STUDI FILOGENETIK Mangifera laurina dan KERABAT DEKATNYA MENGGUNAKAN PENANDA cpdna trnl-f INTERGENIK SPACER (Phylogenetic study of M. laurina and related species based on cpdna trnl-f intergenic spacer) ABSTRACT The phylogeny of Mangifera laurina and the related species were investigated using cpdna intergenic spacer trnl-f sequence of the accession from Indonesia. Rutaceae was chosen as the outgroup. The objective of this study were 1) to reconstruct the phylogenetic relationships of these complex species within Mangifera, and 2) to understand the infraspecific relationships within Mangifera phylogenies with cpdna trnl-f intergenic spacer sequences using maximum parsimony and neighbour joining as the optimal criteria. The result showed that M. laurina from Celebes (mangga Hiku) was placed at the base of the phylogenetic tree of monophyletic group of M. laurina complex. It is suggested that mangga Hiku is the oldest cultivar among M. laurina complex and perhaps it is the progenitor of the complex species. Key word; Mangifera laurina, phylogenetic, cpdna trnl-f intergenic spacer, progenitor, Hiku PENDAHULUAN Klasifikasi mangga berbasis molekuler yang meliputi seluruh jenis dan wilayah di Indonesia belum banyak dilakukan, sehingga informasi filogeni molekuler masih sangat terbatas. Informasi filogeni molekuler sangat penting dalam rangka memperjelas kedudukan sistematika (klasifikasi), konservasi, dan menjadi data dasar keanekaragaman genetik untuk penangkar tanaman mangga dalam rangka perakitan mangga unggul Indonesia. Penggunaan penanda berbasiskan DNA inti seperti E-RAPD menghasilkan pengelompokan antar kultivar mangga M. laurina dan kerabatnya bersifat parafiletik, kultivar-kultivar M. indica dan M. laurina tidak mengelompok pada cabang (klade) yang terpisah. Oleh karena itu perlu dicari penanda yang mengalami perubahan lebih lambat seperti DNA sitoplasmik (DNA kloroplas dan DNA mitokondria). Penanda kloroplas (cpdna) yang banyak digunakan adalah trnl-f intergenic spacer, merupakan bagian dari genom cpdna yang bersifat nonkoding, region ini lebih bervariasi dibanding region koding, sehingga lebih sesuai digunakan dalam mengungkap hubungan evolusi pada tingkat taksa yang lebih
19 rendah (Bayer et al. 2000). Beberapa studi pada daerah non koding kloroplas memperlihatkan variasi yang lebih tinggi dan sering mengalami mutasi (Baldwin et al. 1995) dalam bentuk transversi, transisi, insersi, dan delesi. Daerah intergenic spacer antara trnl (UAA) 3 exon dan gen trnf (GAA) juga berpotensi untuk studi filogenetik (Soltis et al. 1998). Daerah DNA ini mudah diamplifikasi dan disekuen, ukurannya relatif kecil 120-350 bp dan gen kopi tunggal (single copy), sehingga relatif mudah untuk menguji keseluruhan genom. Sekuen daerah trnl-f lebih informatif pada tingkatan marga dan jenis (Alejandro et al. 2005, Barfuss et al. 2005, Shaw et al. 2005). Penggunaan penanda molekuler kloroplas (cpdna) untuk mengungkap keanekaragaman, menelusuri hubungan kekerabatan berdasarkan evolusinya dan memperjelas kedudukan taksa mangga Indonesia belum pernah dilakukan. Penanda ini sangat bermanfaat untuk mendukung data molekuler mangga yang sudah ada sebelumnya, sekaligus untuk memahami evolusi mangga berdasarkan sekuen DNA kloroplas. Informasi evolusi mangga bermakna untuk memprediksi tetua bersama dari mangga yang ada di Indonesia saat ini. Penanda cpdna telah banyak digunakan untuk studi filogeni tanaman lainnya. Misalnya Morus oleh Weiguo et al. (2005), Cucumis spp oleh Chung et al. (2006, 2007). cpdna sering digunakan sebagai penanda karena mudah diisolasi dan dipurifikasi, dikarakterisasi, dan dikloning, dan sangat konservatif dengan laju evolusi yang rendah, sehingga dapat digunakan untuk rekonstruksi filogeni antar taksa pada tingkat famili tumbuhan berbunga (Clegg & Durbin 1990, Kajita et al. 1998). