ISOLASI, ELUSIDASI STRUKTUR, DAN UJI BIOAKTIVITAS SENYAWA STEROID DARI BUAH MAHKOTA DEWA (Phaleria macrocarpa) Tati Suhartati*, Astri Rahayu dan Heryanto Jurusan Kimia FMIPA, Universitas Lampung Jl. S. Brojonegoro No. 1, Bandar Lampung 35145 *E-mail : tatisuhartati10@yahoo.co.id ABSTRACT From the fruit of Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa) which is grown in Bandar Lampung, β-sitosterol has been isolated as much as 140 mg (5.6 x 10-2 %). Isolation was done by maceration method and fractionated by vacuum liquid chromatography (VLC), chromatotron, and column chromatography. Purity of the compounds was determined by thin layer chromatography (TLC) and measurement of the melting point, whereas the structure elucidation was done by IR, NMR, and MS spectrometry. β-sitosterol was obtained in the form of white crystalline needles with a melting point of 135 o - 137 o C, and the bioactivity against E. coli test using agar diffusion method, showed positive results with inhibition area diameter of 21 mm with a weight of 0.017 gram sample. Keywords : isolation, structure elucidation, β - sitosterol, Phaleria macrocarpa, E. coli ABSTRAK Dari daging buah Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa) yang berasal dari Bandar Lampung, telah diisolasi β-sitosterol sebanyak 140 mg ( 5,6 x 10-2 %). Isolasi dilakukan dengan metode maserasi dan fraksinasi dengan kromatografi cair vakum (KCV), kromatotron, dan kromatografi kolom. Kemurnian senyawa ditentukan dengan cara kromatografi lapis tipis (KLT) dan pengukuran titik leleh, sedangkan elusidasi struktur dilakukan dengan cara spektrometri IR, NMR, dan MS. β-sitosterol yang diperoleh berupa kristal jarum berwarna putih dengan titik leleh 135 o -137 o C, dan pada uji bioaktivitas terhadap E. coli menggunakan metode difusi agar, menunjukkan hasil positif dengan diameter daerah hambat sebesar 21 mm dengan berat sampel 0,017 gram. Kata kunci: isolasi, elusidasi struktur, β-sitosterol, Phaleria macrocarpa, E. coli 1. PENDAHULUAN Buah mahkota dewa secara konvensional banyak digunakan oleh masyarakat Indonesia untuk mengobati asam urat, diabetes melitus, hipertensi, dan penyakit ginjal [1], antihistamin, antioksidan, obat asam urat, lever, rematik, kencing manis, ginjal, tekanan darah tinggi sampai kanker [2]. Di dalam buah mahkota dewa terkandung senyawa alkaloid, saponin, flavonoid, dan terpenoid [3]. 322
Pada makalah ini dilaporkan isolasi senyawa steroid yang dilakukan dengan cara maserasi menggunakan etil asetat terhadap buah mahkota dewa dari tumbuhan yang tumbuh di daerah Bandar Lampung. Pemisahan selanjutnya dilakukan dengan cara kromatografi cair vakum (KCV), kromatotron, dan kromatografi kolom (KK). Identifikasi kemurnian dilakukan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dan uji titik leleh. Identifikasi struktur molekul dilakukan menggunakan berbagai spektroskopi, meliputi UV- VIS, IR, NMR, dan MS. Berdasarkan analisis data spektroskopi dan membandingkannya dengan literatur, senyawa hasil isolasi merupakan senyawa β-sitosterol. Uji bioaktivitas senyawa ini terhadap E. coli menunjukan hasil positif. 2. BAHAN DAN METODE PENELITIAN 2.1 Bahan Bahan yang digunakan adalah buah mahkota dewa yang diperoleh dari Bandar Lampung, etil asetat, metanol, n-heksana, aseton, akuades, serium sulfat 1,5% dalam asam sulfat (H 2 SO 4 ) 2 N, benzena, kloroform (CHCl 3 ), diklorometana, silika gel Merck G 60, silika gel Merck 60 (35-70 Mesh), plat KLT silika gel Merck kiesegal 60 F 254 0,25 mm, silika gel 60 PF 254. 