PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK ETANOL PEGAGAN (Centella asiatica) TERHADAP EKSPRESI BAX PADA NEURON PYRAMIDAL CA1 HIPPOCAMPUS TIKUS (Rattus novergicus) YANG DIINDUKSI SODIUM NITRIT SUB AKUT Karya Tulis Ilmiah Untuk Memenuhi Sebagian Syarat Memperoleh Derajat Sarjana Kedokteran PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER Oleh : A.M. Farid Santoso 12711064 FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA 2016
THE EFFECT OF ETHANOL EXTRACT OF GOTU KOLA (Centella asiatica) AGAINT BAX EXPRESSION IN RAT (Rattus novergicus) HIPPOCAMPAL CA1 PYRAMIDAL NEURONS INDUCED BY SODIUM NITRITE SUBACUTE A Scientific Paper As a Part of Requirements to Obtain a Degree of Medicine Islamic University of Indonesia MEDICAL EDUCATION PROGRAM by : A.M. Farid Santoso 12711064 FACULTY OF MEDICINE ISLAMIC UNIVERSITY OF INDONESIA 2016 2
3
THE EFFECT OF ETHANOL EXTRACT OF GOTU KOLA (Centella asiatica) AGAINT BAX EXPRESSION IN RAT (Rattus novergicus) HIPPOCAMPAL CA1 PYRAMIDAL NEURONS INDUCED BY SODIUM NITRITE SUBACUTE A.M. FARID SANTOSO 1, KUSWATI 2, ETY SARI HANDAYANI 2 1 Student of Faculty of Medicine, Islamic University of Indonesia 2 Department of Anatomy, Faculty of Medicine, Islamic University of Indonesia ABSTRACT Background: Sodium nitrite is widely used as preservatives in foods consumed by the public. Sodium nitrite can cause hypoxia by converting hemoglobin into methemoglobin. CA1 pyramidal neurons is one of the structures in the hippocampus are susceptible to hypoxic conditions. To prevent damage to the CA1 pyramidal neurons of the hippocampus, it takes a neuroprotective agent. Gotu kola (Centella asiatica) is one of the plants the apparently has a neuroprotective effect. Objective: This study aimed to determine the effect of ethanol extract of gotu kola (Centella asiatica) on the expression of Bax in the hippocampal CA1 pyramidal neurons rat (rattus novergicus) induced sub-acute sodium nitrite. Methods: This study used post test control group design that uses 14 blocks of biological materials stored are divided into 3 groups: control group (K) as much as 4 blocks, group 1 (P1) as much as 5 blocks, and the treatment group 2 ( P2) as much as 5 blocks. The observations were analyzed by one way ANOVA test. Results: There were differences in the number of Bax expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons significant difference between the control group, treatment 1 and treatment 2 (P = 0.000). Bax expression in group P1 is higher than P2. Conclusion: The ethanol extract of leaves of gotu kola (Centella asiatica) decrease Bax expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons rat (Rattus norvegicus) induced by sodium nitrite subacute. Keywords: Centella asiatica, Sodium Nitrite, Bax Expression, Hippocampus CA1 Pyramidal Neuron. 4
