3. METODOLOGI 3.1. Waktu dan Tempat Pelaksanaan Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni sampai bulan Oktober 2009. Pengujian proksimat bahan baku dilakukan di Laboratorium Biokimia, Pusat Antar Universitas (PAU. Proses recovery dan pengujian ph dilakukan di Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan. Pengujian atomic absorption spectrophotometry (AAS) dilakukan di Laboratorium Instrumen, Departemen Teknologi Industri Pertanian. Pengujian scanning electron microscopy (SEM) dilakukan di Laboratorium Geologi Laut, Departemen Geologi dan Geofisika, Institut Teknologi Bandung. 3.2. Alat dan Bahan Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini yaitu kulit udang yang diperoleh dari Hypermarket Giant Yasmin Bogor, larutan teknis asam klorida (HCl) 1 N, akuades dan NaOH 3 N teknis. Bahan yang digunakan pada uji proksimat meliputi selenium, H 2 SO 4, H 3 BO 3, HCl dan pelarut heksan. Bahan yang digunakan pada uji AAS adalah HCl 3 N, HCl 6 N, lantanum klorida 10% (w/v), akuades dan garam pereaksi. Adapun alat-alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain oven, tanur, timbangan digital, cawan porselen, termometer, labu erlenmeyer, pipet volumetrik, pipet tetes, tabung reaksi, gelas piala 2000 ml dan 1000 ml, kompor listrik, kertas saring Whatman 40, kertas saring Whatman 42,kertas saring Whatman 541, pelat alumunium dan pelat emas setebal 48 nm, mikroskop SEM dan atomic absorption spectrophotometry (AAS). 3.3. Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan dalam 2 tahap yaitu: penelitian pendahuluan yang meliputi analisis proksimat dan pengaruh perlakuan perendaman kulit udang terhadap hasil kadar kalsium. Penelitian utama meliputi karakteristik fisik, mikroskopis dan kimia dari tepung hasil recovery limbah demineralisasi dari kulit udang dengan kadar kalsium terbaik yang meliputi analisis derajat putih, ukuran partikel dan analisis ph.
3.3.1. Penelitian Pendahuluan Penelitian pendahuluan terdiri dari uji proksimat kulit udang meliputi uji kadar air, uji kadar abu, uji kadar protein dan kadar lemak. Pembuatan bubuk tepung hasil recovery diawali dengan perendaman kulit udang dalam larutan HCl 1 N dengan perlakuan waktu perendaman selama 0 jam, 24 jam, 48 jam dan 72 jam. Selanjutnya kulit udang diekstraksi pada suhu 90 o C pada larutan HCl 1 N selama 1 jam sebanyak dua kali. Kemudian, pemisahan kulit udang dengan filtrat menggunakan kertas saring sehingga diperoleh filtrat, lalu disaring kembali dengan kertas saring Whatman 40. Pengendapan kalsium dilakukan dengan penambahan NaOH 3 N pada filtrat hingga terbentuk endapan jenuh kalsium hidroksida (Ca(OH) 2 ). Selanjutnya, dilakukan proses netralisasi endapan dari pengotor NaCl menggunakan akuades. Endapan Ca(OH) 2 yang telah dinetralkan, kemudian disaring menggunakan kertas saring Whatman 42. Endapan yang diperoleh dioven pada suhu 100 o C hingga bobot endapan stabil. Selanjutnya endapan dipijarkan dalam tanur pada suhu 550 o C selama 1 jam, sehingga terbentuk kalsium oksida. Kemudian, tepung hasil recovery dikarakterisasi dengan metode AAS. Metode AAS dilakukan untuk mengetahui komposisi dan kadar mineral pada tepung hasil recovery dari limbah demineralisasi kulit udang. Pengukuran kadar mineral pada penelitian ini dilakukan pada jenis mineral yang merupakan komponen utama penyusun kulit udang (Guillaume et al.2001). Pengukuran kadar mineral meliputi kalsium, magnesium, kalium, fosfor, tembaga, besi dan seng (APHA 1998). Prosedur kerja ekstraksi dan recovery mineral dari kulit udang dapat dilihat pada Gambar 6.
