1 BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental laboratorium. B. Lokasi Penelitian Ekstraksi dilakukan di Lembaga Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas Gadjah Mada Yogyakarta, sedangkan kultur Candida albicans dan lokasi penelitian dilakukan di Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret. C. Subjek Penelitian Subjek yang digunakan dalam penelitian ini adalah biakan Candida albicans murni dari Laboratorium Parasitologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Sebelas Maret, Surakarta.
2 D. Rancangan Penelitian 1. Tahap Uji Pendahuluan Subkultur Candida albicans Diinokulasikan di media pembiakan Sabouraud Dextrose Agar ( 12 cawan petri ) 1 cawan petri dibuat 3 sumuran untuk pemberian perlakuan Ekstrak etanolik daun kemangi dan daun seledri dengan konsentrasi 1,7 gr/ml ; 0,85 gr/ml ; 0,425 gr/ml ; 0,2125 gr/ml dan 0,10625 gr/ml. Kontrol (+) : Ketokonazol 25µg ; Kontrol (-) : Double destilated water steril Inkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam Terbentuk zona hambat Dasar untuk tahap penelitian
3 2. Tahap Penelitian Subkultur Candida albicans Diinokulasikan di media pembiakan Sabouraud Dextrosa Agar (13 cawan petri) 1 cawan petri dibuat 3 sumuran untuk pemberian perlakuan Ekstrak etanolik daun seledri dengan konsentrasi hasil dari uji pendahuluan, digunakan 5 konsentrasi. Ekstrak etanolik daun kemangi dengan konsentrasi hasil dari uji pendahuluan, digunakan 5 konsentrasi. Potensiasi campuran antara ekstrak etanolik daun seledri dengan daun kemangi, dengan konsentrasi dosis optimum hasil uji pendahuluan. Kontrol (+) : Ketokonazol 25µg ; Kontrol (-) : Double destilated water steril Inkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam Terbentuk zona hambat Uji statistik Gambar 2. Rancangan Penelitian
4 E. Klasifikasi Variabel 1. Variabel bebas a. Konsentrasi ekstrak etanolik seledri b. Konsentrasi ekstrak etanolik kemangi 2. Variabel terikat Zona hambat pertumbuhan Candida albicans 3. Variabel luar (pengganggu) a. Terkendali 1) Jenis jamur 2) Umur jamur 3) Jumlah sel dan bagian jamur 4) Suhu pemeraman 5) Kecepatan pertumbuhan Candida albicans 6) Lama penyimpanan seledri dan kemangi 7) Lokasi penanaman seledri dan kemangi 8) Pertumbuhan kuman kontaminan F. Definisi Operasional Variabel 1. Variabel bebas a. Konsentrasi ekstrak etanolik seledri Ekstrak etanolik adalah ekstrak yang menggunakan etanol sebagai pelarutnya. Dimana dalam hal ini digunakan pelarut etanol 70%. Penggunaan kata ekstrak etanolik juga sudah dilakukan pada penelitian sebelumnya, sebagai contoh adalah
5 pada penelitian yang dilakukan oleh Nirmala, 2013 dan Mukti, 2009. Ekstrak daun seledri didapatkan dari daun seledri yang didapatkan dari Pasar Gedhe Surakarta, yang selanjutnya dijemur/dikeringkan kemudian diekstraksi di Lembaga Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanolik 70%, yang selanjutnya dibagi ke dalam 5 konsentrasi pengenceran. Konsentrasi pengenceran yang digunakan pada uji pendahuluan, berdasarkan pada jumlah ekstrak yang digunakan untuk penelitian ini. Karena tidak berpedoman pada penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya, dimana pada penelitian ini terdapat perbedaan lokasi penanaman tumbuhan serta berat daun yang digunakan untuk ekstraksi. b. Konsentrasi ekstrak etanolik kemangi Ekstrak etanolik adalah ekstrak yang menggunakan etanol sebagai pelarutnya. Dimana dalam hal ini digunakan pelarut etanol 70%. Penggunaan kata ekstrak etanolik juga sudah dilakukan pada penelitian sebelumnya, sebagai contoh adalah pada penelitian yang dilakukan oleh Nirmala, 2013 dan Mukti, 2009.
