3. METODOLOGI 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian 3.2. Bahan dan Alat 3.3. Tahapan Penelitian

Transkripsi

1 3. METODOLOGI 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan antara bulan Juli 2007 sampai April Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan IPB; Laboratorium Mikrobiologi dan Kimia SEAFAST Center IPB, Laboratorium Terpadu IPB, dan Laboratorium Kimia UIN Syarief Hidayatullah Ciputat, Tangerang Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas: 1) Asap cair tempurung kelapa yang diperoleh dari CV Wulung Prima, binaan dari Fateta IPB. 2) Bahan pembuatan bakso ikan: daging ikan tenggiri, tepung tapioka, bumbubumbu (garam, bawang merah, bawang putih, jahe, dan merica), dan es. 3) Bahan-bahan untuk analisis mikrobiologi, yaitu biakan murni Pseudomonas aeruginosa dan Staphylococcus aureus, NA, NB, PCA, dan garam fisiologis. 4) Bahan-bahan untuk uji kimiawi antara lain Na 2 SO 4 dan dichloromethane. Alat-alat yang digunakan antara lain timbangan, kertas saring, pengaduk magnetik, desikator, erlenmeyer, refrigerator, inkubator, tabung reaksi, gelas ukur, pipet, mikropipipet, kapas, autoclave, cawan petri, baki, pisau, telanan, blender, dan corong. Peralatan untuk pengujian kimia antara lain GC-MS (QP2010), oven, gelas porselin, dan ph-meter (ORION-410A) Tahapan Penelitian Penelitian ini dilakukan dalam tiga tahap. Penelitian tahap I adalah melakukan kajian keamanan pangan asap cair tempurung kelapa sebagai bahan pengawet alternatif yang aman yaitu dengan 1) mengidentifikasi komponen asap cair, 2) mengetahui toksisitas akut (LD 50 ) asap cair. Penelitian tahap II, yaitu melakukan pengujian terhadap aktivitas antibakteri asap cair tempurung kelapa. Penelitian tahap III yaitu melakukan kajian aplikasi asap cair tempurung kelapa terhadap daya awet bakso ikan. Adapun diagram alir penelitian dapat dilihat pada Gambar 2.

2 Penelitian Tahap I: Kajian Keamanan Asap Cair Tempurung Kelapa 1. Identifikasi Komponen (GC-MS) 2. Penentuan Toksisitas Akut (LD 50 ) Penelitian Tahap II: Uji Aktivitas Antibakteri Asap Cair Tempurung Kelapa Penentuan Nilai MIC (Metode Kontak Medium Cair) Penelitian Tahap III: Aplikasi Asap Cair Tempurung Kelapa Pada Bakso Ikan Perlakuan asap cair : (1) Cara Pemberian; (2) Konsentrasi Perlakuan Terbaik Parameter yang diamati: 1. Parameter fisik 2. Uji hedonik 3. Uji total fenol Perlakuan Penyimpanan: (1) Suhu Kamar (2) Suhu Refrigerasi Parameter yang diamati: 1. Nilai TPC 2. Nilai ph 3. Kadar air Gambar 2. Diagram Alir Tahapan Penelitian 17

3 3.4. Penelitian Tahap I Penelitian tahap I bertujuan untuk mengkaji keamanan pangan asap cair tempurung kelapa sebagai bahan pengawet alternatif yang aman. Pertama adalah mengidentifikasi komponen asap cair tempurung kelapa dengan Gas Chromatography Mass Spectroscopy (GC-MS) Shimadzu QP2010. Jenis kolom yang digunakan adalah RTx-1 MS dengan panjang 30 m dan diameter dalam 0.32 mm. Komponen diidentifikasi berdasarkan waktu retensi dan mass spectra dibandingkan dengan pustaka (Wiley 7; Nist 27; Nist 147). Kedua adalah uji toksisitas akut asap cair tempurung kelapa dengan menentukan nilai LD 50. Uji toksisitas akut mengacu pada OECD 402 (2001). Metode ini menggunakan sedikit hewan percobaan, yaitu 3 hewan setiap perlakuan. Nilai LD 50 ditentukan dari dosis suatu senyawa atau bahan yang menyebabkan kematian 50% dari hewan percobaan Identifikasi Komponen Asap Cair (Guillen & Ibargoitia 1999) Preparasi Sampel Asap cair sebanyak 30 ml dimasukkan dalam labu pisah, kemudian ditambahkan 10 ml dichloromethane lalu dikocok sebentar. Sampel didiamkan selama 1 jam lalu diambil fraksi bagian bawah ke dalam erlenmeyer. Ditambahkan lagi 10 ml dichloromethane lalu kocok dan didiamkan selama 1 jam. Selanjutnya diambil fraksi bagian bawah dan tambahkan dengan yang pertama, dan disaring dengan kertas Whatman 42 dengan ditambahkan Na 2 SO 4. Hasil saringan siap untuk diinjek. Kondisi Pengoperasian GCMS GCMS-QP2010 dioptimasikan pada suhu oven C yang dipertahankan selama 4 menit, suhu kemudian ditingkatkan menjadi C dengan kenaikan 20 0 C/menit dan dipertahankan selama 2 menit, suhu ditingkatkan lagi menjadi C dengan kenaikan suhu 20 0 C/menit dan dipertahankan selama 16 menit. Suhu pada sumber ion disetel pada C sedangkan suhu injector diset pada C. Analisis ini menggunakan gas helium yang memiliki kemurnian 99.99% 18