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk meninjau ulang hubungan antar kultivar M. laurina dan M. indica berdasarkan cpdna trnl-f transgenic spacer, memata-matai evolusi yang terjadi pada mangga dan melengkapi data klasifikasi M. laurina dan kerabatnya yang telah disusun sebelumnya. BAHAN DAN METODE Bahan Sampel daun tanaman mangga berasal dari beberapa daerah di Indonesia yang mewakili 4 jenis yang dianalisis pada penelitian ini yaitu Mangga Betoel (M. laurina) dan mangga Depeh (M. aplanata) dari Kalimantan Barat, Golek
20 (M. indica) dan Kiyal (M. indica) dari Jawa Timur, Dodol Ternate (M. laurina) dari Maluku Utara, dan Hiku (M. laurina) dari Sulawesi. M. lalijiwa tidak dilakukan analisis karena panjangnya sekuen data lebih pendek 100 basa dari jenis lain, sehingga menyulitkan dalam perunutan (aligment). Semua spesimen contoh yang digunakan disimpan di Herbarium Bogoriense. Digunakan 11 grup luar (outgrup) anggota famili Rutaceae yaitu; Chisocheton macrophyllus, Guarea macrophylla subsp, Chisocheton divergens, Chisocheton tomentosus, Citrus aurantium, Citrus limon, Guarea guidonia, Guarea glabra, Citrus sinensis, Murraya paniculada, dan Citrus medica. Metode Isolasi DNA Ekstraksi DNA mengikuti prosedur CTAB (Doyle & Doyle 1987) dengan beberapa modifikasi. Sekuen intergenic spacer trnl-f diamplifikasi dengan pasangan primer E dengan urutan basa (GGTTCAAGTCCCTCTATCCC) dan F (ATTTGAACTGGTGACACGAG) (Small et al. 2005). Amplifikasi daerah DNA trnl-f intergenic spacer menggunakan mesin PCR (GeneAmp PCR sistem 2400 Perkin Elmer), sebanyak 35 siklus setelah pra PCR selama 4 menit 95 0 C. Setiap siklus terdiri atas 94 0 C selama 30 detik untuk denaturasi, 52 0 C 30 detik annealing, dan 72 0 C 1 menit untuk ekstensi dan selanjutnya diakhiri post PCR 72 0 C 7 menit. Sekuensing DNA analisis Filogenetik DNA produk PCR diperiksa dalam agarose 1.2% (Gambar 5) setelah itu dipurifikasi, kemudian disekuen dalam reaksi 10µl menggunakan primer trnl-f Small et al. (2005) dengan ABI 377 automated DNA sequencer (Applied Biosystems) di First BASE Laboratories, Malaysia. Setiap sekuen amplikon dibaca dan dibandingkan dengan sekuen DNA Citrus spp (Rutaceae) dari database GenBank menggunakan BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Data sekuen DNA mangga diedit, dijajarkan dan dirunut (alignment) menggunakan program BioEdit 7.0.0.1. Analisis maksimum parsimoni dan maksimum likelihood menggunakan PAUP versi 4.0b8 (Swofford 2002) dengan
21 bootstrap diulang 1000 kali. Kladogram dihasilkan dari analisis Neighbour Joining (Saitou & Nei 1987) menggunakan program Phylip 3.67. HASIL DAN PEMBAHASAN Sebanyak 433 pasang basa (bp) hasil sekuen trnl-f intergenic spacer yang dihasilkan dari 6 aksesi mangga dan 11 grup luar (outgroup). Semua karakter diberi bobot yang sama, terdapat 357 karakter konstan, 7 karakter parsimoni tidak informatif, dan 69 karakter parsimoni informatif. Khusus untuk mangga, rata-rata komposisi basa nukleotidanya adalah: A (0.3014), T (0.3316), C (0.206) dan G (0.1608). Nilai tengah kandungan G+C adalah 0.3668 yang menunjukkan bahwa sekuen daerah antara (spacer) merupakan daerah yang kaya nukleotida AT. DNA hasil amplifikasi dengan cpdna disajikan pada Gambar 5. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Gambar 5. DNA produk PCR yang diperiksa dalam agarose 1,2% Ket.: M= marker1kb, 1=Hiku(M. laurinahk), 2=Depeh(M. aplanata), 3=Golek(M. indicag), 4=Betoel(M. laurinab), 5=Madu(M. lalijiwam), 6=Dodol ternate(m. laurinad), 7=Kiyal(M.indicaKY), 8=Lalijiwa(M. lalijiwal), dan 9=Kates(M. indicak) Perunutan berulang (Multiple alignment) dilakukan untuk menentukan nilai kesamaan dan tingkat homologinya. Perunutan sekuen nukleotida cpdna trnl-f pada semua aksesi mangga menunjukkan homologi yang sangat tinggi (99%). Nilai ini jauh lebih tinggi dibanding tingkat homologi 14 spesies famili Anacardiaceae yaitu 75% pada daerah ITS-1 genom inti (Hidayat & Pancoro 2001). Tingginya homologi sekuen trnl-f intergenic spacer pada M. laurina dan kerabat dekatnya disebabkan karena dekatnya kekerabatan aksesi mangga yang
22 diamplifikasi dan cpdna yang lebih konservatif dibandingkan DNA inti dan diwariskan secara uniparental. Namun demikian, perubahan dapat digunakan untuk memperkirakan pola homologi fragmen cpdna (Raubeson & Jansen 2005). Perubahan ini dapat juga digunakan untuk merujuk hubungan kekerabatan antara keturunan dan mendukung tipe dan pola proses mutasi yang mempengaruhi gen dalam genom kloroplas. Meskipun cpdna umumnya konservatif, diversitas cpdna telah dilaporkan terjadi pada spesies tanaman yang berbeda seperti Fagopyrum cymosum, Astragalus sp, Conifers dan jenis yang berbeda pada Dipterocarpaceae (Yamane et al. 2003, Liston 2008, Tsumura et al. 1996). Variasi yang terjadi pada cpdna biasanya disebabkan oleh mutasi nukleotida tunggal yang merepresentasikan mutasi yang terjadi dalam jangka waktu lama pada waktu silam. Kecepatan mutasi lokus cpdna antara 3.2 x 10-5 dan 7.9 x 10-5 (Provan et at. 1999). Perubahan basa pada cpdna meskipun dalam jumlah yang sangat kecil dibanding genom inti, tetap bermakna penting dalam menyediakan sejumlah informasi untuk menjelaskan proses evolusi. Gap terjadi karena adanya insersi dan delesi (Baldwin 1993). Pada grup dalam (ingroup) terjadi delesi pada basa no. 2 dan 59 pada aksesi Hiku, insersi terjadi pada basa ke-5 dan 431 (A T). Pada aksesi Depeh (M. aplanata), insersi terjadi pada basa no.421 (C G) dan ke-431 (A T). Pada aksesi Golek (M. indica), insersi terjadi pada basa ke-431 (A T). Insersi dan delesi (indel) merupakan kode untuk merujuk posisi homologi, selangnya berkisar antara 1-19 basa. Perubahan sekuen cpdna pada tingkat taksa yang lebih rendah seperti spesies dan intra spesies terjadi dengan laju sangat rendah (<1%). Perubahan pada level nukleotida ini dapat digunakan untuk merekonstruksi pohon filogeni. Terjadinya indel pada Hiku (M. Laurina). mendukung pembentukan percabangan pada grup dalam. Konfirmasi identitas sekuen trnl-f intergenic spacer dilakukan dengan BLAST di GenBank. Berdasarkan pencarian BLAST, diidentifikasi bahwa daerah sekuen cpdna trnl-f M. laurina dan kerabatnya diturunkan dari sekuen Anacardiaceae yang dibuktikan dengan tingkat kemiripan hasil sekuen anggota mangga sebesar 91% dengan Rhus caryophila dan 94% dengan Pistacio weinmaniifolia yang juga merupakan anggota famili Anacardiaceae. Hasil ini
23 menunjukkan kemungkinan bahwa sekuen basa trnl-f M. laurina dan kerabatnya diturunkan dari cpdna trnl-f moyang umum (common ancestor) Anacardiaceae. Rekonstruksi pohon filogeni berdasarkan daerah trnl-f menggunakan PAUP maksimum parsimoni menghasilkan pohon yang disajikan pada Gambar 6. Nilai konsistensi indek (CI) 0.9625 atau apomorfi ciri sebesar 96.25%, nilai retensi indeks (RI) 0.99, sedangkan homoplasi indeks (HI) sebesar 0,0375. Nilai ini menunjukkan bahwa homoplasi terjadi hanya 3.75%. Konfirmasi pengelompokan M. laurina dan kerabatnya dilakukan dengan BLAST terhadap 11 anggota famili Rutaceae dan dijadikan sebagai outgrup. Dibanding grup luar (outgroup), ukuran daerah trnl-f mangga menunjukkan kesesuaian dengan famili Rutaceae. Enam taksa grup dalam (ingroup) membentuk kelompok yang monofiletik, terpisah dari 11 