6 Ekstrak daun kemangi didapatkan dari daun kemangi yang didapatkan dari Pasar Gedhe Surakarta, yang selanjutnya dijemur/dikeringkan kemudian diekstraksi di Lembaga Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanolik 70%, yang selanjutnya dibagi ke dalam 4-5 konsentrasi pengenceran. Konsentrasi pengenceran yang digunakan, berdasarkan pada jumlah ekstrak yang digunakan untuk penelitian ini. Konsentrasi pengenceran yang digunakan pada uji pendahuluan, berdasarkan pada jumlah ekstrak yang digunakan untuk penelitian ini. Karena tidak berpedoman pada penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya, dimana pada penelitian ini terdapat perbedaan lokasi penanaman tumbuhan, berat daun yang digunakan untuk ekstraksi serta metode ekstraksinya. 2. Variabel terikat Zona hambat pertumbuhan Candida albicans merupakan diameter daerah halo atau zona jernih di sekitar sumuran yang diukur dalam skala milimeter yang menggambarkan hambatan pertumbuhan Candida albicans. Pengukuran zona hambat termasuk diameter sumuran sebesar 5 milimeter. Variabel ini memiliki skala rasio.
7 3. Variabel luar (pengganggu) 1) Terkendali a. Jenis jamur Jamur diambil dari biakan murni Candida albicans yang diambil dari Laboratorium Parasitologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Sebelas Maret, Surakarta. Jenis jamur dikendalikan dengan mengidentifikasi pembentukan germ tube Candida albicans yang dimasukkan ke dalam tabung berisi serum terdialisasi. b. Umur jamur Umur jamur dikendalikan dengan membuat subkultur Candida albicans yang berumur 2 hari dilakukan dengan perkiraan subkultur Candida albicans sudah mencapai fase pertumbuhan eksponensial. c. Jumlah koloni Candida albicans Penanaman jamur menggunakan standar 0,5 Mc.Farland. standar Mc.Farland ini dipakai agar diperoleh jumlah koloni Candida albicans yang seragam sebelum ditanam pada Sabouraud Dextrose Agar. d. Suhu pemeraman
8 Suhu pemeraman dapat diatur dengan memasukkan cawan petri berisi Candida albicans ke dalam inkubator yang telah diatur pada suhu 37ºC. e. Kecepatan pertumbuhan Candida albicans Kecepatan pertumbuhan dikendalikan dengan suhu pemeraman yang sama, yaitu selama 2 hari yang sebelumnya mengalami pemeraman dalam inkubator bersuhu 37ºC. f. Lama penyimpanan seledri dan kemangi Daun seledri dan kemangi yang digunakan diperoleh dari Pasar Gedhe Solo, dimana tanaman tersebut baru diantarkan pada pagi hari, lalu sebelum mengalami ekstraksi daun seledri dan daun kemangi disimpan selama 2 hari. Sehingga total keseluruhan waktu penyimpanan seledri dan kemangi adalah selama 2 hari. g. Lokasi penanaman seledri dan kemangi Lokasi penanaman seledri dan kemangi adalah di Tawangmangu, dengan ketinggian lokasi penanaman kurang lebih 1.700 meter di atas permukaan laut dengan tekstur tanah yang gembur. h. Pertumbuhan kuman kontaminan Kuman kontaminan yang dapat tumbuh selama dilakukan penelitian, dikendalikan dengan mencampurkan kloramfenikol saat media pembiakan masih dalam bentuk cair.
