METODOLOGI Tempat dan waktu penelitian Penelitian dilakukan di lahan bekas penambangan timah PT. Koba Tin, Koba-Bangka, dan Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi IPB (PPSHB IPB). Penelitian dilakukan mulai bulan Juni 2007 sampai bulan Mei 2008. Bahan dan Alat Bahan penelitian yang digunakan di lapangan adalah keragaman vegetasi, serasah daun, dan sampel tanah, sedangkan di laboratorium adalah media isolasi fungi seperti Low Carbon Agar + Rose Bengal (LCA), Carboxymethyl Cellulose Agar (CMC), dan Alkali Lignin, alkohol, dan lain-lain Peralatan yang digunakan di lapangan adalah kompas, meteran, tali rafia, sekop, plastik, dan alat tulis, sedangkan di laboratorium adalah mikroskop, cawan petri, tabung reaksi, dan lain-lain. Pengukuran Parameter Ekologi Parameter ekologi yang diukur pada lokasi penelitian antara lain kerapatan, frekuensi, dominasi, dan indeks nilai penting masing-masing tumbuhan. Analisis vegetasi yang dilakukan dengan penentuan kurva jenis area dan metode kuadrat (Cox 2002; Setiadi 1998; Kusmana 1997). Kurva jenis area untuk mengetahui berapa % penambahan jenis tumbuhan. Metode kuadrat untuk mengetahui komposisi jenis, peranan dan struktur suatu tipe vegetasi yang diamati. a. Pengukuran kerapatan dan kerapatan relatif masing-masing pohon dilakukan setelah data lapangan dikumpulkan melalui metode kuadrat. Nilai kerapatan dan kerapatan relatif masing-masing jenis ditentukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut: Kerapatan jenis (K) Jumlah individu suatu jenis = Luas total petak contoh
K suatu jenis K. Relatif (KR) = x 100% K total seluruh jenis b. Pengukuran nilai frekuensi dan frekuensi relatif masing-masing jenis dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut: Dominansi (D) = Luas penutupan suatu jenis Luas petak contoh D. Relatif (DR) D suatu jenis = x100% D seluruh jenis c. Pengukuran nilai dominasi mutlak dan dominasi relatif masing-masing jenis dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut: Frekuensi (F) Jumlah petak yang diduduki jenis = Jumlah seluruh petak contoh F. Relatif (FR) F suatu jenis = x100 % F seluruh jenis d. Menghitung Indeks Nilai Penting (INP) masing-masing jenis dengan cara menjumlahkan nilai kerapatan relatif, frekuensi relatif dan dominasi relatif masing-masing jenis. Rumus yang digunakan adalah: INP a = KR a + FR a + DR a Dimana : INP a = Indeks nilai penting jenis tertentu KR a = Nilai kerapatan relatif jenis tertentu FR a = Nilai frekuensi relatif jenis tertentu DR a = Nilai dominasi relatif jenis tertentu Lokasi penelitian ditentukan dengan mempertimbangkan keragaman lokasi seperti hutan sekunder dan lahan bekas tambang yang telah direvegetasi dengan usia 0, 3, 16 dan 28 tahun. Penempatan plot dilakspancang secara acak berdasarkan peta wilayah dan hasil survei di lapangan. Metode penempatan plot menggunakan metode garis berpetak, dengan pengambilan contoh kuadrat (Dombois et al. 1974; Setiadi 1998; Kusmana 1997) dan penempatan jalur/transek secara purposive (Gambar 3).
Plot 1 Plot 2 20 m dst 10 m d c b a Keterangan : a. plot 1m x1m untuk tumbuhan bawah dan semai b. plot 2m x 2m untuk pancang c. plot 10m x 10m untuk tiang d. plot 20m x 20m untuk pohon Gambar 3 Desain unit contoh vegetasi dalam Metode Kuadrat. Pada inventarisasi vegetasi perlu dibedakan antara fase pertumbuhan seedling (semai), sapling (pancang), pole (tiang), dan tree (pohon). Adapun perbedaanya adalah: a. Seedling (semai) permudaan mulai kecambah sampai tinggi 1,5 m. b. Sapling (pancang) permudaan yang tingginya >1,5 m dan berdiameter < 10 cm. c. Pole (tiang) pohon-pohon muda yang berdiameter 10-20 cm. d. Tree (pohon) pohon dewasa dengan diameter >20 cm. Pemilihan sampel pohon untuk pengambilan serasah daun diutamakan tumbuhan dan yang memiliki Nilai Indeks Penting (INP) tinggi karena merupakan jenis yang dominan sehingga penetapannya sebagai sampel diharapkan mewakili semua jenis pohon di lokasi penelitian. Identifikasi dilakukan langsung di lokasi penelitian untuk menentukan nama ilmiah dan nama lokal masing-masing jenis tumbuhan yang ditemukan. Jika terdapat kesulitan untuk mengidentifikasi jenis tumbuhan tertentu, maka dilakukan koleksi terhadap sampel tumbuhan dan identifikasi lebih lanjut di Herbarium Bogoriense.
