BAB III -1?-I'niK { j..^.:iik -'^.JU-W BAHAN DAN METODE 3.1. Tempat dan Waktu Penelitian Sintesis senyawa analog calkon dilakukan di Laboratorium Kimia Organik Sintesis Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Riau (UR), Uji aktivitas antibakteri dilakukan di Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam FMIPA UR, Analisis produk dengan KCKT/ HPLC dan Spektrofotometer UV dilakukan di Laboratorium Spektroskopi Kimia Organik FMIPA UR. Analisis produk melalui spektroskopi ' H-NMR dilakukan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Serpong, Tanggerang. Penelitian ini telah berlangsung selama lebih kurang 3 bulan, dan dari jangka waktu perencanaan awal diperkirakan akan selesai selama lebih kurang 2 bulan lagi. 3.2. Peralatan dan Bahan.,.,. HaUrn -Sei'^ti^^rts k'aun:i: pft»;..,» 3.2.1. Peralatan yang digunakan Peralatan yang digunakan adalah plat KLT GF254, Alat penentu titik leleh Fisher Johns, lampu UV (254 nm), Spektrofotometer UV (Genesys los UV-VIS V4.002 2L9N175013), HPLC (Shimadzu LCsolution), dan Spektrometer NMR (Jeol Type ECA 500). 3.2.2. Bahan yang digunalcan Bahan-bahan yang digunakan adalah 2-kloro benzaldehid (Merck), 3-bromo benzaldehid (Merck), 4-kloro asetofenon (Merck), NaOH (pa), CeS04 anhidrat, NB (Nutrient Broth), NA (Nutrient Agar), amoxan, etilasetat (pa), n-heksan (pa), diklorometan (teknis), metanol (teknis), kloroform (pa), dan DMSO. 3.2.3. Mikroorganisme yang digunakan Escherichia Mikroba yang akan digunakan untuk uji aktivitas adalah bakteri coli dan Bacillus subtilis. Mikroba yang akan digunakan diperoleh dari koleksi Laboratorium Mikrobiologi.lurusan Biologi ITB 14
Bandung yang telah diremajakan di Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam FMIPA UR. J. Rancangan Penelitian Untuk mendapatkan senyawa calkon (6a), maka pendekatan sintetik yang diusulkan pada penelitian ini adalah didasarkan pada kondensasi antara suatu aldehid aromatik (6b) dengan keton aromatik (6c), seperti yang terlihat pada skema retrosintesis berikut. (6a) (6b) (6c) Gambar 6. Skema pendekatan retrosintesis senyawa calkon Senyawa analog calkon (7c) didapatkan melalui reaksi kondensasi aldol senyawa turunan benzaldehid (7a) dengan turunan asetofenon (7b) dengan menggunakan katalis basa (NaOH) seperti terlihat pada skema reaksi berikut. (7a) e (7b) (7c) Gambar 7. Skema reaksi kondensasi aldol untuk mendapatkan calkon Penelitian ini menggunakan pendekatan kimia kombinatorial yaitu memproduksi sejumlah senyawa secara bersamaan dengan menggunakan senyawa awal 4-kloro asetofenon dan dua senyawa aldehid aromatik yaitu 2- kloro benzaldehid dan 3-bromo benzaldehid untuk menghasilkan dua analog calkon yaitu l-(4'-klorofenil)-3-(2-klorofenil)prop-2-en-l-on dan l-(4'- klorofenil)-3-(3-bromofenil)prop-2-en-1 -on 15
Prosed ur Kerja 3.4.1. Sintesis l-(4'-kiorofenil)-3-(2-klorofenil)prop-2-en-l-on (Ci) 1 -(4'-klorofenil)-3-(2-klorofenil)-2-propen-1 -on Gambar 8. Skema sintesis analog calkon Ci. 1. Sebanyak 0,792 gram 4-kloro asetofenon (5 mmol), 0,281 gram NaOH (7 mmol), dan 0,707 gram 2-kloro benzaldehid (5 mmol) dimasukkan ke dalam lumpang. 2. Campuran di atas kemudian digerus hingga terbentuk padatan berwarna kuning, dan proses menggerus dilanjutkan selama lebih kurang 30 menit agar reaksi berlangsung sempurna. 3. Setelah 30 menit, proses menggerus dihentikan, dan padatan kuning yang terbentuk kemudian di uji KLT menggunakan pelarut etilasetat;n-heksan (1.9) untuk memeriksa kondisi reaksi apakah reaksi sudah selesai atau belum dengan cara membandingkan RF produk dengan RF senyawa awalnya. 16