4 dengan tekanan gas 62.7 kpa. Sampel diinjeksikan dalam kromatografi gas sebanyak 1 µl, dianalisis dari berat molekul sampai dalam waktu 3 sampai 32 menit Uji Toksisitas Akut (Penentuan LD 50 ) Hewan Uji Hewan uji yang digunakan adalah mencit jantan dengan umur rata-rata 5-6 minggu dengan berat lebih kurang gram, diperoleh dari Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Variasi berat badan hewan uji mencit tidak boleh lebih dari 20% dari berat badan rata-rata. Prosedur Pengujian Hewan uji mencit yang sehat diaklimatisasi atau diadaptasikan pada kondisi laboratorium dalam suatu kandang minimal selama 7 hari dan diberi makan dengan takaran pakan yang diberikan adalah 5 gram/ekor/hari serta diberi minum 1-2 ml/gram makanan. Selama masa aklimatisasi semua mencit ditimbang setiap hari. Satu kandang berukuran kurang lebih 30x20 cm 2 digunakan untuk menyimpan 3 ekor mencit. Setiap dua hari kandang dibersihkan dan dilakukan disinfektasi sekali dalam seminggu. Setelah itu, mencit dibagi dalam bentuk kelompok berdasarkan dosis dengan rincian seperti pada Tabel 4. Tabel 4 Rincian Seri Dosis untuk Uji Toksisitas Akut Dosis perlakuan (mg/kg) Kelompok Kontrol Tabel 4 menunjukkan bahwa dalam setiap perlakuan, yaitu dosis asap cair 0, 50, 500, 5.000, dan mg/kg BB, digunakan 3 ekor mencit. Pengelompokan dilakukan secara acak berdasarkan berat badan mencit, kemudian diberi tanda/nomor pengenalnya untuk setiap kelompok tingkat dosis. Sebelum 19

5 diberi perlakuan mencit dipuasakan dahulu selama minimal 4 jam. Masingmasing dosis diberikan 1x (tunggal), yaitu pada hari pertama kepada 3 ekor mencit jantan dengan pencekokan masing-masing sebanyak 1 ml. Pencekokan dilakukan secara oral menggunakan sonde. Mencit kontrol hanya diberi air aquades (tanpa asap cair) sebanyak 1 ml. Pengamatan dilakukan selama interval waktu 24 jam selama 14 hari. Persentase kematian untuk tiap dosis (apabila ada) dicatat dalam tabel. Mencit yang masih hidup berat badannya terus ditimbang selama pengamatan. Analisis data dilakukan berdasarkan laju peningkatan berat badan rata-rata mencit dan jumlah kematian mencit untuk masing-masing dosis Penelitian Tahap II Penelitian tahap II dilakukan untuk menguji aktivitas antibakteri asap cair tempurung kelapa. Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan mencari nilai MIC (Minimum Inhibitory Concentration) asap cair tempurung kelapa terhadap 2 bakteri uji, yaitu Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa. Nilai MIC dapat diartikan sebagai konsentrasi terkecil dari suatu bahan yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba sebesar >90% selama inkubasi 24 jam (Cosentino et al di dalam Sara 2004) Persiapan Kultur Mikroba Kultur bakteri dalam agar miring diambil satu ose dan diinokulasi dalam 10 ml NB, kemudian diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 20 jam. Kultur ini digunakan dalam setiap pengujian (Vigil et al. 2005) Prosedur Pengujian Pengujian aktivitas antibakteri asap cair dilakukan dengan metode kontak pada medium cair (Vigil et al. 2005). Dalam erlenmeyer 100 ml diisi 50 ml medium cair (Nutrient Broth) yang mengandung asap cair dengan berbagai konsentrasi. Setelah medium diinokulasi dengan mikroba uji sekitar 10 5 CFU/ml, medium diinkubasi pada suhu 37 0 C pada shaker 150 rpm selama 24 jam. Penghambatan pertumbuhan bakteri pada tabung dengan konsentrasi terkecil menunjukkan nilai MIC, kemudian diikuti perhitungan jumlah bakteri dengan metode tuang. 20

