8) pakan tikus 9) peristaltic pump 10) timbangan 11) inkubator 12) Parafin 13) mikrotom 14) mikroskop cahaya yang terhubung dengan kamera digital dan komputer 15) homogenizer. H. Cara Kerja 1. Membuat ekstrak Daun Sukun (Artocarpus altilis F.) Ekstrak pada percobaan ini dibuat di LPPT UGM, Yogyakarta. Ekstrak dibuat dengan metode maserasi dengan pelarut etanol 70% dan hasilnya berupa ekstrak pasta. Ekstrak pasta kemudian diencerkan dan diberikan peroral pada tikus. Volume cairan maksimal yang dapat diberikan per oral pada tikus adalah 5 ml/200 g BB (Ngatidjan, 1991). Disarankan takaran dosis tidak sampai commit melebihi to user setengah kali volume maksimalnya
22 (Imono dan Nurlaila, 1989). Dalam penelitian digunakan 3 kelompok dosis ekstrak Daun Sukun. Dosis I : 200 mg/200 g BB, Dosis II : 400 mg /200 g BB, Dosis III : 800 mg/200 g BB. Langkah penelitian a. Langkah I: Penentuan besar sampel dan adaptasi Sebanyak 30 ekor tikus putih jantan dibagi menjadi lima kelompok secara random (berdasarkan Rumus Federer) dan diberi pakan standar kemudian glukosa darah dikur dengan metode GOD-PAP untuk membuktikan bahwa glukosa darah tikus antarkelompok homogen. b. Langkah II: Induksi STZ-NA Tikus diinjeksi dengan Nicotinamide (NA) 15 menit sebelum induksi STZ. Dengan dosis NA 230 mg/200 g. Kemudian tikus diinduksi STZ dengan dosis 65 mg/200 g BB secara intraperitoneal pada hari yang sama, kecuali pada kelompok normal tidak diinjeksi STZ-NA. c. Langkah III: Pengecekan glukosa Glukosa darah tikus diukur dengan metode GOD-PAP untuk menentukan apakah tikus yang telah iinjeksi dengan STZ-NA masuk kriteria diabetes atau tidak dengan ukuran glukosa darah minimal 200 mg/dl. d. Langkah IV: Pemberian perlakuan Perlakuan diberikan pada hari ke-5 diberi perlakuan peroral sampai pada hari ke-14.
23 - Kelompok normal : NaCMC 1% + pakan 20g - Kontrol kontrol negatif : NaCMC 1% + pakan 20 g - Kelompok perlakuan I : Ekstrak Daun Sukun dosis I + pakan 20 g - Kelompok perlakuan II : Ekstrak Daun Sukun dosis II + pakan 20 g - Kelompok perlakuan III : Ekstrak Daun Sukun dosis III + pakan 20 g e. Langkah V: Pengecatan sel-β pankreas setelah perlakuan Pengecatan sel-β pankreas dengan metode gomori dilakukan setelah perlakuan selama 14 hari. Tikus dikorbankan dan difiksasi dalam formalin selama 24 jam kemudian pankreas diambil dan dibuat preparat menggunakan metode Parafin yang selanjutnya preparat dianalisis untuk memperoleh data. f. Langkah VI: Perhitungan data Semua sel β pankreas tikus setelah dicat kemudian diamati di bawah mikroskop untuk membedakan sel β dan sel α. Perhitungan hasil diperoleh dari jumlah rata-rata sel β dari sepuluh pulau Langerhans dengan ukuran yang hampir sama kemudian dianalisis.
24 I. Rancangan Penelitian Tikus putih jantan (Rattus norvegicus) 30 ekor Hari Ke-1 Tikus ditimbang BB KN KKN (-) KP I KP II KP III Hari Ke-4 Tikus ditimbang BB dan diukur glukosa darah dengan GOD-PAP Injeksi STZ-NA intraperitoneal dosis 65 mg/200g BB tikus Tikus ditimbang BB dan diukur glukosa darah dengan GOD-PAP Hari Ke-7 NaCMC 1% + pakan NaCMC 1% + pakan Ekstrak Daun Ekstrak Daun Sukun Ekstrak Daun 20 g 20 g Sukun dosis I I+ Sukun dosis dosis I + pakan 20 g III + pakan pakan 20 g 20 g Hari Ke-14 Penimbangan ulang BB tikus untuk penyesuaian ulang dosis Hari Ke-22 Terminasi tikus Pengecatan pankreas dengan gomori krom alum Pembacaan preparat pankreas Analisis data
25 J. Teknik Analisis Teknik analisis data yang digunakan tergantung pada hasil distribusi data. Apabila distribusi data yang didapatkan normal, dan sebaran data normal yang dibuktikan dengan nilai uji Saphiro-Wilk yang memiliki nilai p > 0,05, maka teknik analisis data yang digunakan adalah analisis data parametrik berupa uji Oneway ANOVA, di mana jika hasil uji ANOVA signifikan maka dilanjutkan dengan Post Hoc LSD test. Uji Oneway ANOVA adalah uji parametrik untuk membandingkan perbedaan rerata pada kelima kelompok sekaligus sehingga dapat diketahui apakah kelima kelompok memiliki mean selisih jumlah sel-β yang berbeda secara signifikan atau tidak. Uji Post Hoc LSD adalah uji untuk membandingkan perbedaan mean antarkelompok perlakuan. Namun jika distribusi data didapatkan hasil skewed, maka teknik analisis data yang akan digunakan adalah uji non parametrik berupa uji Kruskall Wallis kemudian dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney (Dahlan, 2008; Taufiqurrahman, 2008). Data yang diperoleh dari penelitian dianalisis menggunakan SPSS versi for Windows release 17.0