2.2 Alat Alat-alat yang digunakan meliputi alat-alat gelas laboratorium, penguap putar vakum, kolom kromatografi cair vakum (KCV), kromatotron, alat kromatografi kolom (KK), pengukur titik leleh, lampu UV, pipet kapiler, penguap putar vakum, spektrofotometer FT- IR merk Scimitar 2000, spektrofotometer ultraungu-tampak (UV-VIS) merk Cary 50, spektrofotometer NMR, spektrofotometer GC-massa (MS) merk Shimadzu QP-2010, dan spektofotometer massa (MS) merk Shimadzu QP-2010. 2.3 Prosedur Penelitian 2.3.1 Ekstraksi Ekstraksi dilakukan dua kali. Pertama, menggunakan 1500 gram buah mahkota dewa yang telah dihaluskan,dimaserasi 3 kali dengan menggunakan etil asetat (EtOAc) masing-masing selama 1x24 jam. Ekstrak etil asetat yang diperoleh disaring kemudian dipekatkan dengan menggunakan penguap putar vakum pada suhu 45 o -50 o C dengan laju putaran 120-150 rpm. Ekstraksi kedua menggunakan 1000 gr buah mahkota dewa. 2.3.2 Kromatografi Cair Vakum (KCV) Ekstrak kasar kemudian difraksinasi dengan KCV. Terlebih dahulu fasa diam silika gel halus sebanyak 3 kali berat sampel dimasukkan ke dalam kolom. Kemudian kolom 323
dikemas kering dalam keadaan vakum menggunakan alat vakum. Eluen yang kepolarannya rendah, dimasukkan ke permukaan silikagel halus terlebih dahulu kemudian divakum kembali. Kolom dihisap sampai kering dengan alat vakum dan siap digunakan. Ekstrak kasar yang telah dilarutkan dalam aseton dan diimpregnasikan kepada silika gel kasar, kemudian dimasukkan pada bagian atas kolom yang telah berisi fasa diam dan kemudian dihisap secara perlahan-lahan ke dalam kemasan dengan cara memvakumkannya. Setelah itu kolom dielusi dengan etil asetat/n-heksan 0% sampai dengan etil asetat 100%. Kolom dihisap dengan vakum sampai kering pada setiap penambahan eluen, kemudian fraksi-fraksi yang diperoleh dikumpulkan berdasarkan pola fraksinasinya. Fraksinasi sampel dengan teknik KCV dilakukan berulang kali dengan perlakuan yang sama seperti tahapan KCV awal di atas. Setelah fraksi-fraksi diidentifikasi dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis, hasil KCV diperoleh 2 kelompok fraksi. 2.3.3 Kromatotron Fraksi kedua (1,29 gr) difraksinasi lebih lanjut menggunakan kromatotron, menggunakan plat silika ketebalan 2 mm. Elusi menggunakan n-heksana dilanjutkan dengan diklorometana/n-heksana 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, dan 100% masing-masing sebanyak 100 m, volume hasil fraksinasi masing-masing sekitar10 ml, diperoleh 76 fraksi, dan fraksi 46-50 diperoleh endapan putih. Fraksi ini selanjutnya dimurnikan secara KK dengan adsorben silika gel dan eluen benzena, diperoleh senyawa kristal murni 10 mg, berwarna putih, titik leleh 135-137 ºC (literatur 135-137 ºC, [4]), dan memberikan warna merah pada uji steroid menggunakan pereaksi Libermann-Buchard. Hasil dari ekstrak yang kedua, setelah difraksinasi dan dimurnikan diperoleh kristal 130 mg. 2.3.4 Analisis Penentuan struktur senyawa hasil isolasi dilakukan dengan menggunakan spektroskopi UV-Vis, Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), NMR- 13 C, DEPT, GS-massa (MS), dan massa (MS). 2.3.5 Uji aktivitas Sampel Kristal murni yang telah dianalisis selanjutnya diuji bioaktivitasnya terhadap bakteri E. colit menggunakan metode difusi agar [5]. Kristal murni diimpregnasi ke dalam kertas saring Whattman berbentuk cakram, juga sampel kasar, kontrol positif (Chloramphenicol) dan kontrol negative (aseton). Media pertumbuhan digunakan Nutrien Agar (NA). 324