4. Setelah reaksi dipastikan selesai melalui uji KLT, padatan yang terbentuk kemudian dicuci dengan aquades dingin untuk menyingkirkan sisa katalis. Kemudian padatan dicuci dengan n- heksan dingin menggunakan corong Buchner dan divakum hingga padatan kering. 5. Setelah kering, dilakukan uji KLT lagi terhadap padatan yang telah dicuci tersebut menggunakan pelarut yang sama dengan prosedur 3 untuk memeriksa apakah produk sudah mumi atau perlu dilakukan rekristalisasi. 6. Padatan tersebut kemudian direkristalisasi dengan melarutkannya dalam etilasetat pro analisis hingga dihasilkan larutan yang jenuh. Lanitan jenuh tersebut kemudian disaring untuk menghilangkan pengotor yang tidak larut. Filtratnya ditampung di dalam erlenmeyer dan dibiarkan selama semalam di dalam lemari hingga tampak padatan mulai terpisah dari larutan jenuh tersebut membentuk suspensi. 7. Setelah terbentuk suspensi, erlenmeyer tersebut kemudian didinginkan di dalam lemari pendingin selama 3 hari hingga padatan benar-benar terpisah dari larutan membentuk endapan berwarna putih yang maksimal. 8. Endapan kemudian dipisahkan dari larutan dengan cara disaring dengan corong Buchner dan divakum hingga agak kering, kemudian dicuci dengan 10 ml n-heksan pro analisis untuk menghilangkan sisa pengotor yang kemungkinan ikut mengkristal bersama endapan yang terbentuk dan divakum hingga kristal kering. 9. Setelah kering, dilakukan uji KLT lagi terhadap kristal putih yang diperoleh menggunakan pelarut etilasetat.n-heksan (1:7) untuk mengecek kemumiannya hingga didapatlah senyawa Ci yang mumi. 10. Uji KLT juga dilakukan dengan membandingkan RF C mumi yang diperoleh dengan RF senyawa awal menggunakan pelamt etilasetat:nheksan (1:9), etilasetat:n-heksan (1:8), dan DCM:n-heksan (1:1). 11. Noda diamati dengan lampu UV pada A, = 254 nm dan dengan pereaksi penampak noda CeS04 melalui pemanasan. 17
12. Titik leleh dari senyawa tersebut kemudian diukur menggunakan alat penentu titik leleh Fisher Johns 3.4.2. Sintesis l-(4'-kiorofenil)-3-(3-bromofenii)prop-2-en-l-on (C2) 1-(4'-klorofenil)-3-(3-bromofeml)-2-propen-1-on Gambar 9. Skema sintesis analog calkon C2 1. Sebanyak 0,780 gram 4-kloro asetofenon (5 mmol), 0,282 gram NaOH (7 mmol), dan 0,926 gram 3-bromo benzaldehid (5 mmol) dimasukkan ke dalam lumpang. 2. Campuran di atas kemudian digerus hingga terbentuk padatan berwarna kuning, dan proses menggerus dilanjutkan selama lebih kurang 30 menit agar reaksi berlangsung sempurna. 3. Setelah 30 menit, proses menggerus dihentikan, dan padatan kuning yang terbentuk kemudian di uji KLT menggunakan pelarut etilasetat:n-heksan (1:9) untuk memeriksa kondisi reaksi apakah reaksi 18
sudah selesai atau belum dengan cara membandingkan RF produk dengan RF senyawa awalnya. 4. Setelah reaksi dipastikan selesai melalui uji KLT, padatan yang terbentuk kemudian dicuci dengan aquades dingin untuk menyingkirkan sisa katalis. Kemudian padatan dicuci dengan n- heksan dingin menggunakan corong Buchner dan divakum hingga padatan kering. 5. Setelah kering, dilakukan uji KLT lagi terhadap padatan yang telah dicuci tersebut menggimakan pelarut yang sama dengan prosedur 3 untuk memeriksa apakah produk sudah mumi atau perlu dilakukan rekristalisasi. 