4 HASIL Koleksi Lebah Lebah madu A. c. indica yang berhasil dikoleksi berjumlah 29 koloni. Koloni diambil dari tujuh kecamatan di Lombok yaitu Kec. Selaparang (satu koloni), Kec. Pamenang (dua koloni), Kec. Pujut (tiga koloni), Kec. Tanjung (lima koloni), Kec. Santong (lima koloni), Kec. Kelayu (satu koloni), dan lima koloni dari Kec. Masbagik (Tabel 3, Gambar 2a). Selain itu, koloni tersebut juga berasal dari tiga tempat yang berbeda di Sumbawa yaitu Kec. Moyo Utara, Desa Pungka, dan Desa Pelat, dengan jumlah koloni masing-masing satu koloni (Tabel 3, Gambar 2b). Serta empat koloni yang berasal dari tiga desa di Flores, yaitu Desa Walogai (satu koloni), Desa Walogai Atas (dua koloni), dan Desa Moni (satu koloni) (Tabel 3, Gambar 2c). Budidaya lebah A. c. indica di Lombok umumnya dikelola oleh peternakan keluarga. Peternak memperoleh lebah dengan menangkap lebah langsung dari hutan, kemudian lebah disimpan dalam stup (kotak) dan glodok (potongan batang pohon kelapa yang dilubangi). Kotak stup disusun di rak atau digantung di pohon-pohon sekitar rumah mereka. Selain peternakan keluarga, di Lombok juga terdapat beberapa kelompok tani madu hasil binaan dinas kehutanan (Dishut) Nusa Tenggara Barat (NTB). Sedangkan di Sumbawa, A. c. indica umumnya diternakkan secara liar yang banyak ditemukan di lubang-lubang pohon. Di pulau ini peternakan lebah lebih banyak dikelola oleh kelompok tani madu binaan Dishut NTB. Selain A. cerana, kelompok tani madu di Sumbawa juga membudidayakan lebah A. dorsata. Kondisi budi daya lebah di Flores, tidak jauh berbeda dengan kondisi di Sumbawa. Di pulau ini, umumnya para peternak membudidayakan A. c. indica secara liar. Ekstraksi dan Amplifikasi DNA Ekstraksi dilakukan terhadap 58 individu lebah pekerja. Dari hasil amplifikasi dengan menggunakan primer For lrrna dan Rev lrrna diperoleh pita dengan ukuran + 900 pb (pasang basa) (Gambar 3). Tabel 3 Data lokasi koleksi lebah A. cerana Pulau Kode Sampel Lokasi Koordinat Ketinggian (m dpl) Jumlah Koloni Lombok AcLb11 Kampus lama Univ. 8 0 34 57 10 1 Mataram, Kec. Selaparang, Mataram 116 0 05 35 AcLb12 Kelayu, Lombok Timur 8 0 39 19 12 1 116 0 32 46 AcLb13-16 Santong 8 0 18 30 8 4 116 0 17 01 AcLb17 Santong 8 0 18 14 10 1 116 0 16 32 AcLb18-19 Desa Bentek, Kec. Pamenang, 8 0 43 105 2 Lombok Barat 116 0 10 AcLb20-22 Desa Kuta, Kec. Pujut, 8 0 53 53 3 3 Lombok Tengah 116 0 18 01 AcLb23-27 Desa Sire, Kec. Tanjung, 8 0 21 49 4 5 Lombok Barat 116 0 18 01 AcLb28-32 Desa Lendang Nangka, 8 0 36 01 206 5 Kec. Masbagik 116 0 27 00 Sumbawa AcSbw4 Gili Ngara, Kec. Moyo 8 0 30 18 15 1 Utara, Sumbawa 117 0 35 45 Desa Pelat, Sumbawa - - 1 AcSbw6 Desa Pungka, Sumbawa - - 1 Flores AcFlr1 Desa Walogai, Flores 8 0 42 08 837 1 121 0 48 13.2 AcFlr2-3 Desa Walogai Atas, Flores 8 0 42 25 1.084 2 121 0 48 30.9 Desa Moni, Flores 8 0 46 12 1.212 1 121 0 49 59.2 Total 29
