2 mikroorganisme patogen pada bahan pangan dan juga memiliki kemampuan probiotik untuk kesehatan konsumen. Berdasarkan latar belakang tersebut, maka perlu dilakukan seleksi yaitu mencari beberapa isolat baru dengan aktivitas antimikrob yang lebih baik. Usaha ini diharapkan menjadi alternatif biopreservasi pada susu jagung yang memanfaatkan sumber isolat dari jagung. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi isolat bakteri asam laktat penghasil bakteriosin dari fermentasi jagung sebagai biopreservasi pada susu jagung fermentasi. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi isolat BAL penghasil antimikrob dari fermentasi jagung yang dapat memberi produk terbaik pada susu jagung fermentasi. Manfaat Penelitian Isolat bakteri asam laktat penghasil antimikrob dari fermentasi jagung yang berhasil diisolasi dapat dimanfaatkan sebagai biopreservasi pada susu jagung fermentasi. 2 METODE Bahan Bahan yang akan digunakan ialah jagung Sweetcorn (Zea mays saccharata) E.coli dan S. aureus sebagai bakteri indikator antimikrob yang merupakan koleksi Laboratorium Mikrobiologi, FMIPA IPB. Alat Alat yang digunakan antara lain: blender, swab steril, cawan Petri, tabung reaksi dan penutup, rak tabung, pipet, gelas piala, bunsen, erlenmeyer, gelas ukur, tube shaker, batang ose, pinset steril, timbangan, inkubator, sentrifuge, autoklaf, spreader glass, stearer, ph meter, refrigerator, mikroskop, coloni counter, serta alat-alat pendukung lainnya. Prosedur Kerja Penelitian ini dibagi menjadi 5 tahap, yaitu; (1) isolasi dan identifikasi bakteri asam laktat dari jagung fermentasi, (2) penapisan BAL berdasarkan karakteristik organoleptik, (3) seleksi BAL melalui uji antagonis dengan bakteri patogen, (4) uji organoleptik susu jagung dengan perlakuan penambahan
supernatan bakteriosin, dibandingkan dengan organoleptik susu fermentasi jagung yang diinokulasi oleh isolat terbaik (5) isolasi DNA, amplifikasi DNA, Blast-N dan pembuatan pohon filogenetik BAL. Fermentasi Spontan Jagung sweetcorn dipipil dari tongkolnya dicuci dan dibersihkan dengan air mengalir. Biji jagung yang telah dibersihkan selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung dan dihancurkan menggunakan batang pengaduk. Selanjutnya ditambahkan aquades steril dengan perbandingan 1:5. Setelah itu dilakukan fermentasi selama 24 jam. Proses isolasi BAL dilakukan dengan 3 perlakuan dan 2 ulangan. Perlakuan pertama yaitu tabung dibuka dan tidak dipanaskan (JMB), tabung ditutup dan tidak dipanaskan (JMT) serta tabung ditutup dan dipanaskan pada suhu 60 o C selama 15 menit (JMA). 3 Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat Isolasi bakteri asam laktat (BAL) dilakukan dari fermentasi jagung secara spontan seperti yang dijelaskan sebelumnya. Sebanyak 100 gram sampel cairan fermentasi diambil, diencerkan dengan larutan NaCl fisiologis. Bakteri ditumbuhkan dalam media MRS (de Mann Rogosa Sharpe) agar, selanjutnya diinkubasi dengan suhu 37 o C selama 2 hari. Koloni yang tumbuh diisolasi dan selanjutnya diseleksi. Koloni yang berbeda kemudian digores pada media untuk diuji pewarnaan Gram, endospora dan uji katalase. Lama inkubasi, morfologi bakteri dan koloni diamati. Karakterisasi isolat diidentifikasi taraf genus sesuai petunjuk Kandler dan Weiss (1995) dalam Bergey's Manual Systematic Bacteriology. Penapisan Bakteri Asam Laktat Menggunakan Karakteristik Organoleptik dan Kemampuan