6. Padatan tersebut kemudian direkristalisasi dengan melamtkannya dalam etilasetat pro analisis panas hingga jenuh. Lamtan jenuh tersebut kemudian disaring dalam keadaan panas. Filtratnya ditampung di dalam Erlenmeyer lalu ditambahkan dengan n-heksan pro analisis dengan perbandingan 3:1 terhadap etilasetat pro analisis yang digunakan untuk melamtkan padatan. Filtrat tersebut kemudian disimpan di dalam lemari pendingin selama semalam hingga terbentuk endapan berbentuk kapas berwama putih kekuningan. r 7. Endapan kemudian dipisahkan dari lamtan dengan cara disaring dengan corong Buchner dan divakum hingga agak kering, kemudian dicuci dengan 10 ml n-heksan pro analisis untuk menghilangkan sisa pengotor yang kemungkinan ikut mengkristal bersama endapan yang terbentuk dan divakum hingga kristal kering. 8. Setelah kering, dilakukan uji KLT lagi terhadap kristal kapas putih kekuningan yang diperoleh menggunakan pelamt etilasetat:n-heksan (1:7) untuk mengecek kemumiannya hingga didapatlah senyawa C2 yang mumi. 9. Uji KLT juga dilakukan dengan membandingkan RF C2 mumi yang diperoleh dengan RF senyawa awal menggunakan pelamt etilasetat:nheksan (1:9), etilasetat:n-heksan (1:8), dan DCM:n-heksan (1:1). 19
10. Noda diamati dengan lampu UV pada X 254 nm dan dengan pereaksi penampak noda CeS04 melalui pemanasan. 11. Titik leleh dari senyawa tersebut kemudian diukur menggunakan alat penentu titik leleh Fisher Johns sehingga diperoleh range titik leleh (99-100) "C. - ^ 3.4.3. Analisis Produk Analisis produk dengan KCKT/ HPLC dan Spektrofotometer UV dilakukan di Laboratorium Spektroskopi Kimia Organik FMIPA UR. Analisis produk melalui spektroskopi ' H-NMR dilakukan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Serpong, Tanggerang. 3.4.4. Uji Aktivitas Antibakteri 3.4.4.L Peremajaan Bakteri Media NB (Nutrient Broth) yang telah dibuat dimasukkan kedalam tabung reaksi masing-masing 9 ml dan disterilisasi. Jarum ose yang telah disterilisasi dengan pembakaran digoreskan pada agar miring yang berisi biakan bakteri dan selanjutnya dicelupkan ke dalam tabung reaksi yang berisi media NB. Tabung ditutup dengan kapas kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37 C selama 24 jam. Biakan bakteri siap dipakai untuk uji bioaktivitas. 3.4.4.2. Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode Difusi Agar Ke dalam cawan petri yang sudah distrerilisasi, dimasukkan 1 ml larutan NB yang berisi biakan bakteri, kemudian ditambahkan 20 ml NA (Nutrient Agar) dan digoyang-goyang agar bakteri tersuspensi merata. Media NA dibiarkan memadat, kemudian diletakkan kertas cakram berukuran 8 mm sebanyak 6 buah. Larutan analog calkon dengan variasi konsentrasi 1 mg/ml dan 2 mg/ml dibuat dengan melarutkan masing-masing analog calkon mumi dengan DMSO. Kemudian sebanyak 10 pl dari masing-masing lamtan dipipet menggunakan pipet mikro di atas masing-masing kertas cakram yang telah diletakkan di dalam cawan petri sehingga 20
variasi konsentrasi calkon pada masing-masing kertas cakram adalah 10 pg/disk dan 20 pg/disk. Amoxan digunakan sebagai senyawa pembanding dibuat dengan konsentrasi 20 pg/disk. DMSO digunakan sebagai kontrol negatif. Cawan petri kemudian diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 37 C dengan membalikkan cawan petri. Diameter daerah bening di sekitar kertas cakram diukur setelah cawan petri tersebut diinkubasi selama 24 jam. '' -.. >. >:.%] y ir>. ' ' -Al US' K'l "i i:x!k\ : V-.,'- >cr:v-<:vv.',.. 4 \- 21