3. HASIL DAN PEMBAHASAN Spektrum IR senyawa yang diperoleh menunjukkan serapan melebar pada daerah bilangan gelombang ν 3427,84 cm -1 yang berasal dari vibrasi uluran (stretching) dari gugus O-H (3200-3500 cm -1 ). Vibrasi OH ini diperkuat oleh adanya serapan pada daerah bilangan gelombang ν 1333,56 cm -1 yang menunjukkan adanya serapan tekukan (bending) gugus O-H (1330-1420 cm -1 ) dan bilangan gelombang ν 1053,97 cm -1 yang menunjukkan adanya uluran C-OH siklik (990-1060 cm -1 ). Pita serapan pada daerah bilangan gelombang ini memberikan gambaran bahwa senyawa merupakan senyawa siklik yang mengandung gugus OH. Adanya pita tajam dengan intensitas kuat pada bilangan gelombang ν 2936,54 cm -1 adalah merupakan vibrasi uluran C-H dari CH 3 dan pita serapan pada bilangan gelombang ν 2868,27 cm -1 merupakan uluran C-H pada CH 2 (alkana, 2850-3000 cm -1 ). Hal ini diperkuat dengan adanya serapan pada daerah bilangan gelombang γ 1377,05 cm -1 yang menunjukkan adanya tekukan C-H dari CH 3 (rocking, 1350-1370 cm -1 ) dan pita serapan pada bilangan gelombang γ 1465,29 cm -1 yang menunjukkan adanya tekukan C-H dari CH 2 (scissoring, 1450-1470 cm -1 ). Pita serapan pada bilangan gelombang 958,57 cm -1 yang menunjukkan adanya vibrasi tekukan (bending) gugus alkena =C-H (650-1000 cm -1 ), spektrum IR dari senyawa hasil isolasi dapat dilihat pada Gambar 1.. Gambar 1. Spektrum IR senyawa hasil isolasi Spektrum NMR- 13 C menunjukkan bahwa terdapat 28 karbon penyusun senyawa hasil isolasi. Spektrum NMR- 13 C menyatakan adanya gugus hidroksi (δ C 71,7) dan gugus 325
alkena (δ C 121,6 dan δ C 142,4). Perbandingan data NMR- 13 C senyawa hasil isolasi dengan data literatur ditunjukkan dalam Tabel 1. Spektrum NMR karbon DEPT dari senyawa hasil isolasi dan perbandingan dengan literatur ditunjukkan dalam Tabel 2. Tabel 1. Perbandingan data NMR- 13 C hasil isolasi dan data literatur. Hasil Literatur Dugaan Hasil Literatur Dugaan 38,3 37,6 C-1 25,0 26,3 C-15 32,6 32,1 C-2 23,8 28,5 C-16 71,7 72,1 C- 3 56,9 56,3 C-17 43,1 42,5 C-13 12,2 12,0 C-18 142,4 140,9 C- 5 19,2 19,0 C-19 121,6 121,9 C- 6 37,0 36,3 C-20 32,7 32,1 C- 7 19,3 19,2 C-21 32,8 32,1 C- 8 34,7 34,2 C-22 51,2 50,3 C- 9 26,7 26,3 C-23 37,3 36,7 C-10 46,7 46,1 C-24 21,8 21,3 C-11 29,0 29,4 C-25 40,7 39,9 C-12 19,9 20,1 C-26 43,4 42,6 C-4 20,1 19,6 C-27 57,7 56,9 C-14 12,3 12,2 C-28-12,0 C-29 Literatur : [6]. Spektrum DEPT menunjukkan adanya enam karbon metil, sebelas karbon metilen, delapan karbon metin dan tiga karbon kuarterner (Tabel 2). Tabel 3 menunjukkan hubungan spektrum NMR- 13 C dan DEPT. 326
Tabel 2. Data hubungan dari spektrum 13 C-NMR dan DEPT. 13 C DEPT Gugus Posisi 13 C DEPT Gugus Posisi 12,2 12,2 CH 3 C-18 34,7 34,7 CH 2 C-22 12,3 12,3 CH 3 C-28 37,0 37,0 CH C-20 19,2 19,8 CH 3 C-19 37,3 - C C-10 19,3 19,3 CH 3 C-21 38,3 38,3 CH 2 C-1 19,9 19,8 CH 3 C-26 40,7 40,7 CH 2 C-12 20,1 20,1 CH 3 C-27 43,1 - C C-13 21,8 21,8 CH 2 C-11 43,4 43,4 CH 2 C-4 23,8 23,8 CH 2 C-16 46,7 46,7 CH C-24 25,0 25,0 CH 2 C-15 51,2 51,2 CH C-9 26,7 26,7 CH 2 C-23 56,9 56,9 CH C-17 29,0 29,0 CH 2 C-25 57,7 57,7 CH C-14 32,6 32,6 CH C-2 71,7 71,7 CH-OH C-3 32,7 32,7 CH 2 C-7 121,6 121,6 -C=CH C-6 32,8 32,8 CH C-8 142,4 - C C-5 Spektrum massa dari senyawa hasil isolasi memberikan puncak pada m/z 414 yang sesuai dengan -sitosterol. Berdasarkan analisis dari spektroskopi senyawa hasil isolasi dan perbandingan terhadap literatur, diambil kesimpulan senyawa hasil isolasi merupakan -sitosterol dengan struktur seperti yang terdapat pada Gambar 1. Gambar 1. Struktur senyawa hasil isolasi ( -sitosterol) 327