Mempertahankan Aroma Sampel penelitian adalah susu jagung, diperoleh dari proses ekstraksi biji jagung yang dipanaskan dengan suhu 60 0 C selama 15 menit. Susu jagung kemudian di sterilisasi. Setelah susu jagung dingin, BAL hasil isolasi, diinokulasikan pada tabung-tabung yang berisi susu jagung steril. Susu jagung diinkubasi selama 48 jam dan diamati karakteristik organoleptik (warna, aroma, kekentalan) dan selanjutnya disimpan pada suhu 4 0 C selama 6 bulan. Pengujian organoleptik dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, panelis yang dipilih yaitu panelis semi terlatih (semi-trained panel) yaitu mahasiswa di Laboratorium Mikrobiologi. Uji organoleptik setelah fermentasi 48 jam menggunakan panelis perseorangan. Penilaian organoleptik dilakukan dengan menggunakan uji mutu hedonik. Data penilaian uji mutu hedonik dapat ditransformasi dalam skala numerik dan selanjutnya dirata-ratakan untuk interpretasinya. Penilaian organoleptik untuk penapisan BAL yang dapat memberikan karakteristik organoleptik (aroma, kekentalan dan warna). Besar skala uji untuk setiap sifat organoleptik pada perlakuan aplikasi BAL yaitu rentang 1 hingga 7,
4 terjemahan nilai mutu karakteristik warna hasil fermentasi jagung menggunakan isolat terpilih yaitu: sangat kuning (7), kuning (6), agak kuning (5), kuning memudar (4), kuning pucat (3), kuning agak keputih-putihan (2), bening (1). Berdasarkan karakteristik kekentalan dengan skor 7-1 : amat sangat kental (7), sangat kental (6), kental (5), agak kental (4), agak tidak kental (3), tidak kental (2), encer (1). Berdasarkan karakteristik aroma : khas yoghurt (7), agak khas yoghurt (6), khas jagung (5), asam (4), agak asam (3), sangat asarn (2), alkohol (1). Kemampuan BAL mempertahankan aroma selama penyimpanan yang berhubungan dengan perubahan yang dipengaruhi oleh BAL. Pengujian organoleptik setelah 6 bulan penyimpanan menggunakan panelis terbatas (3-5 orang) (Setyaningsih et al. 2010). Karakteristik organoleptik bakteri hasil isolasi dengan batasan: warna 1 hingga 7, besar skala uji untuk setiap sifat organoleptik pada perlakuan aplikasi BAL yaitu rentang 1 hingga 7. Terjemahan nilai mutu hedonik tersebut yaitu; 1 (sangat tidak suka), 2 (tidak suka), 3 (agak tidak suka), 4 (agak suka), 5 (suka), 6 (sangat suka) dan 7 (amat sangat suka). Penilaian organoleptik menggunakan uji mutu organoleptik, untuk menentukan tingkat kesukaan panelis terhadap hasil fermentasi. BAL yang terpilih adalah BAL yang secara karakteristik organoleptik yang unggul dan juga mampu mempertahankan aroma setelah penyimpanan 6 bulan pada suhu 4 o C. Penapisan Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Kemampuan Menghasilkan Antimikrob Metode Antagonis Langsung Metode yang digunakan ialah antagonisme langsung dengan stab inokulasi menggunakan galur indikator (Usmiati dan Marwati 2009). Galur indikator yang digunakan yaitu Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Uji ini dilakukan pada media semipadat dengan metode agar-agar tuang. Sebelum media dituang, bakteri indikator dicampurkan pada media semipadat kondisi suam kuku (40 o C). Setelah dituang bakteri uji diambil dan ditimpakan pada permukaan media agaragar yang telah mulai memadat. Setelah itu di atas koloni bakteri yang akan diuji disentuhkan jarum ose, selanjutnya diletakkan diatas permukaan galur indikator yang telah dituang bersama media sebelumnya dengan sedikit masuk ke