LAMPIRAN
Lampiran 1. Road-map Penelitian Persiapan Penelitian Persiapan wadah dan ikan uji Bak ukuran 40x30x30cm sebanyak 4 buah dicuci, didesinfeksi, dan dikeringkan Diletakkan secara acak dan diberi label Diisi air dengan padat tebar ikan kakap putih 10 ekor/bak. Adaptasi ikan selama 7 hari Pencampuran pakan dengan jintan hitam Pakan buatan ditimbang sebanyak 1 kg. Serbuk jintan hitam dicampurkan pada pakan, ditambahkan putih telur sebagai binder dan diaduk. Pellet dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. Pembuatan Filtrat VNN Beberapa organ dari kerapu tikus yang positif terserang VNN Organ tersebut digerus dengan mortar kemudian dimasukkan dalam mikrotube dan ditambah PBS Mikrotube disentrifuse dengan keepatan 12000 rpm selama 10 menit kemudian disaring dengan milipore Filtrat disuntikkan kepada kerapu dengan dosis 0 1ml/ekor yang sehat untuk diamati gejala terserangnya VNN Ikan yang menunjukkan gejala diambil organnya untuk dibuat filtrat kembali dan dapat disimpan dalam freezer -81 o C Pelaksanaan Penelitian Pemberian pakan yang dicampur imunostimulan Pakan diberikan selama 42 hari pemeliharaan Frekuensi 2x/hari, pukul 08.00 dan 16.00 WIB Uji Tantang Uji tantang pada hari ke-38 Penyuntikan filtrat VNN ke tubuh semua ikan uji secara intra peritoneal (i.p) dengan dosis 0,1 ml/ekor. Pengambilan Darah Pengambilan sampel darah pada hari ke- 0, 7, 14, 21 dan 4 hari setelah uji tantang Jarum suntik dan microtube dibilasdengan EDTA 10% Darah diambil dari 5 ekor ikan, dipilih secara acak pada setiap bak, lalu disimpan di microtube Hematologi Hematokrit Total Leukosit Diferensial Leukosit Uji Fagositosis Parameter pengamatan Kualitas Air Suhu ph DO Salinitas SR RPS dan MTD Analisis Data Deskriptif Penyusunan Laporan
Lampiran 2. Data Pengamatan Darah 1. Total Leukosit Total Leukosit A1 A2 A3 A4 Pengamatan Hari ke-0 26400 27500 30800 28600 Pengamatan Hari ke-7 29700 30800 31900 33000 Pengamatan Hari ke-14 27500 34100 36300 70400 Pengamatan Hari ke-21 28600 37400 68200 77000 Pengamatan Hari ke-42 30800 66000 79200 91300 2. Diferensial Leukosit a. Persentase Monosit Monosit A1 A2 A3 A4 Pengamatan Hari ke-0 3 4 5 3 Pengamatan Hari ke-7 5 6 8 7 Pengamatan Hari ke-14 2 9 10 12 Pengamatan Hari ke-21 4 8 4 8 Pengamatan Hari ke-42 7 11 9 13 b. Persentase Limfosit Limfosit A1 A2 A3 A4 Pengamatan Hari ke-0 57 59 58 56 Pengamatan Hari ke-7 58 59 64 63 Pengamatan Hari ke-14 57 63 61 60 Pengamatan Hari ke-21 54 64 59 67 Pengamatan Hari ke-42 57 70 63 74 c. Persentase Neutrofil Neutrofil A1 A2 A3 A4 Pengamatan Hari ke-0 40 37 37 41 Pengamatan Hari ke-7 37 35 28 30 Pengamatan Hari ke-14 41 28 29 28 Pengamatan Hari ke-21 36 28 37 25 Pengamatan Hari ke-42 36 21 32 13 3. Persentase Hematokrit Hematokrit A1 A2 A3 A4 Pengamatan Hari ke-0 46.15 36.5 33.33 35.39 Pengamatan Hari ke-7 45.93 45.38 46.51 35.72 Pengamatan Hari ke-14 48.98 41.37 48.37 42.62 Pengamatan Hari ke-21 54.54 47.1 36.36 37.16 Pengamatan Hari ke-42 66 59.61 54.71 41.92
61 Lampiran 3. Tahap Pemeriksaan Profil Darah 1. Pengambilan Darah Jarum suntik dan mikrotube 1,5 ml disiapkan Dibilas dengan larutan EDTA 10% sebanyak 1/3 dari darah yang diambil Darah ikan diambil melalui vena caudalis Darah disimpan dalam mikrotube 1,5 ml