taksa group luar dari famili Rutaceae yang digunakan dalam analisis filogeni. Pohon filogeni hasil analisis parsimoni (PAUP) membentuk tiga cabang. Cabang pertama ditempati oleh M. laurina dan kerabatnya yang mengelompok terpisah dari grup luar dengan nilai bootstrap 100% dan merupakan kelompok yang monofiletik atau berasal dari moyang yang sama. Kelompok ini mangga Hiku (M. laurinahk) yang berasal dari Sulawesi Tenggara berada pada pangkal percabangan dan berpisah dari anggota kelompok lainnya dengan perubahan basa Adenin menjadi Timin pada posisi basa ke lima, sedangkan mangga Betoel (M. laurinab) asal Kalimantan Barat berpisah dengan anggota kelompok mangga lainnya pada basa Timin menjadi Adenin posisi ke-421, mangga Golek (M. indicag) asal Jawa Timur mengalami perubahan basa Adenin menjadi Guanin pada posisi basa ke 189 dan mangga Depeh (M. aplanata) asal Kalimantan Barat mengalami perubahan basa Adenin menjadi Timin pada posisi 421 dan berada pada ujung percabangan atau pada tingkat evolusi yang lebih maju. Dua anggota lainnya Dodol Ternate (M. laurinad) asal Ternate dan Kiyal (M. indicaky), asal Jawa Timur berada pada posisi antara mangga Hiku dan mangga Betoel. Cabang ke-2 ditempati oleh Chisocheton dan Guerea, sedangkan kelompok ke-3 oleh jenis-jenis Citrus, dengan nilai bootsrap masing-masing 100%. Posisi semua anggota famili Rutaceae pada kladogram, mendukung pembentukan topologi pohon filogeni karena jenis-jenis mangga dikelompokkan secara terpisah dari group luarnya.
24 421 (T-A) 189 (A-G) 421 (C-G) 431(C-A) 5 (A-T) mangga outgroup Gambar 6. Kladogram 6 aksesi mangga dan grup luarnya berdasarkan penanda trnl-f Berdasarkan analisis Neighbour Joining (Saitou & Nei 1987) pada Gambar 7, Hiku (M. laurinahk) mempunyai ruas (node) terpanjang dan muncul lebih awal dibanding kerabatnya, sehingga Hiku diduga sebagai tetua bersama dari M. laurina dan kerabatnya. Panjang tangkai menggambarkan jarak sekuen dan kosiderasi umur molekuler (molecular clock). Dengan demikian, mangga Hiku merupakan aksesi dengan umur molekuler yang lebih kuno yang tumbuh liar di Sulawesi Tenggara. Morfologi buah mangga Hiku mirip dengan M. indica tetapi memiliki rasa sangat asam, berserat kasar, daging buah berwarna kuning muda. Gambaran morfologi mangga Hiku ini lebih primitif dibanding mangga lainnya. Pola pengelompokan M. laurina dan kerabatnya berdasarkan penanda morfologi, E-RAPD, dan kombinasinya memperlihatkan pengelompokan yang berbeda dengan penanda trnl-f. Mangga Hiku berada dalam kelompok M. laurina. Fenomena cpdna tidak harus berhubungan dengan morfologi (misalnya bentuk buah) yang sama, dan demikian sebaliknya. Pola keragaman yang ditunjukkan oleh penanda kloroplas dapat berbeda dengan pola keragaman yang
25 ditunjukkan oleh penanda morfologi. Kloroplas diwariskan hanya dari tetua betina, sedangkan morfologi selain diwariskan kedua tetua juga dipengaruhi lingkungan. Gambar 7. Kladogram 6 aksesi mangga berdasarkan penanda trnl-f dengan metode Neighbour Joining (Saitou & Nei 1987) Analisis penanda cpdna trnl-f intergenic spacer terhadap enam aksesi mangga Betoel (M. laurinab), Depeh (M. aplanata), Golek (M. indicag), Hiku (M. laurinahk), Dodol Ternate (M. laurinad), Kiyal (M. indicaky), tidak sejalan dengan pengelompokan berdasarkan penanda morfologi seperti yang dikemukakan oleh Kostermans & Bompard (1993). SIMPULAN Analisis filogeni berdasarkan cpdna trnl-f intergenic spacer menunjukkan bahwa M. laurina dan kerabatnya mengelompok secara monofiletik dan terpisah dari kelompok group luarnya. Penanda ini tidak mengelompokkan kultivar mangga berdasarkan jenisnya. M. laurinahk (Hiku) diduga sebagai tetua bersama dari M. laurina dan kerabatnya.