3. Uji Bioaktivitas terhadap bakteri E. coli Hasil uji bioaktivitas senyawa hasil isolasi ditunjukan pada Gambar 2.. Gambar 2. Uji bioaktivitas terhadap bakteri E. coli, (A) kontrol positif (chloramphenicol), (B) kontrol negatif, (C) senyawa hasil isolasi dan (D) ekstrak kasar Pada kuadran A menunjukkan bahwa kontrol positif (chloramphenicol, 8 mg/disk) menghambat laju pertumbuhan dari bakteri E. coli dengan zona bening berdiameter 45 mm sedangkan kuadran B (kontrol negatif) menunjukan tidak ada penghambatan terhadap laju pertumbuhan bakteri E. coli. Pada kuadran C (senyawa hasil isolasi, 17 mg/disk) menunjukkan adanya penghambatan terhadap bakteri E. coli dengan zona hambat berdiameter 21 mm dan ekstrak kasar pada kuadran D juga menunjukkan adanya zona penghambatan. Data ini menunjukkan bahwa -sitosterol hasil isolasi menunjukkan aktivitas positif terhadap pertumbuhan E. coli yang kemungkinan disebabkan adanya gugus hidroksi pada senyawa hasil isolasi. Daya hambat senyawa -sitosterol adalah lemah terhadap pertumbuhan E. coli dibandingkan chloramphenicol, sedangkan data literatur [7] menyatakan bahwa -sitosterol tidak aktif terhadap E. coli. Berdasarkan perbedaan aktivitas ini, diperkirakan konfigurasi mutlak dari -sitosterol hasil isolasi tidak sama dengan literatur. 4. KESIMPULAN DAN PROSPEK KESIMPULAN Berdasarkan pembahasan hasil penelitian yang telah dilakukan, maka diperoleh simpulan sebagai berikut: telah berhasil diisolasi dan diidentifikasi senyawa -sitosterol dari buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) yang berasal dari Bandar Lampung, dan hasil uji bioaktivitas dari senyawa hasil isolasi terhadap E. coli menunjukkan aktivitas yang lemah. 328
PROSPEK Adanya -sitosterol pada buah mahkota dewa, memungkinkan penelitian lebih lanjut untuk uji aktivitas senyawa tersebut terhadap antikanker, rheumatik, asthma, sakit jantung, atau migrain, selain itu perlu ditentukan putaran optik dan konfigurasi mutlak dari -sitosterol. DAFTAR PUSTAKA [1] Wiryowidagdo, S. Kimia dan Farmakologi Bahan Alam. Dirjen Dikti-Universitas Indonesia, Jakarta. 2000; Hlm 339. [2] Harmanto, N. Sehat dengan Ramuan Tradisional Mahkota Dewa. Cetakan empat, PT. Agromedia Pustaka, Tangerang. 2003; Hlm 5. [3] Gotawa, I. B. I., S. Sugiarto, M. Nurhadi, Y. Widiyastuti, S, Wahyono, I.J. Prapti Inventaris Tanaman Obat Indonesia. Jilid V, Departemen Kes. Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Jakarta, 2009; Hal. 147-148. [4] Saleh, Chairul. Isolasi dan Penentuan Struktur Senyawa Steroid Dari Akar Tumbuhan Cendana (Santalum Album Linn), USU e-reposetory; 2008. [5] Lay, B. W. Analisis Mikroba di Laboratorium, PT. Rajagrafindo Persada, Jakarta, 1994; 168 hlm. [6] Chaturvedula, V.S.P. and I. Prakash. Isolation of Stigmasterol and β-sitosterol from the dichloromethane extract of Rubus suavissimus. International Current Pharmaceutical Journal. 2012; 1(9):239-242. [7] Chemicalland 21 http://chemicalland21.com/lifescience/phar/beta-sitosterol.htm diakses 4 Mei 2015 jam 5.49 www.chemicalland21.com 329