9 G. Instrumentasi Penelitian 1. Alat penelitian Alat penyerbuk, magnetic strirer, corong buchner, vacuum rotary evaporator, erlenmeyer, waterbath, autoclave, neraca timbangan, conicle tube, cawan petri diameter 10 cm, inkubator, vernier calliper, mikropipet, perforator besi, oshe kolong dan lampu spiritus. 2. Bahan penelitian Ekstrak etanolik daun seledri, ekstrak etanolik daun kemangi, biakan Candida albicans, Sabouraud Dextrose Agar dan ketokonazol. H. Cara Kerja Penelitian 1. Tahap persiapan a. Pembuatan ekstrak etanolik seledri Daun seledri yang telah dipisahkan dari batangnya, dicuci bersih dengan air mengalir kemudian ditiriskan dan ditimbang berat basahnya sebanyak 1.300 mg. Kemudian dikering anginkan dan dilanjutkan dengan pengeringan menggunakan oven pada suhu 40ºC hingga kadar airnya berkurang. Selanjutnya ekstrak daun seledri yang telah dikeringkan tadi
10 dihaluskan dengan blender kemudian diayak. Hasil ayakan kemudian diekstraksi dengan pelarut etanolik 70% dengan metode maserasi, yaitu serbuk daun seledri yang diperoleh dimasukkan ke dalam beaker glass dan ditambahkan pelarut etanol 70%, ditutup dan dibiarkan terendam selama 3 hari dan terlindung dari cahaya matahari. Ekstrak kemudian disaring sehingga didapat maserat (Filtrat I) dan residunya diremaserasi dengan etanol sesuai dengan konsentrasinya yaitu 70%, menggunakan prosedur yang sama, maserasi dilakukan selama 2 hari sampai diperoleh maserat yang jernih (Filtrat II). Selanjutnya semua maserat etanol digabungkan (Filtrat I + Filtrat II) dan diuapkan dengan menggunakan alat penguap Rotary evaporator pada temperatur 40ºC dan dilanjutkan dengan pengeringan dengan menggunakan waterbath pada suhu 40ºC sehingga menghasilkan ekstrak kental. Ekstrak kental ini selanjutnya harus melalui proses pengenceran agar dapat digunakan pada media pembiakan Candida albicans. Dari total 17 gram hasil ekstrak kental yang dimiliki, akan digunakan seluruhnya untuk membuat stok ekstrak yang akan digunakan untuk pengenceran. Kemudian dengan rumus perhitungan seperti di bawah ini, stok ekstrak tadi
11 diencerkan hingga didapatkan konsentrasi 1,7 gr/ml ; 0,85 gr/ml ; 0,425 gr/ml ; 0,2125 gr/ml dan 0,10625 gr/ml. V1. N1 = V2. N2 V1 = volume awal (ml) N1 = konsentrasi awal (mg/ml) V2 = volume akhir (ml) N2 = konsentrasi akhir (mg/ml) (Puspitawati, 2010) b. Pembuatan ekstrak etanolik kemangi Daun kemangi yang telah dipisahkan dari batangnya, dicuci bersih dengan air mengalir kemudian ditiriskan dan ditimbang berat basahnya sebanyak 1.300 mg. Kemudian dikering anginkan dan dilanjutkan dengan pengeringan menggunakan oven pada suhu 40ºC hingga kadar airnya berkurang. Selanjutnya ekstrak daun kemangi yang telah dikeringkan tadi dihaluskan dengan blender kemudian diayak. Hasil ayakan kemudian diekstraksi dengan pelarut etanol 70% dengan metode maserasi, yaitu serbuk daun kemangi yang diperoleh dimasukkan ke dalam beaker glass dan ditambahkan pelarut etanol 70%, ditutup dan dibiarkan terendam selama 3 hari dan terlindung dari cahaya matahari. Ekstrak kemudian disaring sehingga didapat maserat (Filtrat I) dan residunya diremaserasi dengan etanol sesuai dengan konsentrasinya yaitu 70%, menggunakan prosedur yang
12 sama, maserasi dilakukan selama 2 hari sampai diperoleh maserat yang jernih (Filtrat II). Selanjutnya semua maserat etanol digabungkan (Filtrat I+ Filtrat II) dan diuapkan dengan menggunakan alat penguap Rotary evaporator pada temperatur 40ºC dan dilanjutkan dengan pengeringan dengan menggunakan waterbath pada suhu 40ºC sehingga menghasilkan ekstrak kental. Ekstrak kental ini selanjutnya harus melalui proses pengenceran agar dapat digunakan pada media pembiakan Candida albicans. Dari total 17 gram hasil ekstrak kental yang dimiliki, akan digunakan seluruhnya untuk membuat stok ekstrak yang akan digunakan untuk pengenceran. Kemudian dengan rumus perhitungan seperti di bawah ini, stok ekstrak tadi diencerkan hingga didapatkan konsentrasi 1,7 gr/ml ; 0,85 gr/ml ; 0,425 gr/ml ; 0,2125 gr/ml dan 0,10625 gr/ml. V1. N1 = V2. N2 V1 = volume awal (ml) N1 = konsentrasi awal (mg/ml) V2 = volume akhir (ml) N2 = konsentrasi akhir (mg/ml) (Puspitawati, 2010) 2. Tahap uji pendahuluan a. Pembuatan media pembiakan
13 Pembuatan media pembiakan menggunakan media Sabouraud Dextrose Agar. Untuk 1 cawan petri berdiameter 10cm, diasumsikan media yang masih cair yang dibutuhkan adalah sebanyak 30ml. Media yang masih cair tadi harus disterilisasikan terlebih dahulu dengan menggunakan autoclave pada suhu 121ºC selama 15 menit. Setelah itu, media yang masih cair tersebut dituangkan ke dalam 12 cawan petri dan kemudian dibiarkan hingga memadat. b. Pembuatan ketokonazol 25µg Ketokonazol 25µg didapatkan dari kapsul yang berisi ketokonazol 150mg yang dilarutkan dalam aquades 100ml. Perhitungan : V1. N1 = V2. N2 50ml. 0,15 = V2. 25µg/ml V2 = 0,3ml V1 = volume awal (ml) N1 = konsentrasi awal (mg/ml) V2 = volume akhir (ml) N2 = konsentrasi akhir (mg/ml) (Puspitawati, 2010) c. Penanaman Candida albicans Tahap ini dimulai dengan pengambilan koloni Candida albicans dari tabung reaksi dengan menggunakan oshe kolong.