6 3.6. Penelitian Tahap III Penelitian tahap III bertujuan untuk mengkaji penggunaan asap cair tempurung kelapa terhadap daya awet bakso ikan. Bakso ikan dengan penambahan asap cair disimpan pada suhu kamar ( C) dan suhu refrigerasi (4±1 0 C). Sebelum dilakukan penyimpanan, terlebih dahulu ditentukan cara pemberian dan konsentrasi asap cair tempurung kelapa yang digunakan. Cara pemberian asap cair dilakukan dengan 3 metode, yaitu perendaman dalam asap cair selama 30 menit, pencampuran asap cair ke dalam adonan bakso, dan pencampuran asap cair ke dalam air perebus bakso. Konsentrasi asap cair dipilih berdasarkan penerimaan konsumen terhadap bakso asap Penentuan Cara Pemberian dan Konsentrasi Asap Cair Bakso ikan yang dibuat pada penelitian ini berdasarkan penelitian Sari (2004). Bahan baku pembuatan bakso adalah daging ikan tenggiri yang telah dipisahkan dari duri dan seratnya. Proses selanjutnya adalah penghancuran daging dengan food processor bersama dengan penambahan bumbu, garam, dan es. Adonan yang terbentuk kemudian dicetak dengan tangan menjadi bulatan berdiameter 2,0-2,5 cm dan dimasukkan dalam air mendidih pada suhu 70 0 C. Perebusan dilakukan hingga bakso mengambang selama kurang lebih 15 menit. Setelah itu, bakso ditiriskan dan dikemas non-vacum dengan plastik HDPE steril. Tahap ini menguji cara pemberian asap cair dan konsentrasi asap cair terbaik yang akan dipergunakan untuk tahap penyimpanan bakso ikan. Asap cair diberikan pada bakso ikan dengan tiga cara, yaitu perendaman bakso dalam asap cair selama 30 menit, pencampuran asap cair ke dalam adonan bakso, dan pencampuran asap cair ke dalam air perebus bakso. Parameter yang diamati adalah parameter fisik yaitu timbulnya lendir setiap selang waktu 8 jam sampai bakso telah menunjukkan tanda-tanda kerusakan. Penentuan konsentrasi asap cair ditentukan berdasarkan uji hedonik (kesukaan) konsumen. Konsentrasi asap cair yang diujikan adalah 1,0%; 1,5%; 2,0%; dan 2,5%. Pada tahap ini juga dilakukan uji total fenol dari asap cair, air perebus bakso dan bakso ikan dengan konsentrasi 21

7 asap cair terpilih. Hasil pengamatan parameter fisik dan uji hedonik dengan perlakuan terbaik digunakan untuk tahap penyimpanan bakso ikan Tahap Penyimpanan Bakso Ikan. Cara pemberian dan konsentrasi asap cair terbaik berdasarkan pengamatan parameter fisik dan uji hedonik pada tahap sebelumnya, digunakan dalam tahap penyimpanan bakso ikan. Penyimpanan pada suhu kamar dilakukan selama 2 hari dan penyimpanan pada suhu refrigerasi dilakukan selama 20 hari. Penyimpanan pada suhu kamar dilakukan pengamatan dan pengujian pada jam ke-0; 8; 16; 24; 32, dan 40. Penyimpanan dalam refrigerasi dilakukan pengamatan dan pengujian pada hari ke-0; 4; 8; 12; 16; dan 20. Pengamatan dan pengujian yang dilakukan meliputi jumlah total bakteri (TPC), nilai ph, dan kadar air bakso ikan Prosedur Analisis Analisis produk meliputi uji kesukaan (hedonik), total fenol asap cair, air perebus bakso, dan bakso ikan, uji TPC, nilai ph, dan kadar air Uji Hedonik (Rahayu 2001) Uji hedonik bertujuan untuk mengetahui tanggapan panelis terhadap produk. Pelaksanaan uji hedonik ini adalah dengan menyajikan bakso ikan yang telah diberi kode sesuai dengan perlakuannya dan panelis diminta untuk memberikan penilaian pada score sheet yang telah disediakan. Penilaian dilakukan oleh 30 orang panelis. Skala hedonik yang digunakan dalam penelitian ini adalah skala 9, dengan tingkat kesukaan amat sangat suka, sangat suka, suka, agak suka, netral, agak tidak suka, tidak suka, sangat tidak suka dan amat sangat tidak suka. Parameter yang diuji meliputi kesukaan terhadap aroma, warna, rasa, dan kesukaan keseluruhan bakso asap Total Fenol (Kuntjahjawati & Darmadji 2002; Muchuweti et al. 2006) Total Fenol Sampel Cair Sebanyak 1 ml sampel cair dipipet dan dimasukkan ke dalam labu takar, diencerkan dengan akuades sampai volumenya menjadi 100 ml. Sebanyak 0.5 ml campuran dipipet dan ditambahkan dengan 0.25 ml larutan Folin Ciocalteau, 22