5 Analisis PCR-RFLP Analisis PCR-RFLP yang dilakukan pada 29 koloni lebah A. c. indica dengan menggunakan enzim restriksi DraI menunjukkan adanya variasi genetika, yaitu dengan ditemukan dua haplotipe (A dan C) (Gambar 4). Haplotipe A ditemukan pada koloni yang berasal dari Kec. Selaparang, Kec. Santong, Kec. Pamenang, Kec. Tanjung, dan Kec. Masbagik (Lombok), Kec. Moyo Utara, Desa Pelat, dan Desa Pungka (Sumbawa), serta Desa Walogai dan Desa Walogai Atas (Flores), sedangkan haplotipe C ditemukan pada koloni yang berasal dari Kec. Santong, Kec. Pujut, dan Kec. Masbagik (Lombok), serta Desa Walogai Atas dan Desa Moni (Flores) (Tabel 3, Tabel 4). Perbedaan posisi pemotongan dapat dilihat pada setiap urutan nukleotida (Gambar 5). Ac 13-16 Lb Ac 17 Lb Ac 23-27 Lb Ac 18-19 Lb Ac 7 Lb Ac 9 Lb Ac 4, 11 Lb Ac 6 Lb Ac 28-32 Lb Ac 5 Lb Ac 10 Lb Ac 12 Lb Ac4Sbw 4 Ac5Sbw 5 Ac6Sbw 6 Ac3Sbw 3 Ac2Sbw 2 Sbw Ac 20-22 Lb Sungai di Sumbawa Lokasi A. cerana Gunung di Sumbawa Lokasi A. cerana Sungai di Lombok Gunung di Lombok (a) (b) Ac 2-3 Flr Ac 1 Flr Ac 4 Flr Lokasi A. cerana Sungai di Flores Gunung di Flores (c) Gambar 2 Peta lokasi pengambilan sampel di (a) Lombok, (b) Sumbawa, dan (c) Flores.
6 900 400 300 100 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Gambar 3 Pita DNA A. cerana gen lrrna. M: penanda DNA 100 pb Promega, 1-2: Ac21Lb, 3-4: Ac22Lb, 5-6: Ac4Sb, 7-8: Ac5Sb, 9-10: Ac6Sb. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Gambar 4 Pita DNA A. cerana hasil pemotongan dengan DraI. M: penanda DNA 100 pb Promega, 1-2: Ac21Lb, 3-4: Ac22Lb, 5-6: Ac4Sb, 7-8 : Ac5Sb, 9-10: Ac6Sb. Berdasarkan perhitungan persentase haplotipe, haplotipe A merupakan haplotipe umum yang ditemukan pada koloni lebah Lombok, Sumbawa, dan Flores, dengan persentase sebesar 72.72% (Lombok), 100% (Sumbawa), dan 50% (Flores), sedangkan haplotipe C memiliki persentase sebesar 27.28% (Lombok) dan 50% (Flores) (Tabel 5). Pengurutan (Sequence) DNA Pengurutan DNA dilakukan dengan menggunakan primer For dan Rev lrrna pada masing-masing haplotipe yang berbeda (haplotipe A dan C). Masing-masing haplotipe tersebut mewakili individu asal Lombok, Sumbawa, dan Flores yaitu,, dan dengan panjang DNA hasil pengurutan + 599 pb, + 595 pb, dan + 598 pb. Panjang DNA tersebut ditambah dengan panjang urutan nukleotida primer (For + Rev) sebesar + 30 pb, sehingga panjang DNA yang sebenarnya adalah + 629 pb, + 625 pb, dan + 628 pb. Hasil pengurutan ditampilkan dalam bentuk kromatogram (Lampiran 4-9). Tabel 4 Data haplotipe gen lrrna A. cerana Lombok, Sumbawa, dan Flores No Asal Haplotipe Lombok 1 Ac Lb 11 A 2 Ac Lb 12 C 3 Ac Lb 13 A 4 Ac Lb 14 A 5 Ac Lb 15 C 6 Ac Lb 16 A 7 Ac Lb 17 A 8 Ac Lb 18 A 9 Ac Lb 19 A 10 Ac Lb 20 A 11 Ac Lb 21 C 12 Ac Lb 22 C 13 Ac Lb 23 A 14 Ac Lb 24 A 15 Ac Lb 25 A 16 Ac Lb 26 A 17 Ac Lb 27 A 18 Ac Lb 28 A 19 Ac Lb 29 A 20 Ac Lb 30 C 21 Ac Lb 31 A 22 Ac Lb 32 A Sumbawa 23 Ac Sbw 4 A 24 Ac Sbw 5 A 25 Ac Sbw 6 A Flores 26 Ac Flr 1 A 27 Ac Flr 2 C 28 Ac Flr 3 A 29 Ac Flr 4 C AF 140508 AF 140509 AF 140511 Gambar 5 Peta restriksi hasil pemotongan gen lrrna/drai A. cerana.,,, dan : hasil penelitian ini. AF140508, AF140509, dan AF140511: Sittipraneed (2001), dan : Apriani (2006).