Pengukuran Produksi Serasah Produksi serasah diukur dengan menggunakan jaring penampung serasah (litter trap) berukuran 1m x 1m dan ditempatkan di bawah kanopi masing-masing pohon yang terpilih sebagai sampel penelitian (Gambar 4). Jumlah dan jenis pohon ditentukan kemudian berdasarkan hasil pemilihan yang ada di lokasi penelitian dan dilakukan dengan 3 kali ulangan untuk masing-masing jenis pohon. Serasah yang tertampung dalam jaring penampung diambil setiap hari selama 3 minggu. Serasah daun ditampung dalam kantong plastik dan diberi label. Lalu ditimbang berat basahnya, dikeringkan dalam oven pengering selama 4 hari atau sampai beratnya tetap, pada suhu 70 o C. Kemudian serasah kering tersebut ditimbang dengan alat timbangan. Parameter yang diukur adalah berat serasah pada masing-masing penampungan serasah dengan menggunakan satuan gram/m 2 /hari (Arrijani 2006; Francesca et al. 2005). Gambar 4 Jaring penampung serasah (Litter trap) yang digunakan untuk menapung serasah yang jatuh dari pohon di beberapa lokasi penelitian. Pendugaan Laju Dekomposisi Serasah Untuk menghitung laju dekomposisi serasah digunakan litter bag yang terbuat dari kantong nylon dengan pori 1 mm dengan ukuran 20 x 30 cm. Kantong ini diisi dengan 10 gram serasah daun kering dan kantong-kantong diberi label, kemudian diletakan diatas permukaan tanah berdekatan dengan pohon sampel (Gambar 5). Jumlah kantong yang dipasang disetiap lokasi tergantung hasil pengamatan analisis vegetasi. Kantong yang diambil dan diamati setelah 7 hari, 14 hari, dan 21 hari. Serasah daun yang tersisa dalam kantong ditimbang dan selanjutnya dikeringkan dalam oven pada suhu 70 o C selama 4 hari atau sampai beratnya tetap (Olson 1963; Das 2003).
Gambar 5 Kantong serasah (Litter bag) yang digunakan untuk penempatan serasah di beberapa lokasi penelitian. Perhitungan laju dekomposisi diperoleh dari perhitungan yang dilakukan oleh Olson (1963) yaitu dengan rumus: Xt ln kt = Xo. e Xt (1) ( Xt ) = kt Xo Adapun penentuan lama masa serasah terdapat (residience time) di lantai hutan digunakan rumus: 1 k (2) Dengan pengertian: Xt = bobot kering serasah setelah waktu pengamatan ke-t (g) Xo = bobot serasah awal (g) e = bilangan logaritma natural (2,72) k = laju dekomposisi serasah t = waktu pengamatan (hari) Pengambilan Sampel Tanah Sampel tanah komposit secara diagonal pada masing-masing lokasi penelitian diambil dengan menggunakan bor tanah berdiameter 5 cm pada kedalaman 0 20 cm untuk analisis rutin tanah. Sampel tanah untuk masingmasing lokasi diambil dari 10 petak sampel yang digunakan untuk analisis vegetasi. Sampel tanah tersebut dianalisis kesuburan tanahnya di Laboratorium Balai Penelitian Tanah, Bogor.