Kulit udang Penimbangan bobot basah Perendaman HCl 1:7 (selama 0 jam, 24 jam, 48 jam,72 jam) Demineralisasi (90 o C, 1 jam) Penyaringan filtrat Pengendapan Ca dengan NaOH 3 N Penetralan NaCl Pengeringan dengan oven Pengabuan dengan tanur 550 o C, 1 jam Penimbangan dan pengujian AAS Gambar 6. Diagram alir ekstraksi dan recovery mineral dari kulit udang (Suptijah et al.(1992) dengan modifikasi)
3.3.2. Penelitian Utama Perlakuan perendaman kulit udang yang menghasilkan bubuk kalsium dengan kadar kalsium tertinggi dilanjutkan dalam penelitian utama. Penelitian utama dilakukan untuk mengetahui karakteristik fisik, kimia dan mikroskopis tepung hasil recovery dari limbah demineralisasi kulit udang yang meliputi uji derajat putih dan ukuran partikel dengan menggunakan mikroskop SEM, sedangkan pengukuran karakteristik kimianya adalah uji ph. Diagram alir karakterisasi tepung hasil recovery dari limbah demineralisasi kulit udang jerbung dapat dilihat pada Gambar 7. Tepung hasil recovery Penimbangan Pengukuran derajat putih Analisis ukuran partikel (SEM) Pengukuran ph Gambar 7. Diagram alir karakterisasi tepung hasil recovery dari limbah demineralisasi kulit udang. 3.4. Analisis Fisik dan Kimia Sampel 1) Analisis Proksimat Analisis proksimat merupakan suatu analisis yang dilakukan untuk mengetahui komposisi kimia yang ada pada suatu bahan. Analisis proksimat yang dilakukan meliputi : a) Analisis kadar air (AOAC 1995) Prinsip dari analisis kadar air yaitu untuk mengetahui kandungan atau jumlah kadar air yang terdapat pada suatu bahan. Analisis kadar air meliputi proses pengeringan cawan porselen, penimbangan sampel dan pengovenan.
Tahap pertama yang dilakukan pada analisis kadar air adalah mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 102-105 C selama 10-15 jam. Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator kurang lebih selama 30 menit dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Kemudian, sampel kulit udang ditimbang seberat 5 gram dan diletakkan ke dalam cawan. Selanjutnya, cawan dimasukan ke dalam oven pada suhu 105 C selama 8 jam. Lalu, cawan tersebut dimasukan ke dalam desikator dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Perhitungan kadar air pada sampel kulit udang: % kadar air B C 100 % B A Keterangan : A = Berat cawan kosong (gr) B = Berat cawan dengan sampel kulit udang (gr) C = Berat cawan dengan sampel kulit udang setelah dikeringkan (gr) b) Analisis kadar abu (AOAC 1995) Prinsip dari analisis kadar abu yaitu untuk mengetahui jumlah abu yang terdapat pada suatu bahan terkait dengan mineral dari bahan yang dianalisis. Analisis kadar abu meliputi pemijaran cawan abu porselen, penimbangan sampel dan pengabuan. Cawan abu porselen dipijarkan dalam tanur pada suhu 650 C selama 1 jam. Cawan abu porselen tersebut didinginkan selama 30 menit setelah suhu tungku turun menjadi sekitar 200 C dan ditimbang. Sampel kulit udang sebanyak 1 2 gram dimasukkan ke dalam cawan abu porselen. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam tanur pada suhu 650 C. Proses pengabuan dilakukan selama 3 jam sampai abu berwarna putih. Setelah suhu tungku pengabuan turun menjadi sekitar 200 C, cawan abu porselen didinginkan selama 30 menit dan kemudian ditimbang beratnya. Perhitungan kadar abu pada sampel kulit udang: % kadar abu C A 100 % B A Keterangan : A = Berat cawan abu porselen kosong (gr) B = Berat cawan abu porselen dengan sampel
kulit udang (gr) C = Berat cawan abu porselen dengan sampel kulit udang setelah dikeringkan (gr) c) Analisis kadar protein (AOAC 1995) Prinsip dari analisis protein yaitu untuk mengetahui kandungan protein kasar (crude protein) pada suatu bahan. Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap yaitu dekstruksi, destilasi,dan titrasi. (1). Tahap dekstruksi Sampel kulit udang ditimbang sebesar 0,5 gram, kemudian dimasukkan ke dalam tabung kjeltec. Satu butir kjeltab dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan ditambahkan 10 ml H 2 SO 4. Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam air pemanas dengan suhu 410 C dan ditambahkan 10 ml air. Proses dekstruksi dilakukan sampai larutan menjadi bening. (2). Tahap destilasi Tahap destilasi terdiri dari dua tahap, yaitu persiapan sampel yang dilakukan dengan membuka kran air kemudian dilakukan pengecekan alkali dan air dalam tanki. Selanjutnya, tabung dan erlemeyer yang berisi akuades diletakkan pada tempatnya. Tombol power pada sistem kjeltec ditekan lalu dilanjutkan dengan menekan tombol steam dan tungku beberapa lama sampai air di dalam tabung mendidih. Steam dimatikan dan tabung kjeltec dan erlemeyer dikeluarkan dari alat sistem kjeltec. Tahap destilasi dilakukan dengan meletakkan tabung yang berisi sampel yang sudah didestruksi ke dalam sistem kjeltec beserta erlemeyer yang berisi asam borat. Destilasi dilakukan sampai volume larutan dalam erlemeyer yang berisi asam borat mencapai 200 ml. (3). Tahap titrasi Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan pada erlemeyer berubah menjadi warna pink. Perhitungan kadar protein pada kulit udang : ml HCl ml HCl blanko N HCl X 14 100 % % nitrogen mg sampel
% Kadar Protein = % Nitrogen x faktor konversi Keterangan : Protein mengandung rata-rata 16% nitrogen. Faktor konversi = % % = 6,25 (d) Analisis kadar lemak (AOAC 1995) Prinsip dari analisis kadar lemak adalah untuk mengetahui kadar lemak dari suatu bahan. Penentuan kadar lemak yakni dengan penimbangan sampel sebanyak 2 gram. Kemudian, sampel disebar pada kapas yang dilapisi kertas saring dan digulung membentuk selongsong kertas, lalu dimasukkan ke dalam labu soxhlet. Kemudian lemak diekstraksi menggunakan pelarut lemak berupa heksan sebanyak 150 ml selama 6 jam. Lemak yang terekstrak kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 100 C selama 1 jam. Penghitungan kadar lemak adalah sebagai berikut: Bobot lemak terekstrak Kadar lemak % X 100% mg sampel kering 2) Rendemen tepung hasil recovery Rendemen merupakan persentase dari perbandingan kadar mineral terhadap bobot kulit udang sebelum mengalami perlakuan. Perhitungan persentase rendemen dengan rumus sebagai berikut: Tepung hasil gr Rendemen %bb 100 % Kulit udang bb gr Rendemen %bk % 100 kadar air 100 % 3) Analisis kadar mineral tepung hasil recovery dengan AAS (Metoda APHA ed. 20 th 3111 B, 1998) Analisis kadar mineral dilakukan untuk mengetahui kadar mineral pada tepung hasil recovery dari limbah demineralisasi kulit udang. Pada penelitian ini dilakukan kadar mineral yang meliputi kalsium, magnesium, kalium dan fosfor, mangan, tembaga, besi dan seng. Analisis kadar mineral yang dilakukan menggunakan metode AAS. Tahap pertama pada analisis AAS adalah penyiapan sampel mineral yang diperoleh melalui pengabuan kering. Mineral dimasukkan ke dalam cawan dan ditambahkan HCl 6 N sebanyak 5 6 ml, kemudian dipanaskan
hingga kering di atas hot plate pada suhu rendah. Kemudian, sampel ditambahkan HCl 3 N sebanyak 15 ml dan dipanaskan hingga mendidih. Selanjutnya, sampel didinginkan dan disaring dengan kertas saring Whatman No. 541 hingga diperoleh filtrat. Lalu, filtrat dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml. Kemudian HCl 3 N sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam cawan dan dipanaskan sampai mendidih, lalu disaring hingga diperoleh filtrat. Filtrat dimasukkan ke dalam labu takar. Selanjutnya, cawan dicuci dengan akuades sedikitnya tiga kali, lalu aquades hasil pencucian disaring dan dimasukkan ke dalam labu takar. Larutan lantanum klorida 10% w/v ditambahkan ke dalam labu takar. Selanjutnya, filtrat didinginkan dan diencerkan pada labu takar hingga tanda tera. Tahap kedua adalah persiapan blanko dengan menggunakan garam pereaksi yang berbeda untuk masing-masing mineral. Garam pereaksi yang digunakan untuk masing-masing mineral tertera pada Tabel 2. Tabel 2. Berat garam pereaksi yang diperlukan untuk membuat larutan standar logam Logam Pereaksi Berat pereaksi (gr/250 ml larutan) Kalsium CaCO 3 (kering) 0,624 Magnesium MgSO 4.7H 2 O 2,530 Kalium KCl 0,476 Mangan MnSO 4.4H 2 O 1,015 Tembaga CuSO 4.5H 2 O 0,981 Besi Fe(SO 4 ) 3 (NH 4 ) 2 SO 4.24H 2 O 2,158 Seng ZnSO 4.7H 2 O 1,100 Tahap ketiga adalah kalibrasi alat AAS. Alat diatur sesuai dengan instruksi dalam petunjuk manual alat tersebut. Selanjutnya larutan standar logam dan blanko diukur. Kemudian kadar mineral dianalisis berdasarkan emisi yang dihasilkan dari pembakaran mineral pada tungku pembakar dan diukur pada panjang gelombang tertentu. Panjang gelombang yang digunakan pada uji AAS tertera pada Tabel 3.