7 Analisis Homologi (alignment) DNA Analisis kesamaan (homologi) dilakukan pada masing-masing haplotipe yang ditemukan pada penelitian ini dengan haplotipe hasil penelitian Sittipraneed et al. (2001) yang diambil dari GenBank dengan Acc Number: AF140508, AF140509, dan AF140511, haplotipe hasil penelitian Apriani (2006), dan urutan nukleotida A. mellifera dengan Acc number. Hasil alignment DNA dengan haplotipe Sittipraneed (2001) ditemukan adanya tiga situs pemotongan yang berbeda. Posisi situs pemotongan yang berbeda disebabkan karena adanya perubahan nukleotida. (Gambar 6). Analisis Filogenetik A. cerana Analisis filogenetik dilakukan dengan menggunakan program PAUP 4.10 (PPC) versi Macintosh. Dari hasil analisis didapat bahwa urutan nukleotida dari koloni A. cerana yang dianalisis lebih didominasi oleh nukleo- tida A (43.834%) dan T (42.103%) (Tabel 6). Jarak genetik terbesar terjadi antara AF140508 dan dengan nilai 3.53%, sedangkan nilai genetik terkecil terjadi antara dan dengan nilai 0.00% (Tabel 7). Rasio substitusi transisi terhadap tranversi antar pasangan koloni menunjukkan nilai tertinggi yaitu 2.20%, antara AF140508 dan. Sedangkan nilai terendah yaitu 0.00%, antara dan ACLb21. Total rasio transisi terhadap transversi yaitu 66.67% untuk ts/tv >1 dan 26.67% untuk ts/tv <1 (Lampiran 3). Konstruksi pohon filogenetik dilakukan berdasarkan urutan nukleotida gen lrrna A. cerana dengan metode Maximum Parsimony (MP) (Gambar 7a-c) dan Neighbour Joining (NJ) (Gambar 7d). Dari hasil analisis dengan menggunakan MP, terdapat 512 karakter yang konstan, 69 karakter yang parsimony uninformative, dan hanya 21 karakter yang parsimony informative. Tabel 5 Persentase haplotipe A. cerana Lombok, Sumbawa, dan Flores Lokasi Jumlah koloni (a) Persentase haplotipe (%) Jumlah koloni (b) Persentase haplotipe (a-b) (%) A C A C A C A C Lombok Sumbawa Flores 17 5 3-2 2 72.72 27.28 100-50 50 6 1 2 1 - - 75.86 24.14 83.33 16.67 50 50 Ket : (a) data hasil penelitian tahun 2007; (b): data hasil penelitian Apriani (2006) AATTTAATCATTATCACTATATTTTTTAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATTAATAA 297 AATTTAATCATTATCACTATATTTTAAAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATTAATAA 297 AF140509 AATTTAATCATTATCACTATATTTCAAAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATAAATAA 297 AF140511 AATTTAATCATTATCACTATATTTTAAAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATAAATAA 297 AF140508 AATTTAATCATTATCACTATATCTTAAAAATTAAAATATATGTTTTTATAGAATAAATAA 297 AATTTAATCATTATCACTATATTTTAAAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATAAATAA 300 AATTTAATCATTATCACTATATTTTAAAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATAAATAA 300 AATTTAATCATTATCACTATATTTTAAAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATAAATAA 297 AATTTAATCATTATCACTATATTTTAAAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATAAATAA 299 AATCTAATCACTATTTCTATATTTTATTAATTAAAATATAAATTTTTATAGAA-AAATAA 2 *** ****** *** ****** * ************ *********** ***** AATTTAAAATTTAAATTTTTAAAAA-TTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA 354 AATTTAAAATTTAAATTTTTAAAAA-TTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA 354 AF140509 AATTTAAAATTTAAATTTTTTAAA--TTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA 353 AF140511 AATTTAAAATTTAAATTTTTTAAA--TTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA 353 AF140508 AATTCAAAATTTAAATTTTTAAAAA-TTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA 354 AACTTAAAATTTAAATTTTTTAAAAATTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA 358 AACTTAAAATTTAAATTTTTTAAAAATTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA 358 AACTTAAAATTTAAATTTTTTTAAAATTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA 355 AACTTAAAATTTAAATTTTTTTAAAATTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA 357 AATATAAA-TTTAAATCATTATTAATTTATAAATATTAAATTATTAAATTATTAAAATTA 347 ** *** ******* ** * *** ** ************** ** * ****