8 digojog, kemudian didiamkan pada suhu kamar selama 5 menit. Selanjutnya ditambahkan 2.5 ml larutan 6% Na 2 CO 3, digojog dengan vortex dan didiamkan pada suhu kamar selama 30 menit. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 750 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Total Fenol Sampel Padat Bakso ikan yang sudah dihaluskan ditimbang sebanyak 1 g dan ditambahkan akuades sebanyak 100 ml, disaring, dan filtratnya ditampung dalam erlenmeyer. Selanjutnya dikerjakan seperti sampel cair. Pembuatan Kurva Standar Sebanyak 1 g fenol murni ditimbang, dimasukkan dalam gelas beker, dilarutkan dengan akuades kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan volumenya dijadikan tepat. Larutan tersebut dipipet masing-masing 0.1 sampai 0.6 ml, selanjutnya dikerjakan seperti sampel cair Penentuan total plate count (TPC) (Fardiaz 1993) Prinsip dari pengamatan ini adalah menentukan populasi bakteri yang terdapat pada bahan yang memberikan gambaran tentang bagaimana tingkat kesegaran produk tersebut, karena bakteri merupakan faktor utama penyebab pembusukan bahan. Tahap pertama pada pengujian ini adalah tahap persiapan. Mula-mula sampel dihancurkan, ditimbang secara aseptis sebanyak 5 g, dan dimasukkan dalam 45 ml NaCl 0.85% steril. Larutan yang diperoleh adalah pengenceran 1:10. Kedua adalah tahap inokulasi. Larutan 1:10 dari tahap persiapan kemudian diambil 1 ml untuk dimasukan kedalam cawan petri steril, kemudian ditambahkan larutan media agar yang telah steril bersuhu 45 0 C sebanyak 15 ml dan dibiarkan selama menit sampai agar memadat. Proses ini dilakukan juga dengan cara yang sama pada larutan dengan pengenceran 1:100 sampai 1: , secara duplo. Ketiga adalah tahap inkubasi. Setelah media yang telah diinokulasi memadat, kemudian cawan petri diinkubasi pada suhu 37 0 C dengan posisi terbalik selama 48 jam. Perhitungan jumlah bakteri berdasarkan ISO Standards for microbiological methods (Harrigan 1998), yaitu: c N ( n1 0,1n 2 ). d 23

9 Dimana: c : jumlah seluruh koloni bakteri pada semua cawan yang mengandung koloni n 1 : jumlah cawan petri yang masuk perhitungan pada pengenceran pertama n 2 : jumlah cawan petri yang masuk perhitungan pada pengenceran berikutnya d : faktor pengenceran pertama Nilai ph (AOAC 1995) Penetapan nilai ph dilakukan setelah ph-meter (ORION-410A) dikalibrasi terlebih dahulu. Sampel ditimbang sebanyak 10 g, dicampurkan dengan 100 ml akuades, diblender kemudian disaring. Setelah itu elektroda dibilas dengan akuades dan dikeringkan. Elektroda dicelupkan ke dalam filtrat sampai beberapa saat, hingga diperoleh pembacaan yang stabil, kemudian ph sampel dapat dicatat Kadar air (AOAC 1995) Cawan porselen dikeringkan pada suhu C selama 1 jam, kemudian didinginkan dan ditimbang. Sampel yang akan ditentukan kadar airnya ditimbang sebanyak 5 gram. Cawan yang telah berisi contoh dimasukan ke dalam oven bersuhu C dan ditimbang sampai beratnya konstan. Kadar air dihitung berdasarkan persamaan berikut: berat awal - berat akhir kadar air berat awal x 100% 3.8. Analisis Statistik Pengujian aktivitas antibakteri dan penggunaan asap cair tempurung kelapa terhadap bakso ikan dilakukan sebanyak dua kali ulangan untuk setiap perlakuan. Nilai TPC, ph, dan kadar air dianalisis nilai rata-rata dan nilai standar deviasinya. Uji kesukaan (hedonik) bakso ikan menggunakan Rancangan Acak Kelompok Lengkap (RAKL), bila terdapat beda nyata pada ANOVA, dilanjutkan uji Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada tingkat kepercayaan 95%. 24