Teknik pengambilan sampel tanah (rizosfer) untuk isolasi fungi dilakukan dengan cara diambil bagian rizosfer tumbuhan pada kedalaman 0 20 cm dengan menggunakan bor tanah berdiameter 5 cm. Sampel tanah (rizosfer) tersebut dikeringudarakan, diisolasi, dan diidentifikasi di Laboratorium PPSHB IPB. Rizosfer diambil dari daerah yang belum ditambang dan beberapa daerah hasil revegetasi. Pengambilan Sampel Akar Pada pengambilan sampel akar tumbuhan (rizoplan) untuk isolasi fungi dilakukan dengan cara menentukan ujung perakaran dari tumbuhan tersebut, lalu diambil akarnya dengan menggunakan bor tanah berdiameter 10 cm. Akar yang diperoleh dibersihkan dari tanah dan kotoran, lalu disimpan dalam plastik berlabel. Rizoplan diambil dari beberapa tumbuhan hasil analisis vegetasi yang memiliki INP tinggi pada setiap lokasi penelitian. Pengambilan Sampel Serasah Isolasi serasah untuk identifikasi fungi diambil dari daun segar sebagai kontrol, serasah yang tertampung pada litter trap sebagai serasah minggu ke-0. Sedangkan sisa serasah pada litter bag yang diambil pada hari ke-7 sebagai serasah minggu ke-1, sisa serasah pada litter bag yang diambil pada hari ke-14 sebagai serasah minggu ke-2, dan sisa serasah pada litter bag yang diambil pada hari ke-21 sebagai serasah minggu ke-3. Serasah daun yang diambil tersebut berasal dari beberapa tumbuhan hasil analisis vegetasi yang memiliki INP tinggi pada setiap lokasi penelitian. Isolasi fungi a. Rizosfer dan rizoplan Isolasi fungi rizosfer dengan teknik pengenceran. Sampel tanah ditimbang sebanyak 1g kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml dengan perbandingan 1:10 (bobot/volume) sampai pengenceran 10 3 kali dan dikocok dengan vortex selama 10-20 menit. Suspensi dari pengenceran 10 3 diambil sebanyak 50µl dan disebar pada media LCA yang mengandung antibiotik dan
rose bengal, media CMC, dan media Alkali Lignin, dengan masing-masing media 3 kali ulangan. Cawan kemudian diinkubasi pada suhu 27 o C selama 5 hari. Pengamatan dilakukan setiap hari. Koloni yang tumbuh selanjutnya dimurnikan dan diidentifikasi (Barnet & Hunter 1998; Domsch et al. 1980; Fassatiova 1986; Gandjar et al. 1999). Sampel akar muda dari tumbuhan hidup (rizoplan) dipotong ± 1cm, cuci dengan air mengalir, direndam alkohol 70% selama 1 menit, bilas dengan akuades, rendam dalam NaOCl 0.5% selama 15 menit, lalu dibilas dengan akuades 3 kali. Tiriskan dengan tissu steril dan ditanam pada media LCA, CMA, dan Alkali Lignin (Bill 1996). b. Dekomposer Daun segar dari tumbuhan hidup (sebagai kontrol) dipotong ± 1cm, cuci dengan air mengalir, direndam alkohol 70% selama 1 menit, bilas dengan akuades, rendam dalam NaOCl 0.5% selama 15 menit, lalu dibilas dengan akuades 3 kali. Tiriskan dengan tissu steril dan ditanam pada media LCA, CMA, dan Alkali Lignin. Sampel serasah daun dikeringudarakan, lalu dihancurkan dengan blender dan dipisahkan dengan saringan bertingkat yaitu 500, 250, dan 125 µm. Butiran serasah yang terdapat pada saringan dengan ukuran 125 µm dicuci dalam air mengalir selama 15 menit, lalu disebar pada media LCA, CMA, dan Alkali Lignin. Identifikasi Fungi Biakan murni fungi diremajakan pada media Potato Dextrose Agar (PDA) dan diinkubasi 5-7 hari pada suhu ruang. Isolat fungi yang telah tumbuh pada media, diamati ciri-ciri makroskopiknya yaitu ciri koloni seperti sifat tumbuh hifa, warna dan diameter koloni dan warna massa spora atau konidia. Isolat fungi juga ditumbuhkan pada kaca objek dengan Metode Riddel (Gunawan et al. 2006) yaitu dengan cara meletakkan potongan agar sebesar 4 x 4 x 2 mm yang telah ditumbuhi fungi pada kaca objek, yang kemudian ditutup dengan kaca penutup. Isolat pada kaca objek ini ditempatkan dalam cawan Petri berdiameter 9 cm, yang
telah diberi pelembab berupa kapas basah. Isolat fungi pada kaca objek ini dibiarkan selama beberapa hari pada kondisi ruang sampai isolat fungi tumbuh cukup berkembang. Ketika isolat fungi telah berkembang dilakukan pengangkatan kaca penutup yang telah ditumbuhi fungi dengan hati-hati untuk membuang potongan agarnya. Selanjutnya pada bekas potongan agar ditetesi larutan laktofenol untuk membuat kultur permanen. Kaca penutup yang juga telah ditumbuhi fungi selanjutnya ditempatkan di atas larutan laktofenol di atas kaca objek. Kultur kaca ini diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya untuk mengetahui ciri mikroskopik fungi yaitu ciri-ciri hifa, ada tidaknya sekat pada hifa, tipe percabangan hifa, konidiofor, konidiogenesis, serta ciri-ciri konidia atau spora (bentuk dan rangkaian) dan ukuran spora. Setelah itu dicocokkan dengan kunci identifikasi fungi (Domsch et al. 1980; Barnett & Hunter 1998; Fassatiova 1986; Gandjar et al. 1999). Pemeliharaan biakan murni dilakukan dengan cara biakan disimpan dalam parafin cair steril yang menutupi seluruh permukaan biakan