8 ATAAAAAATATTAATTTCATAATATTATAAATAAAATTAAAAATTTTTATAAATAAATTT 414 ATAAAAAATATTAATTTCATAATATTATAAATAAAATTAAAAATTTTTATAAATAAATTT 414 AF140509 ATAAAAAATATTAACTTCATAATATTATAAATAAAATCAAAAATTTTTATAAATAAATTT 413 AF140511 ATAAAAAATATTAACTTCATAATATTATAAATAAAATCAAAAATTTTTATAAATAAATTT 413 AF140508 ATAAAAAATATTAACTTCATAATATTATAAATAAAATCAAAAATTTTTATAAATAAATTT 414 ATAAAAAATATTAACTTCATAATATTATAAATAAAATCAAAAATTTTTATAAATAAATTT 418 ATAAAAAATATTAACTTCATAATATTATAAATAAAATCAAAAATTTTTATAAATAAATTT 418 ATAAAAAATATTAATTTCATAATATTATAAATAAAATCAAAAATTTTTATAAATAAATTT 415 ATAAAAAATATTAATTTCATAATATTATAAATAAAATCAAAAATTTTTATAAATAAATTT 417 AAGAAAAATATTATCTCTATAACATTAAAAATTAAAATTAAA-TTTTTATCT-TAAATTT 405 * ********** * **** **** **** *** *** ******* ******* ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATATCATAAA-TAAATTTTAATGTA 4 ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATATCATAAA-TAAATTTTAATGTA 4 AF140509 ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATACTATAAA-TAAATTTTAATGTA 472 AF140511 ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATACTATAAA-TAAATTTTAATGTA 472 AF140508 ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATACTATAAA-TAAATTTTAAGGTA 4 ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATACTATAAA-TAAATTTTAATGTA 477 ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATACTATAAA-TAAATTTTAATGTA 477 ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATACTATAAA-TAAATTTTAATGTA 474 ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATACTATAAA-TAAATTTTAATGTA 476 ATAGATTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATAAATTAAAATAAAATTTAATTTA 465 **** ********************************* **** **** ***** ** TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATCAATAAGTTCG 533 TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATCAATAAGTTCG 533 AF140509 TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATCAATAACTTCG 532 AF140511 TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATCAATAACTTCG 532 AF140508 TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATCAATAACTTCG 533 TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATCAATAAGTTCG 537 TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATCAATAAGTTCG 537 TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATTAATAAGTTCG 534 TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATTAATAAGTTCG 536 CTAAAATAATTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATTAATAAGTTCG 525 ***** **************************************** ***** **** Gambar 6 Homologi urutan nukleotida gen lrrna A. cerana.,,, dan : hasil penelitian ini. AF140508, AF140509, dan AF140511: Sittipraneed (2001), dan : Apriani (2006), Amel_lrRNA: urutan nukleotida lrrna Apis mellifera (Acc number: ). TTT/AAA: situs restriksi DraI, *: homologi nukleotida. Tabel 6 Persentase nukleotida A. cerana lrrna/drai Taxon A C G T 0.43834 0.09005 0.05057 0.42103 Tabel 7 Jarak genetik antar koloni A. cerana lrrna/drai 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1-2 0.34-3 AF140509 2.69 2.36-4 AF140511 2.52 2.19 0.19-5 AF140508 3.53 3.19 1.51 1.35-6 2.35 2.01 1.34 1.17 1.85-7 2.35 2.01 1.34 1.17 1.85 0.00-8 2.18 1.85 1.85 1.68 2.69 1.17 1.17-9 2.18 1.85 1.85 1.68 2.69 1.17 1.17 0.00-10 12.69 12.69 13.04 12. 13.34 13.16 13.16 12.83 12.83 -
9 AF140509 AF140511 28 41 AF140508 11 40 AF140509 22 11 AF140511 AF140508 (a) (b) AF140509 AF140511 41 AF140508 AF 140509 40 22 AF 140511 11 41 AF 140508 (c) (d) Gambar 7 Konstruksi pohon filogeni A. cerana gen lrrna berdasarkan Maximum Parsimony (Gambar a-c) dan Neighbour Joining (Gambar d), angka di atas nodus menyatakan nilai bootstrap 100x.,,, dan : hasil penelitian ini. AF140508, AF140509, dan AF140511: Sittipraneed (2001), dan : Apriani (2006), : urutan nukleotida lrrna Apis mellifera.