14 Koloni tadi dioleskan secara merata pada agar pembiakan, masing masing sebanyak 4 kali pengolesan yang dilakukan merata pada seluruh permukaan agar. d. Pemberian perlakuan Media pembiakan yang telah diinokulasi dengan Candida albicans dibuat 3 sumuran dengan diameter 5mm. Pada masingmasing sumuran, diisi dengan ekstrak etanolik daun kemangi, ekstrak etanolik daun seledri dengan konsentrasi 1,7 gr/ml ; 0,85 gr/ml ; 0,425 gr/ml ; 0,2125 gr/ml dan 0,10625 gr/ml, kontrol positif serta kontrol negatif. Cawan petri diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. e. Pengukuran diameter zona hambat dalam satuan mm di bagian bawah cawan petri. f. Tabulasi data. g. Pada uji pendahuluan ini akan didapatkan konsentrasi ekstrak etanolik daun kemangi dan ekstrak etanolik daun seledri yang memiliki hasil zona hambat pertumbuhan koloni yang paling mendekati dengan ketokonazol, yang selanjutnya konsentrasi tersebut akan digunakan pada tahap penelitian. 3. Tahap penelitian
15 a. Pembuatan media pembiakan Pembuatan media pembiakan menggunakan media Sabouraud Dextrose Agar yang masih cair. Untuk 1 cawan petri berdiameter 10cm, diasumsikan media yang masih cair yang dibutuhkan adalah sebanyak 30ml. Media yang masih cair tadi harus disterilisasikan terlebih dahulu dengan menggunakan autoclave pada suhu 121ºC selama 15 menit. Setelah itu, media yang masih cair tersebut dituangkan ke dalam 13 cawan petri dan kemudian dibiarkan hingga memadat. b. Pembuatan ketokonazol 25µg Ketokonazol 25µg didapatkan dari kapsul yang berisi ketokonazol 150mg yang dilarutkan dalam aquades 100ml. Perhitungan pengenceran flukonazol 25µg sama dengan tahap uji pendahuluan. c. Penanaman Candida albicans Tahap ini dimulai dengan pengambilan koloni Candida albicans dari tabung reaksi dengan menggunakan oshe kolong. Koloni tadi dioleskan secara merata pada agar pembiakan, masing masing sebanyak 4 kali pengolesan yang dilakukan merata pada seluruh permukaan agar. d. Pemberian perlakuan Media pembiakan yang telah diinokulasi dengan Candida albicans dibuat 3 sumuran dengan diameter 5mm. Pada masing-
16 masing sumuran, diisi dengan ekstrak etanolik daun seledri dan ekstrak etanolik daun kemangi dengan konsentrasi yang didapatkan dari hasil uji pendahuluan sebelumnya, potensiasi campuran antara ekstrak etanolik daun kemangi dengan daun seledri, kontrol positif serta kontrol negatif. Cawan petri diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. e. Pengukuran diameter zona hambat dalam satuan mm di bagian bawah cawan petri. f. Tabulasi data. g. Analisis data. h. Uji Statistik Data dianalisis menggunakan uji t-test kemudian menggunakan regresi linier, dengan uji statistika parametrik yang bertujuan untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan rata-rata antara lebih dari dua group sampel, yaitu uji two way Anova. Selanjutnya semua pengolahan data dilakukan dengan menggunakan program SPSS for Windows 17.0.