METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Bagian Ruminansia Besar, Fakultas Peternakan, Laboratorium mikrobiologi, SEAFAST CENTER, Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dilaksanakan selama 3 bulan mulai bulan Juni sampai Agustus 2008. Materi Bahan baku yang digunakan dalam pembuatan salami probiotik adalah daging sapi dan lemak sapi. Bahan lain yang digunakan adalah garam NPS (Nitrit Polkent Salt), gula pasir, lada putih, pala, bawang putih, susu skim bubuk dan selongsong sosis fibrosa berdiameter 60 mm. Kultur starter bakteri asam laktat yang telah melalui tahap seleksi sebagai kandidat probiotik. Bahan yang digunakan untuk pengasapan adalah serbuk gergaji dan tempurung kelapa. Media yang digunakan untuk penyegaran kultur starter yaitu de Man Ragosa Sharp Broth (MRS-B) lalu untuk pembuatan kultur induk bahan yang digunakan adalah larutan susu bubuk skim 10%. Media yang digunakan untuk pembuatan kultur kerja dan analisa mikrobiologi adalah de Man Ragosa Sharp Agar (MRS-A), Buffer Pepton Water (BPW), Eosyn Methylen Blue Agar (EMBA), Plate Count Agar (PCA), Vogel Johnson Agar (VJA) dan Kalium tellurit. Peralatan yang digunakan untuk membuat kultur kerja adalah tabung reaksi, cawan Petri, jarum ose, inkubator. Alat yang digunakan untuk membuat salami adalah hand stuffer, cutter, alat pengasap, kompor, baskom, timbangan, panci, dan pisau. Alat untuk analisa mikrobiologi adalah mikroskop, alumunium foil, waterbath, autoclave, blender, hockey stick, termometer, rak tabung reaksi, pipet dan alat gelas lain.
Rancangan Percobaan Rancangan yang digunakan pada penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan perlakuan salami probiotik dengan kombinasi kultur Lactobacillus sp 1A5 dan Lactobacillus fermentum 2B2 dan lama penyimpanan hari ke-0, ke-10, ke-20 dan ke-30 menggunakan 3 kali ulangan. Model matematis yang digunakan berdasarkan Steel and Torrie (1997) : Yij = µ + Pi + εij Keterangan : Yij : Variabel respon akibat pengaruh lama penyimpanan ke-i pada ulangan ke-j µ : Nilai tengah umum Pi : Pengaruh lama penyimpanan ke-i terhadap kualitas mikrobiologis salami probiotik ( i = 0, 10, 20 dan 30 hari) εij : Pengaruh galat percobaan pada unit percobaan ke-i dalam kombinasi perlakuan ke-j Prosedur Persiapan penelitian ini dimulai dengan pembiakan kultur asam laktat yang mempunyai potensi probiotik Lactobacillus sp 1A5 dan Lactobacillus fermentum 2B2 dan pembuatan salami probiotik dan menganalisis kualitas mikrobiologis selama penyimpanan pada hari ke-0 sebelum disimpan, kemudian dianalisis pada hari ke-10, ke-20, dan ke-30. Persiapan Penelitian Pembiakan Kultur. Kultur starter murni diisolasi dari daging sapi. Kultur murni dilakukan penyegaran pada media de Man Ragosa Sharp Broth (MRS-B). Sebanyak 2% kultur diinokulasikan ke dalam larutan skim steril 10%. Kultur kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 48 jam yang hasilnya disebut kultur induk. Kultur induk sebanyak 2% diinokulasikan dan diinkubasikan kembali yang hasilnya disebut kultur antara. Kultur antara sebanyak 2% diinokulasikan dan diinkubasikan kembali yang hasilnya disebut kultur kerja. Kultur kerja ditumbuhkan pada media de Man Ragosa Sharp Agar (MRSA) dan dihitung populasinya. 21