THE EFFECT OF ETHANOL EXTRACT OF GOTU KOLA (Centella asiatica) AGAINT BAX EXPRESSION IN RAT (Rattus novergicus) HIPPOCAMPAL CA1 PYRAMIDAL NEURONS INDUCED BY SODIUM NITRITE SUBACUTE A.M. FARID SANTOSO 1, KUSWATI 2, ETY SARI HANDAYANI 2 1 Mahasiswa Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia 2 Departemen Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia INTISARI Latar Belakang : Sodium nitrit banyak digunakan sebagai bahan pengawet makanan yang dikonsumsi oleh masyarakat. Sodium nitrit dapat menimbulkan hipoksia dengan mengubah hemoglobin menjadi methemoglobin. Neuron pyramidal CA1 merupakan salah satu struktur pada hippocampus yang rentan terhadap kondisi hipoksia. Untuk mencegah terjadinya kerusakan pada neuron pyramidal CA1 hippocampus, dibutuhkan suatu agen neuroprotektif. Pegagan (Centella asiatica) merupakan salah satu tanaman yang diniali memiliki efek neuroprotektif. Tujuan Penelitian : Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol pegagan (Centella asiatica) terhadap ekspresi Bax pada neuron pyramidal CA1 hippocampus tikus (rattus novergicus) yang diinduksi sodium nitrit sub akut. Metode Penelitian : Penelitian ini menggunakan rancangan post test control group design yang menggunakan 14 blok bahan biologis tersimpan yang dibagi menjadi 3 kelompok, yaitu kelompok kontrol (K) sebanyak 4 blok, kelompok perlakuan 1 (P1) sebanyak 5 blok, dan kelompok perlakuan 2(P2) sebanyak 5 blok. Hasil pengamatan dianalisa dengan uji one way ANOVA. Hasil : Terdapat perbedaan jumlah ekspresi Bax pada neuron pyramidal CA1 hippocampus yang signifikan antara kelompok kontrol, perlakuan 1, dan perlakuan 2 (P=0,000). Ekspresi Bax pada kelompok P1 lebih tinggi daripada P2. Kesimpulan : Pemberian ekstrak etanol daun pegagan (Centalla asiatica) menurunkan ekspresi bax pada neuron pyramidal CA1 hippocampus tikus (Rattus norvegicus) yang diinduksi dengan sodium nitrit subakut. Kata Kunci : Centella asiatica, Sodium Nitrit, Ekspresi Bax, Neuron Pyramidal CA1 Hippocampus. 5
PENDAHULUAN Sodium nitrit biasanya digunakan sebagai bahan tambahan pengawet makanan. Sodium nitrit terdapat pada hotdogs, lunch meat, bacon, dan ham. Selain sebagai bahan pengawet antimikroba, sodium nitrit berfungsi sebagai pewarna, pemberi aroma, dan cita rasa. 1 Konsumsi sodium nitrit dalam jumlah banyak dapat memberikan efek kurang baik bagi tubuh. Sodium nitrit dapat mengubah hemoglobin menjadi methemoglobin di dalam darah sehingga dapat menginduksi terjadinya hipoksia jaringan. Hal ini terjadi karena methemoglobin tidak dapat mengikat oksigen. Pada keadaan hipoksia, kadar reactive oxygen species (ROS) dalam jaringan akan meningkat sehingga memicu terjadinya apoptosis yang ditandai dengan degradasi membran lipid, enzim, dan kerusakan DNA. 2 Hipoksia menyebabkan aktifitas protein antiapoptosis Bcl-2 terhambat sehingga mengaktifkan peran dari protein Bax yang meningkatkan permeabilitas membran mitokondria. Keadaan ini meningkatkan pelepasan sitokrom C yang selanjutnya berikatan dengan apoptosis protease activating factor-1 (APAF-1) dan membentuk apoptosom. apoptosom mengaktifkan kaspase 9 yang selanjutnya akan mengaktifkan kaspase 3 sehingga terjadi proses apoptosis. 2 Otak merupakan bagian utama yang mendapat vaskularisasi. Jaringan neuron otak menghasilkan ATP melalui suplai glukosa dan oksigen saja. Hal ini menyebabkan jaringan otak rentan terhadap jejas hipoksik. 3 Selama hipoksia aktivitas elektrik otak menghilang terutama di hippocampus. 4 regio cornu ammonis (CA) merupakan struktur pada hippocampus yang berperan dalam proses pembelajaran dan memori. 4 Oleh karena itu, dibutuhkan suatu agen neuroprotektif untuk melindungi sebanyak mungkin sel saraf pada otak dari kerusakan akibat hipoksia. 4 Pegagan (Centella asiatica) adalah tanaman liar yang tumbuh di Pulau Jawa dan Madura. Tumbuhan pegagan bersifat antioksidan karena mengandung senyawa fitokimia seperti flavonoid pada batang stolon dan 6
