VALIDASI METODE PENENTUAN KADAR ASAM 2-(4- KLOROMETILBENZOILOKSI)BENZOAT DALAM PLASMA DARAH TIKUS DENGAN MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI IVANA GRACITA 2443013070 PROGRAM STUDI S1 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS KATOLIK WIDYA MANDALA SURABAYA 2017
LE I!1 BA R Ptri{SET' U JIIAN PUBLIKASI ILARYA ti-m L{ H Demi perkembangatr iiiru pertgetahr"ran. sa-ya menl,etujui -.-1. --:^-,:ll-^---^ :t-...-:-i, --- -- -1^,^.----.- i-.-1-.1 I7-r:l-^: \E^.^)- D^=--=.1--^-- SKiiPsii iiai-ta iiliiiaii )dt-d. ucligali JLiuu,! alruast rrrtsatrut i riitsii.ilail Kadar Asam 2-{.1-klorometiltrenzoiloksi}benzrat dalarn Plxsnra I}arah T'ikus dengan hlenggunakan Krornatografi Cair Kinerja Titggi untuk riiprii;iikasii.,arr a{au eiitampiikan cii internet atar-l ureciia lain yaitu i;igir,ri liht'tr"t: Pemrrstaliaen Tirrrl<a ll'irlua \,{rn,'!aia Sttmhrr,: "'-"'- "J rrnf;tl: l'ereniinr;*n "-r -_'-.'-s-- akademik sebatas sesuai rlengan Undang-Undang Hak Cipta. I\^*:l-:^*,-^-.-^+..;.,a- 'r.,hli1..'.: 1-.^.-!1-.i.L i-i. Utiiiii\i4ii P-iiildlddi, PLiaatujlidrr PuUiii\Aii ildijtd iiiiiidii iiii ad_!d ^...- buat dengan sebenam\a Surabaya, 23MeiZAfl 24$A1307A
Saya menyatakan dengan ss5rrngguhnya bahwa hasil akhir tugas ini adalah benar-benar merupakan hasil karya saya sendiri. Apabila di kemudian hari diketahui bahwa slaipsi ini merupakan hasil plagiarisme, maka saya bersedia menerima sanksi berupa pembatalan kelulusan atau pencabutan gelar yang saya peroleh. Surabay4 23 Mei20l7
ABSTRAK VALIDASI METODE PENENTUAN KADAR ASAM 2-(4- KLOROMETILBENZOILOKSI)BENZOAT DALAM PLASMA DARAH TIKUS DENGAN MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI Ivana Gracita 2443013070 Senyawa asam 2-(4-klorometilbenzoiloksi)benzoat merupakan turunan dari senyawa asam salisilat. Senyawa turunan baru perlu dilakukan uji farmakokinetika dengan metode yang valid. Telah dilakukan validasi metode kromatografi cair kinerja tinggi untuk penentuan kadar senyawa asam 2-(4-klorometilbenzoiloksi)benzoat dalam plasma darah tikus. Validasi metode dilakukan dengan menggunakan kolom kromatografi fase terbalik, fase gerak metanol : dapar fosfat ph 4 (4:6, v / v ), kecepatan alir 1 ml/menit serta panjang gelombang deteksi 238 nm. Hasil uji linieritas menunjukkan adanya korelasi yang linier dengan koefisien korelasi yang diperoleh adalah 0,9998. Batas deteksi dan batas kuantitasi pada metode ini adalah 0,0233 µg/ml dan 0,0775 µg/ml. Rata-rata persen perolehan kembali ± koefisien variasi adalah 97,59 % ± 0,98%. Kata kunci : Asam 2-(4-klorometilbenzoiloksi)benzoat, plasma darah tikus, kromatografi cair kinerja tinggi, validasi. i
ABSTRACT VALIDATION OF ASSAY FOR THE DETERMINATION OF 2-(4- CHLOROMETHYLBENZOYLOXY)BENZOIC ACID IN RAT S PLASMA USING HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY Ivana Gracita 2443013070 2-[4-(Chloromethyl)benzoyloxy]benzoic acid is a derivative of salicylic acid. A new derivative compound needs to pharmacokinetics test with valid method. High performance liquid chromatography method for quantification of 2-(4-chloromethylbenzoyloxy)benzoic acid in rats plasma has been developed and validated. Validation method was done by reversed phase column, mobile phase methanol : buffer phosphate ph 4 (4:6, v / v ), flow rate 1 ml/min and the wavelength detection 238 nm. The result of linearity test showed a linear correlation with correlation coefficient which was 0.9998. Limit of detection and limit of quantitation in this method was 0.0233 µg/ml and 0.0775 µg/ml. The average percent recovery ± coefficient variation was 97.59 % ± 0.98%. Keywords : 2-(4-Chloromethylbenzoyloxy)benzoic acid, rats plasma, high performance liquid chromatography, validation. ii