Kultur yang memenuhi syarat untuk siap dijadikan kandidat starter kultur untuk sosis fermentasi adalah dengan populasi 10 9 CFU/ml. Tahap pembiakan kultur dapat dilihat pada Gambar 1. Kultur starter murni yang diisolasi dari daging sapi Penyegaran pada media de Man Ragosa Broth (MRS-B) 2% diinokulasikan ke dalam larutan skim steril 10% 2 % dari kultur Diinkubasi pada suhu 37 o C selama 48 jam (hasilnya disebut kultur induk) Kultur antara 2 % dari kultur Kultur kerja Ditumbuhkan pada media MRS-agar Populasi 10 9 CFU/ml Dihitung populasinya Populasi < 10 9 CFU/ml Starter kultur untuk salami Gambar 1. Pembiakan Starter Kultur (Arief, 2000) Penelitian Utama Pembuatan Salami Probiotik. Bakteri asam laktat yang digunakan sebagai starter kultur pada pembuatan salami probiotik ditentukan berdasarkan seleksi bakteri asam laktat yang mempunyai potensi sebagai probiotik. Starter kultur yang dipakai adalah kombinasi bakteri asam laktat 1A5 dan 2B2 sebanyak 2% dengan perbandingan jumlah kultur yang diinokulasikan sebesar 1:1. Setelah diinokulasikan kemudian proses conditioning selama 1 hari dilanjutkan dengan pematangan pada suhu ruang dan pengasapan dingin selama 3 hari. Kemudian salami tersebut diteliti kualitas mikrobiologisnya selama penyimpanan. 22
Proses pembuatan salami dilakukan dengan 3 ulangan dan diamati pada 4 titik penyimpanan data diambil secara duplo, sehingga terdapat 24 data untuk masing-masing peubah yang diukur. Sebelum dilakukan pembuatan salami, daging dianalisis kualitas mikrobiologisnya. Proses pembuatan salami yang dilakukan adalah sebagai berikut,daging digiling lalu dibekukan dengan metode pembekuan lambat di dalam freezer berikut lemak. Daging dan lemak yang dibekukan kemudian dicampurkan dan digiling ke dalam bowl cutter dengan penambahan berturut-turut bumbu, gula pasir 2%, starter kultur dan garam NPS (Nitrit Polken Salt) sebanyak 2% dari total adonan. Starter kultur yang ditambahkan harus mempunyai jumlah populasi minimal 10 8 CFU/g (Arief, 2000), dan penambahannya sebanyak 2% (b/v). Temperatur proses ini harus dijaga dan tidak melebihi 2 0 C. Adonan dengan kehalusan sebesar menir (butiran beras) kemudian dimasukan kedalam selongsong (casing) yang mempunyai diameter 5 cm. Formulasi pembuatan Salami Probiotik dapat dilihat di Tabel 4. Tabel 4. Formulasi Adonan Salami yang Digunakan Bahan Jumlah yang Digunakan (g) Persen Bahan Utama Daging Sapi 720 80 Lemak Sapi 180 20 Bahan Tambahan...... ( % dari jumlah total daging + lemak sapi ) Gula pasir 11,25 1,25 Starter Kultur 18 2 NPS 18 2 Bawang Putih 11,25 1,25 Ketumbar 4,5 0,5 Lada Halus 4,5 0,5 Jahe Halus 4,5 0,5 Pala Halus 2,25 0,25 Sumber : Arief, (2000) Proses conditioning dilakukan pada suhu kamar selama 24 jam, yang dilanjutkan dengan pengasapan dingin selama 3 hari, pada suhu 25-28 o C selama 3 jam per harinya, kemudian setelah pengasapan dilakukan proses fermentasi dan pematangan sosis dalam ruang fermentasi pada suhu kamar. Setelah 3 hari proses fermentasi berlangsung maka diperoleh sosis fermentasi. Setelah sosis fermentasi terbentuk, kemudian disimpan pada suhu 10 o ± 2 o C dan dilanjutkan dengan analisa 23