dalam media. Biakan diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 24 jam. Adanya senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh bakteri ditandai dengan zona terang di sekitar isolat. Isolat yang menghasilkan zona hambatan terluas (diukur dalam satuan mm) dipakai sebagai bakteri penghasil substansi antimikrob pada uji selanjutnya (Suardana et al. 2007). Produksi Bakteriosin Produksi bakteriosin menggunakan erlenmeyer 100 ml. Kultur diinokulasi 0,1 ml pada media MRS cair pada optical density (OD) tertentu. Inkubasi dilakukan sampai masa eksponensial pada suhu ruang. Selanjutnya kultur hasil produksi yang diperoleh disentrifugasi 12.000 rpm, dengan suhu 4 C selama 15 menit sehingga menghasilkan supernatan. Supernatan dinaikkan sampai ph 6 menggunakan NaOH untuk menghilangkan pengaruh asam yang dihasilkan. Asam laktat yang dihasilkan oleh BAL tidak menghambat pada ph 6 (Desniar et al. 2012). Tahap penelitian ini bertujuan untuk menghasilkan bakteriosin yang
merupakan protein yang memiliki aktivitas paling tinggi terhadap bakteri indikator. Selanjutnya, supernatan netral diuji aktivitasnya dengan metode sumur agar-agar. Metode Difusi Sumur Agar-Agar Inokulum bakteri indikator (bakteri uji) masing-masing dimasukkan ke dalam medium agar-agar lunak yaitu media natrium (NA) cair. Media sebanyak 240 ml yang mengandung agar-agar 1.2% dituang secara aseptis ke dalam cawan Petri dan dibiarkan membeku, kemudian dituang ke cawan Petri. Sumur-sumur dibuat untuk pengujian pada media yang memadat. Supernatan antimikrob dimasukkan ke dalam sumur sebanyak 40 μl, lalu diinkubasikan pada suhu kamar selama 24 jam. Zona hambatan yang terbentuk diukur. Kurva Pertumbuhan BAL Terpilih Sebanyak 0.1 ml dari kultur cair dan kultur agar-agar miring segar ditanam dalam MRS cair dan diinkubasi pada suhu ruang. Pertumbuhan bakteri diikuti setiap 3 jam dengan mengamati nilai kerapatan optik atau optical density (OD) dari starter pada media MRS dengan metode turbidimetrik dengan panjang gelombang 600 nm. Tahap ini bertujuan untuk mengetahui kurva pertumbuhan dan fase pertumbuhan bakteri terbaik hasil uji antagonis langsung. Kurva pertumbuhan bakteri dilakukan sampai mencapai fase kematian. Hal ini dimaksudkan untuk mengetahui fase-fase kehidupan bakteri yang berguna untuk menentukan waktu generasi bakteri, khususnya fase eksponensial yang erat hubungannya dengan sekresi substansi antimikrob. Kultur bakteri diambil untuk mengetahui jumlah BAL pada kerapatan optik yang akan diukur. Kerapatan optik diukur selanjutnya diencerkan 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. Kultur cair di ambil sebanyak 1 ml dan diencerkan sampai pengenceran 10-8, selanjutnya disebar pada media MRS agar-agar. Bakteri hasil plating digunakan sebagai dasar penentuan kurva standar. Fermentasi Susu Jagung Menggunakan Isolat Terpilih dan Uji Organoleptik Sampel penelitian adalah susu jagung, diperoleh dari proses ekstraksi biji jagung yang dipanaskan dengan suhu 60 0 C selama 15 menit. Susu jagung kemudian di sterilisasi. Uji organoleptik dengan 2 perlakuan yaitu: penambahan supernatan (bakteriosin ekstrak kasar) bakteri dan susu jagung fermentasi yang diinokulasikan bakteri terpilih. Kedua perlakuan tersebut akan dibandingkan dengan susu jagung tanpa inokulan sebagai pembanding. Pengujian organoleptik dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi. Panelis yang dipilih