Tabel 3. Panjang gelombang pada uji AAS Unsur Panjang gelombang (A) Kalsium dengan penambahan LaCl 0,5% 422,7 Magnesium 285,2 Kalium 766,5 Mangan 279,5 Tembaga 324,8 Besi 248,3 Seng 213,9 Perhitungan konsentrasi mineral dalam sampel ditentukan dari kurva standar yang diperoleh, rumus perhitungan kadar mineral adalah sebagai berikut: a b Kadar logam mg/100 gr 10W X V Kadar logam mg/1000 gr Keterangan: a = Konsentrasi larutan sampel (µg/ml) b = Konsentrasi larutan blanko (µg/ml) W = Berat sampel (gr) V = Volume ekstrak (ml) a b W X V 4) Analisis kadar air (Fischer 1744 diacu dalam ASTM 1993) Penentuan kadar air dengan Metode Karl Fischer bertujuan menentukan kadar air dalam suatu bahan yang memiliki kadar air berkisar 5%. Analisis kadar air dengan Metode Karl Fischer dilakukan dengan cara titrasi dan menggunakan alat potensiometer. Metode ini dapat dilakukan untuk bahan cair atau padat. Analisis dilakukan dalam medium alkohol yang bebas air dan dititrasi dengan pereaksi iodin. Alat potensiometer dikalibrasi dengan cara memasukkan 10 µl air ke dalam wadah tertutup yang berisi alkohol anhidrat dan dititrasi dengan pereaksi iodin. Selanjutnya sampel ditimbang sebanyak 0,5 gram pada wadah karl fischer pada kondisi vakum udara. Kemudian sampel dimasukkan ke dalam wadah yang berisi methanol bebas air dan dititrasi dengan pereaksi iodin. Pengukuran kadar air dengan alat Karl Fischer dilakukan pada suhu
25 C dan tegangan 250 mv serta laju titrasi 0,5 ml/detik. Selanjutnya data konsentrasi kadar air dapat dilihat pada alat potensiometer. Perhitungan kandungan air dalam contoh ditentukan dari kebutuhan titran dikalikan kesetaraan titran dalam air (Water equivalent) (Wilmington 1980 diacu dalam Yudhi et al. 2008). Rumus penentuan kadar air Metode Karl Fischer adalah sebagai berikut: WE = mg H2O / jumlah titran (ml) (1) % H20 = WE / berat contoh (gr) x 100%...(2) 5) Analisis SEM (Scanning Electron Microscopy) tepung hasil recovery (Lee 1993) Sampel ditimbang sebanyak 0,1 gr dan diletakkan pada plat alumunium hingga merata dan homogen serta dilapisi lapisan emas setebal 48 nm. Selanjutnya plat alumunium diletakkan di meja sampel. Sampel yang telah dilapisi emas dideteksi dengan menggunakan SEM pada tegangan 20 kv dan perbesaran 2.000x, 5.000x, 10.000x dan 20.000x. Sumber elektron dipancarkan menuju sampel untuk memindai permukaan sampel. Kemudian emas sebagai konduktor akan memantulkan elektron ke detektor pada mikroskop SEM. Selanjutnya hasil pemindaian akan diteruskan oleh detektor menuju monitor. Hasil yang diperoleh berupa gambar tiga dimensi permukaan tepung hasil recovery. 6) Derajat putih tepung hasil recovery Pengukuran derajat putih tepung hasil recovery dari limbah demineralisasi kulit udang menggunakan alat photoelectric tube whitness metre for powder model C-1 berskala 0-100. Warna hitam menunjukkan nilai 0, sedangkan nilai 100 menunjukkan derajat putih yang setara dengan pembakaran pita magnesium. Pengukuran derajat putih tepung hasil recovery dari limbah demineralisasi kulit udang dilakukan dengan cara meletakkan tepung dalam wadah tertentu, kemudian hasil pengukuran derajat putih terlihat pada monitor alat tersebut.
7) Analisis ph (Apriyantono et al. 1989) Sebanyak 5 gram sampel dicampur dengan 45 ml akuades dan dihomogenkan dengan homogenizer selama 10 menit. Selanjutnya alat ph meter dikalibrasi dengan menggunakan buffer ph standar (ph 4 dan ph 7). Elektroda yang telah dibersihkan, dicelupkan ke dalam sampel yang akan diperiksa. Selanjutnya ph meter dibiarkan selama beberapa menit sampai nilai yang tertera pada display ph meter stabil. Setelah stabil, nilai yang ditunjukkan dicatat sebagai ph sampel.