kualitas mikrobiologis selama penyimpanan 0, 10, 20, dan 30 hari. Alur proses perlakuan dari bahan baku hingga pembuatan dan penyimpanan salami dapat dilihat pada Gambar 2. Proses pembuatan salami probiotik dapat dilihat pada Gambar 3. Daging dari pasar Lemak dari pasar Cooler box Cooler box Analisis kualitas mikrobiologis daging Dipotong dadu Dipotong dadu Digiling dengan mincer Digiling dengan mincer Dibekukan Analisis kualitas mikrobiologis adonan Dibuat salami Conditioning 1 hari, proses fermentasi dan pengasapan 3 hari Disimpan pada suhu 10 o C ± 2 o C Analisis kualitas mikrobiologis salami selama penyimpanan Hari ke-0 sebelum disimpan Hari ke-10 Hari ke-20 Hari ke-30 Gambar 2. Alur Proses Perlakuan dari Bahan Baku hingga Pembuatan dan Penyimpanan Salami 24
Daging (80%) Lemak (20%) Digiling Dibekukan Digiling ke dalam cutter Dimasukkan bumbu, gula, starter kultur dan NPS Dimasukkan ke dalam selongsong Conditioning (suhu kamar, 24 jam) Proses fermentasi (suhu kamar, 3 hari) yang diselingi dengan proses pengasapan selama 3 jam per harinya pada suhu kamar Salami Gambar 3. Pembuatan Salami (Arief, 2000) Pengukuran Peubah Uji Kualitas Mikrobiologis Daging. Sebelum dilakukan analisis mikrobiologi, sampel daging segar dipersiapkan terlebih dahulu dengan cara sebagai berikut: sebanyak 5 gram sampel daging dimasukan ke dalam plastik steril lalu ditambahkan 45 ml larutan pengencer steril, kemudian dikocok diremas-remas hingga diperoleh campuran yang homogen dengan konsentrasi 0,1g/ml. Sampel ini kemudian diencerkan dengan larutan pengencer sesuai dengan kebutuhan dan siap untuk plating. Total Bakteri Asam Laktat. Prosedur analisis bakteri asam laktat dilakukan dengan media tuang sesuai petunjuk APHA (1992). Sebanyak 5 gram sampel daging yang telah disiapkan diencerkan menggunakan 45 ml BPW lalu dipipet secara 25
aseptik sebanyak 1ml lalu dimasukan ke tabung yang berisi media pengencer BPW 9 ml yang selanjutnya disebut pengenceran 10-1, sebanyak 1ml diambil dari tabung pengenceran 10-1 dimasukan ke tabung kedua yang berisi BPW 9 ml yang selanjutnya disebut pengenceran 10-2, kemudian dilakukan prosedur yang sama sampai pengenceran 10-7. Media tumbuh yang digunakan adalah de Man Ragosa Sharp Agar (MRS-A) lalu pengenceran 10-5 sampai 10-7 dipupukkan ke dalam cawan petri steril secara duplo, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam dan dihitung populasinya. Koloni yang berwarna putih atau kekuning-kuningan merupakan koloni bakteri asam laktat. Analisis Total Plate Count (APHA, 1992). Sebanyak 5 gram sampel yang telah disiapkan diencerkan menggunakan 45 ml BPW lalu dipipet secara aseptik pada pengenceran 10-6 sampai 10-8 dan dipupukkan sebanyak 1 ml ke dalam cawan petri steril, selanjutnya ditambahkan medium Plate Count Agar (PCA), dihomogenkan dengan cawan diputar membentuk angka delapan. Jika agar telah beku inkubasi pada suhu 37 o selama sekitar 24 jam. Cara perhitungan jumlah koloni adalah sebagai berikut : Jumlah bakteri = rata-rata jumlah koloni x faktor pengencer. Selang jumlah bakteri yang digunakan adalah 25-250 koloni. Analisis Kuantitatif Escherichia coli. Sebanyak 5 gram sampel yang telah disiapkan diencerkan menggunakan 45 ml BPW lalu dipipet secara aseptik pada pengenceran 10-2 sampai 10-4 dan dipupukkan sebanyak 0,1 ml ke dalam cawan petri steril. Sampel dipupukkan ke dalam cawan yang telah berisi media Eosyn Methylen Blue Agar (EMBA) beku. Sampel disebarkan dengan alat hockey stick yang steril hingga merata. Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada suhu 37 o C, koloni E coli yang tumbuh berwarna biru keunguan. Analisis Kuantitatif total Staphylococcus aureus ( Fardiaz, 1982). Analisis terhadap Staphylococcus spp. menggunakan metode hitungan cawan seperti halnya angka lempeng total bakteri. Masing-masing sebanyak 1 ml dari pengencer pengenceran 10-2 sampai 10-5 dipipet kemudian dipupukkan pada media Vogel Johnson Agar (VJA) dengan Kalium Tellurit 6%. Inkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam, kemudian dihitung populasinya dengan melihat karakter koloni berwarna hitam. 26