62 Lampiran 3. Tahap Pemeriksaan Profil Darah 2. Perhitungan Total Leukosit Haemacytometer dan kaca penutupnya dibersihkan dengan etanol Kaca penutup dipasang pada haemacytometer Sampel darah dihisap dengan pipet berskala hingga skala 0,5 Dilanjutkan dengan menghisap larutan turk hingga skala 11 (pengenceran 1:20) Pipet digoyangkan selama 3 menit agar bercampur homogen Empat tetesan pertama dibuang
63 Tetesan berikutnya dimasukkan ke dalam haemacytometer Dibiarkan selama 3 menit agar leukosit mengendap Bilik hitung diletakkan di bawah mikroskop menggunakan perbesaran lemah Perhitungan dilakukan pada 4 kotak besar haemocytometer
64 Lampiran 3. Tahap Pemeriksaan Profil Darah 3. Perhitungan Diferensial Leukosit Kaca Obyek dibersihkan dengan etanol Diletakkan setetes darah kerapu tikus Kaca pemulas disentuhkan pada tetesan darah kemudian digeser Kaca obyek yang telah diulas darah dikeringanginkan dan siap diwarnai Sediaan apus darah diletakkan di baki dengan sediaan apus di sebelah atas
65 Sediaan tersebut digenangi dengan methanol secukupnya selama 5-10 menit Kemudian dilanjutkan untuk digenangi dengan giemsa selama 25 menit Dibilas dengan akuades dan dikeringkan Gelas obyek diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran kuat Berbagai jenis leukosit dihitung sepanjang sediaan apusan darah dan dihentikan bila jumlahnya mencapai 100 sel
66 Lampiran 3. Tahap Pemeriksaan Profil Darah 4. Pengukuran Hematokrit Sampel darah kerapu tikus disiapkan Darah disedot dengan menggunakan tabung hematokrit Salah satu bagian ujung tabung disumbat menggunakan lilin dan diberi label Tabung dibungkus dengan tissue dengan cara digulungkan
67 Dimasukkan ke dalam tabung valcon Dimasukkan ke dalam mesin sentrifuse pada kecepatan 3500 rpm selama 15 menit Setelah disentrifuse tabung hematokrit diukur menggunakan penggaris
68 Lampiran 4. Uji Aktivitas Fagositosis Bakteri yang telah dilemahkan dan sel darah putih kerapu tikus dicampurkan ke dalam microdilution plate dengan perbandingan 1:1 Dilakukan pipeting agar homogen dan diinkubasi selama 4 jam Diambil sekitar 50µl kemudian diteteskan diatas gelas obyek untuk di ulas Dilakukan pewarnaan menggunakan giemsa dan diamati dibawah mikroskop
69 Lampiran 5. Uji Tantang Filtrat VNN yang telah diisolasi dari kerapu tikus Dilakukan injeksi VNN terhadap kerapu tikus sebanyak 0,1 ml secara intraperitonial Ikan dipelihara dan diamati hingga menunjukkan gejala terinfeksi VNN
70 Lampiran 6. Pembuatan Isolat Bakteri Vibrio alginolyticus yang Dilemahkan Bakteri V. alginolyticus di kultur pada media semi solid atau TSA Bakteri dipanen dan diinkubasi dengan formalin 1 5% selama 24 jam Bakteri dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali Divortex selama ± 1 menit Disentrifuse pada 3000 rpm selama 15 menit Kepadatan Bakteri dihitung menggunakan standar McFarland hingga didapat kepadatan 10 7 sel/ml
71 Lampiran 7. Pembuatan Isolat VNN Beberapa organ diambil dari ikan yang positif terinfeksi VNN Organ tersebut digerus dengan mortar Organ yang sudah digerus dimasukkan ke dalam microtube dan ditambahkan dengan PBS steril 1ml Microtube disentrifuse dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit
72 Hasil sentrifuse disaring menggunakan milipore 0 45 µm dan dimasukkan kedalam microtube Air hasil saringan diambil sebanyak 1 ml menggunakan spuit Kerapu tikus disuntikkan isolat VNN secara intraperitonial Ikan dipelihara dan diamati hingga muncul gejala klinis serangan VNN Organ- organ ikan yang terserang VNN diambil dan dibuat isolat yang lebih banyak untuk disimpan dalam freezer suhu -81 o C