KATA PENGANTAR Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat dan karunia-nya sehingga skripsi dengan judul Validasi Metode Penentuan Kadar Asam 2-(4-klorometilbenzoiloksi)benzoat dalam Plasma Darah Tikus dengan Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dapat terselesaikan dengan baik. Penyusunan skripsi ini dimaksudkan untuk memenuhi persyaratan memperoleh gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Farmasi Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya. Keberhasilan penulisan skripsi ini tidak terlepas dari dukungan, bantuan dan doa dari berbagai pihak. Maka pada kesempatan ini, penulis menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : 1. Ibu Senny Yesery Esar, S.Si., M.Si., Apt. dan Ibu Catherine Caroline, S.Si., M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing yang telah meluangkan waktu, tenaga dan dukungan untuk membimbing dan mengarahkan sehingga skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik. 2. Ibu Dra. Hj. Emi Sukarti, M.Si., Apt. dan Bapak Drs. Marcellino Rudyanto, Ph.D., Apt. selaku dosen penguji yang telah memberikan kritik dan saran yang sangat berguna untuk pengembangan skripsi ini. 3. LPPM Fakultas Farmasi Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya atas bantuan dana penelitian. 4. Bapak Drs. Kuncoro Foe, Ph.D., G.Dip.,Sc., Apt. selaku Rektor Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya yang telah memberikan sarana dan prasarana selama pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya. iii
5. Ibu Sumi Wijaya, S.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya yang telah sarana dan prasarana sehingga skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik. 6. Ibu Dra. Idajani Hadinoto, M.S., Apt. sebagai pembimbing akademik yang selalu memberikan nasehat selama pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya. 7. Mbak Tyas sebagai laboran di Laboratorium Bioanalisis yang telah sabar dan tulus membantu selama proses pengerjaan skripsi. 8. Papa, mama dan ko malvin yang selalu memberikan kasih sayang, dukungan, motivasi serta doa sehingga pendidikan Strata-1 di Fakultas Farmasi Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya ini dapat terselesaikan. 9. Sahabat penulis cia dan debbie yang selalu memberikan dukungan dan motivasi sejak awal studi hingga skripsi ini terselesaikan. 10. Teman seperjuangan Marbel dan Christy yang telah memberikan waktu, doa serta dukungan sehingga skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik. 11. Pendamping dan pengurus Jaringan Aktivis Campus Ministry yang selalu memberikan doa dan semangat selama pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Katolik Widya Mandala. Dengan keterbatasan pengalaman, pengetahuan maupun pustaka yang ditinjau, penulis menyadari kekurangan dalam penulisan naskah Skripsi ini. Akhir kata penulis sangat mengharapkan kritik dan saran agar skripsi ini dapat lebih disempurnakan. Surabaya, 23 Mei 2017 Penulis iv
DAFTAR ISI Halaman ABSTRAK... i ABSTRACT... ii KATA PENGANTAR... iii DAFTAR ISI... v DAFTAR TABEL... viii DAFTAR GAMBAR... ix DAFTAR LAMPIRAN... x BAB 1. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Penelitian... 1 1.2 Rumusan Masalah... 4 1.3 Tujuan Penelitian... 4 1.4 Hipotesa Penelitian... 5 1.5 Manfaat Penelitian... 5 BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tinjauan Tentang Asam 2-(4-klorometil benzoiloksi)benzoat... 6 2.2 Tinjauan Tentang Kromatografi... 9 2.2.1 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi... 11 2.2.2 Penggolongan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi... 12 2.2.3 Fase Gerak Kromatografi Cair Kinerja Tinggi... 13 2.3 Plasma Darah... 14 2.4 Persiapan Sampel... 15 2.4.1 Deproteinasi... 16 v