Uji Kualitas Mikrobiologis Adonan dan Salami. Sebelum dilakukan analisis mikrobiologi, sampel dipersiapkan terlebih dahulu dengan cara sebagai berikut : sebanyak 5 gram sampel dimasukan ke dalam plastik steril lalu ditambahkan 45 ml larutan pengencer steril, kemudian dihancurkan hingga diperoleh campuran yang homogen dengan konsentrasi 0,1g/ml. Sampel ini kemudian diencerkan dengan larutan pengencer sesuai dengan kebutuhan dan siap untuk plating. Total Bakteri Asam Laktat. Prosedur analisis bakteri asam laktat dilakukan dengan media tuang sesuai petunjuk APHA (1992). Sebanyak 5 gram sampel salami yang telah disiapkan diencerkan menggunakan 45 ml BPW lalu dipipet secara aseptik sebanyak 1ml lalu dimasukan ke tabung yang berisi media pengencer BPW 9 ml yang selanjutnya disebut pengenceran 10-1, sebanyak 1ml diambil dari tabung pengenceran 10-1 dimasukan ke tabung kedua yang berisi BPW 9 ml yang selanjutnya disebut pengenceran 10-2, kemudian lakukan prosedur yang sama sampai pengenceran 10-9. Media tumbuh yang digunakan adalah de Man Ragosa Sharp Agar (MRS-A) lalu pengenceran 10-7 sampai 10-9 dipupukkan ke dalam cawan petri steril secara duplo, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam dan dihitung populasinya. Koloni yang berwarna putih atau kekuning-kuningan merupakan koloni bakteri asam laktat. Analisis Total Plate Count (APHA, 1992). Sebanyak 5 gram sampel yang telah disiapkan diencerkan menggunakan 45 ml BPW lalu dipipet secara aseptik pada pengenceran 10-13 sampai 10-15 dan dipupukkan sebanyak 1 ml ke dalam cawan petri steril, selanjutnya ditambahkan medium Plate Count Agar (PCA), dihomogenkan dengan cawan diputar membentuk angka delapan. Jika agar telah beku inkubasi pada suhu 37 o selama sekitar 24 jam. Cara perhitungan jumlah koloni adalah sebagai berikut : Jumlah bakteri = rata-rata jumlah koloni x faktor pengencer Selang jumlah bakteri yang digunakan adalah 25-250 koloni. Analisis Kuantitatif Escherichia coli. Sebanyak 5 gram sampel yang telah disiapkan diencerkan menggunakan 45 ml BPW lalu dipipet secara aseptik pada pengenceran 10-2 sampai 10-4 dan dipupukkan sebanyak 0,1 ml ke dalam cawan petri steril. Sampel dipupukkan ke dalam cawan yang telah berisi media Eosyn Methylen Blue Agar (EMBA) beku. Sampel disebarkan dengan alat hockey stick yang steril 27
hingga merata. Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada suhu 37 o C, koloni E coli yang tumbuh berwarna biru keunguan. Analisis Kuantitatif total Staphylococcus aureus ( Fardiaz, 1982). Analisis terhadap Staphylococcus spp. menggunakan metode hitungan cawan seperti halnya angka lempeng total bakteri. Masing-masing sebanyak 1 ml dari pengencer pengenceran 10-3 sampai 10-5 dipipet kemudian dipupukkan pada media Vogel Johnson Agar (VJA) dengan Kalium Tellurit 6%. Inkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam, kemudian dihitung populasinya dengan melihat karakter koloni berwarna hitam. 28