yaitu panelis semi terlatih (semi-trained panel) yaitu mahasiswa di Laboratorium Mikrobiologi. Sebelum melakukan penilaian, panelis diberi penjelasan secukupnya mengenai uji organoleptik yang dilakukan. Panelis yang digunakan yaitu sebanyak 15 25 orang. Penilaian organoleptik dilakukan dengan menggunakan uji mutu hedonik. Pada uji mutu hedonik data penilaian dapat ditransformasi dalam skala numerik dan selanjutnya dapat dianalisis statistik untuk interpretasinya (Setyaningsih et al. 2010). Besar skala uji untuk setiap sifat organoleptik pada perlakuan aplikasi BAL 5
6 yaitu rentang 1-7. Penilaian organoleptik ditujukan untuk menilai perubahan aroma selama penyimpanan yang berhubungan dengan sifat biopreservasi yang dipengaruhi oleh BAL. Analisis Data Untuk kualitas organoleptik, data yang diperoleh diuji dengan uji nonparametrik Friedman s test (Setyaningsih et al. 2010) dan apabila berpengaruh nyata dilanjutkan dengan uji LSD untuk melihat perbedaan antar perlakuan. Identifikasi dan Filogenetik Bakteri Asam Laktat Berdasarkan 16S rrna Isolasi DNA Isolasi DNA bakteri dilakukan sesuai protokol stanadar Xprerp soil DNA Mini Kit (PhileKorea Technology). Kultur sel diambil menggunakan ose dan dimasukkan ke dalam tabung mikro steril, dan disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 1 menit. Pelet sel isolat bakteri dicuci sebanyak tiga kali dengan cara 200 μl bufer Tris-EDTA (TE) dituang kedalam tabung mikro, disuspensi dan disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit. Sebanyak 250 µl XPSDE buffer 1, 20 µl proteinase-k (2mg/ml), dan 2 mg glass beads ditambahkan ke pelet sel, lalu diinkubasi pada suhu 70 o C selama 10 menit. Sampel ditambahkan 100 µl XPSDE buffer 2 dan diinkubasi pada es selama 5 menit, setalah itu sampel disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm. Supernatan selanjutnya dipindahkan pada ke tabung mikro baru dan ditambahkan 200 µl XPSDE buffer 3 selanjutnya di inkubasi pada suhu ruang selama 2 menit. Supernatan selanjutnya dipindahkan ke tabung mikro baru dan ditambahkan 250 µl XPSDE buffer 4 dan ethanol 100% kedalam supernatan. Setelah dihomogenkan, sampel dipindahkan ketabung mikro kolom dan di sentrifugasi, kemudian ditambahkan 750 µl buffer elusi di sentrifugasi lagi. Selanjutnya tabung mikro kolom dipindahkan ketabung mikro yang baru dan ditambahkan 50 µl buffer elusi dan disentrifugasi. DNA genom hasil isolasi selanjutnya dapat digunakan untuk amplifikasi gen 16S RNA. Hasil isolasi diperiksa dengan dimigrasi pada gel agarosa 1% dengan kondisi voltase 75V selama 30 menit. Amplifikasi Gen 16S rrna dengan PCR Komponen reaksi PCR pada proses amplifikasi gen 16S rdna untuk 25 µl volume total terdiri atas 3 µl DNA bakteri, 0,1 µl ex taq DNA polimerase, primer forward 20F (5 -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 ), primer reverse 1541R (5 -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ). masing-masing primer sebanyak 1,25 µl, 0,5 µl dntp, bufer PCR sebanyak 5 µl, 0,5 µl MgCl 2, dan 13,4 µl akuabides steril (ddh 2 O). Proses PCR terdiri atas pre-denaturasi pada suhu 95ºC selama 2 menit, kemudian denaturasi 95ºC selama 30 detik, annealing primer 55ºC selama 45 detik, extension primer 72ºC selama 1 menit, dan final extension 72ºC selama 5 menit. DNA diamplifikasi sebanyak 30 siklus. Produk hasil PCR dielektroforesis pada 1% gel agarosa, dan diamati pita tunggal yang terbentuk di