Halaman 2.5 Tinjauan Tentang Validasi... 17 2.5.1 Selektivitas... 19 2.5.2 Linieritas... 21 2.5.3 Akurasi... 22 2.5.4 Presisi... 23 2.5.5 Batas Deteksi... 24 2.5.6 Batas Kuantifikasi... 25 2.6 Parameter Kromatografi Cair Kinerja Tinggi... 26 2.6.1 Waktu Retensi... 26 2.6.2 Faktor Kapasitas... 27 2.6.3 Harga Plat Teoritis... 27 2.6.4 Tinggi Setara Lempeng Teoritis... 28 2.6.5 Faktor Asimetri... 29 2.6.6 Selektivitas... 29 2.6.7 Resolusi... 30 BAB 3. METODE PENELITIAN 3.1 Jenis Penelitian... 32 3.2 Bahan dan Alat Penelitian... 32 3.2.1 Bahan Penelitian... 32 3.2.2 Alat Penelitian... 32 3.3 Metode Penelitian... 33 3.4 Tahapan Penelitian... 33 3.4.1 Uji Identifikasi Senyawa... 33 3.4.1.1 Uji Organoleptis... 33 3.4.1.2 Uji Titik Leleh... 33 3.4.1.3 Uji Kromatografi Lapis Tipis.. 34 vi
Halaman 3.4.2 Validasi Metode Analisis... 34 3.4.2.1 Pembuatan Larutan Baku Induk 34 3.4.2. Uji Selektivitas... 35 3.4.4 Uji Linieritas... 37 3.4.5 Uji LOD dan LOQ... 38 3.4.6 Uji Akurasi dan Presisi... 38 3.5 Analisis Data... 39 3.5.1 Perhitungan Selektivitas... 39 3.5.2 Perhitungan Linieritas... 39 3.5.3 Perhitungan Batas Deteksi dan Kuantifikasi 40 3.5.4 Perhitungan Akurasi dan Presisi... 40 BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Uji Kemurnian... 41 4.1.1 Uji Organoleptis... 41 4.1.2 Uji Titik Leleh... 41 4.1.3 Uji Kromatografi Lapis Tipis... 42 4.2 Uji Selektivitas... 43 4.3 Uji Linieritas... 48 4.4 Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi... 50 4.5 Uji Akurasi dan Presisi... 50 BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan... 52 5.2 Saran... 52 DAFTAR PUSTAKA... 53 LAMPIRAN... 56 vii
DAFTAR TABEL Tabel Halaman 2.1 Harga Faktor Retardasi (Rf) Asam 2-(4-Klorometilbenzoil oksi)benzoat... 7 2.2 Klasifikasi Teknik Kromatografi... 11 2.3 Elemen Data yang Dibutuhkan untuk Uji Validasi... 19 2.4 Persentase Perolehan Kembali yang Diterima Berdasarkan Konsentrasi Analit... 23 4.1 Hasil pemeriksaan organoleptis senyawa asam 2-(4-kloro metilbenzoiloksi)benzoat... 41 4.2 Hasil uji titik leleh senyawa asam 2-(4-klorometilbenzoil oksi)benzoat... 42 4.3 Hasil uji kromatografi lapis tipis senyawa asam 2-(4- klorometilbenzoiloksi)benzoat, asam salisilat dan 4- klorometilbenzoil klorida... 42 4.4 Hasil uji selektivitas senyawa asam 2-(4-klorometilbenzoil oksi)benzoat... 46 4.5 Hasil uji linieritas asam 2-(4-klorometilbenzoiloksi)benzoat 48 4.6 Hasil uji akurasi dan presisi asam 2-(4-klorometilbenzoil oksi)benzoat... 51 viii
DAFTAR GAMBAR Gambar Halaman 2.1 Plasma Darah yang Telah Dipisahkan dari Darah Melalui Proses Pemusingan... 15 4.1 Pengamatan noda kromatografi lapis tipis senyawa... 43 4.2 Hasil pengamatan spektrum dari Asam 2-(4-klorometil benzoiloksi)benzoat... 45 4.3 Kromatogram hasil pemisahan campuran plasma dengan Asam 2-(4-klorometil-benzoiloksi)benzoat dengan 3 macam fase gerak.... 47 4.4 Kurva linieritas asam 2-(4-klorometilbenzoiloksi)benzoat 49 ix
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran Halaman 1 Contoh Perhitungan Selektivitas... 56 2 Hasil Uji Linieritas... 57 3 Perhitungan Harga F... 58 4 F Tabel... 60 5 Perhitungan LOD dan LOQ... 61 7 Perhitungan Akurasi dan Presisi... 62 8 Tabel R... 64 x