akarnya. 5 Selain berfungsi sebagai antioksidan dan antiinflamasi, flavonoid meningkatkan fungsi endotelial dan aliran darah perifer sehingga meningkatkan aliran darah otak (cerebral blood flow/cbf). 4 Apoptosis sel adalah suatu mekanisme kematian sel yang terprogram. Apoptosis menyebabkan fragmentasi DNA, penyusutan sitoplasma, perubahan membran, dan akhirnya terjadi proses lisis sel tanpa merusak sel di sekitarnya. Proses apoptosis terjadi melalui dua jalur yaitu jalur instrinsik dan jalur ekstrinsik. Jalur instrinsik adalah jalur mediasi non reseptor dan mekanismenya melalui peran mitokondria. Stimulus apoptosis akan menyebabkan inaktivasi dari antiapoptosis dan aktivasi dari proapoptosis, selanjutnya proapoptosis akan menyebabkan keluarnya cytochrome c dari mitokondria dan menginduksi terjadinya apoptosis. Induksi terjadinya apoptosis diawali dengan pengaktifan apalf (apoptotic protease activating factor-1) oleh cytochrome c yang selanjutnya akan membentuk apoptosome dan mengaktifkan caspase 9. Akhir dari proses ini adalah aktivasi caspase 3 atau caspase 7 oleh caspase 9 dan menghasilkan kematian sel. 6 Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol daun pegagan (centella asiatica) terhadap ekspresi bax pada neuron pyramidal CA1 hippocampus tikus (rattus novergicus) yang diinduksi sodium nitrit sub akut. METODE PENELITIAN Penelitian ini menggunakan rancangan penelitian post test with control group design. Sampel Penelitian Penelitian ini menggunakan bahan biologis tersimpan berupa blok parafin jaringan otak tikus (Rattus novergicus) sebanyak 14 buah. Jaringan tersebut berasal dari tikus yang sudah mendapat perlakuan. Perlakuan pada hewan percobaan ini dilakukan selama 42 hari dengan frekuansi satu kali sehari. Kelompok kontrol tidak mendapatkan perlakuan. Kelompok perlakuan 1 diberikan sodium nitrit dengan dosis 50 mg/kgbb/hari dan kelompok perlakuan 2 diberikan sodium nitrit dengan dosis 50 mg/kgbb/hari dan ekstrak pegagan 600 mg/kgbb/hari. Pemberian sodium nitrit dan ekstrak pegagan dilakukan dengan menggunakan sonde. Pemberian 7
dilaksanakan pada pukul 15.00 WIB tiap harinya. Analisis Data Penilaian ekspresi bax menggunakan skor allred. Skor allred didapatkan dari penjumlahan proporsi dan intensitas ekspresi Bax pada setiap lapang pandang dari masing-masing kelompok perlakuan. Nilai skor allred antara 0-8, 0 menunjukkan tidak terdapatnya ekspresi Bax dan 8 menunjukkan banyaknya ekspresi Bax dan kuatnya intensitas warna yang di ekspresikan. Data skor allred kemudian dianalisis secara statistik dengan mengunakan one way anova (Analysis of varian), dilanjutkan dengan post hoc test untuk mengetahui kelompok yang mempunyai perbedaan. HASIL Pengamatan neuron pyramidal CA1 hippocampus dilakukan menggunakan mikroskop Olympus CX21 dengan perbesaran 400x. Hasil pengamatan pada neuron pyramidal CA1 hippocampus tikus (Rattus novergicus) dari kelompok kontrol, perlakuan 1, dan perlakuan 2, disajikan dalam gambar 1. Berdasarkan hasil pengamatan, ekspresi bax ditandai dengan timbulnya warna cokelat pada neuron pyramidal CA1 hippocampus. Gambar A (perbesaran 40x) panah merah menunjukkan letak neuron pyramidal CA1 hippocampus tikus (Rattus novergicus). Pada gambar B (kelompok kontrol) tidak terdapat ekspresi bax, hal tersebut berdasarkan pada pengamatan sel neuron pyramidal CA1 hippocampus yang tidak memperlihatkan warna cokelat. Gambar C (kelompok perlakuan 1) memperlihatkan warna cokelat pada seluruh neuron pyramidal CA1 hippocampus. Warna cokelat tersebut menunjukkan adanya ekspresi bax. Gambar D (kelompok perlakuan 2) menunjukkan ada sel yang mengekspresikan bax, ada juga sel yang tidak mengekspresikan bax. 8
Gambar 5. (a) Letak neuron pyramidal CA1 hippocampus Rattus novergicus (perbesaran 40x). (b) Neuron pyramidal CA1 hippocampus Rattus novergicus kelompok kontrol (perbesaran 400x). (c) Neuron pyramidal CA1 hippocampus Rattus novergicus kelompok perlakuan 1 (perbesaran 400x). (d) Neuron pyramidal CA1 hippocampus Rattus novergicus kelompok perlakuan 2 (perbesaran 400x) Tabel 1. Data Skor Allred Ekspresi Bax Kelompok Minimum Maksimum Mean SD One way anova Kontrol 0,00 0,00 0,00 0,00 Perlakuan 1 3,00 8,00 6,60 2,07 0,000 Perlakuan 2 1,86 4,18 3,09 0,97 Tabel diatas menunjukkan sebesar 4,18 dengan mean 3,09 (SD = nilai minimum, maksimum, mean, standar deviasi dan uji one way anova Ekspresi Bax dari kelompok kontrol, perlakuan 1, dan perlakuan 2. Pada kelompok kontrol, rerata terendah adalah 0,00 dan yang tertinggi adalah 0,00 dengan mean 0,00 (SD = 0,00). Kelompok perlakuan 1 memiliki rerata terendah 3,00 dan yang tertinggi sebesar 8,00 dengan mean 60 (SD = 2,07). Kelompok perlakuan 2 memiliki rerata terendah 1,86 dan yang tertinggi 0,97). Uji one way anova dengan menggunakan α = 95%, didapatkan nilai P value sebesar 0,000. Hal ini menyimpulkan bahwa terdapat perbedaan jumlah ekspresi Bax yang signifikan minimal 2 kelompok dari tiga kelompok penelitian. Analisis dilanjutkan dengan menggunakan uji post-hoc untuk menilai kelompok mana yang memiliki perbedaan bermakna. Pada uji post-hoc, 9
didapatkan adanya perbedaan bermakna antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan 1 (P1) dengan nilai P = 0,000. Perbedaan bermakna ditunjukkan pada perbandingan kelompok perlakuan 1 (P1) dengan kelompok perlakuan 2 (P2). Hal ini dibuktikan dengan nilai P = 0,002. Perbedaan bermakna juga terdapat pada kelompok perbandingan kontrol dengan perlakuan 2 (P2) dengan nilai P = 0,007 PEMBAHASAN Ekspresi Bax pada neuron pyramidal CA1 hippocampus dinilai dengan uji one way anova dan posthoc didapatkan perbedaan yang bermakna antara kelompok kontrol, perlakuan 1 (P1), dan perlakuan 2 (P2). Nilai tersebut menunjukkan bahwa pemberian sodium nitrit subakut pada kelompok perlakuan 1 (P1) dapat meningkatkan ekspresi Bax pada neuron pyramidal CA1 hippocampus tikus (Rattus novergicus). Selain itu, nilai uji tersebut juga menunjukkan bahwa pemberian ekstrak etanol daun pegagan pada kelompok Perlakuan 2 (P2) dapat menurunkan ekspresi Bax pada neuron pyramidal CA1 hippocampus tikus (Rattus novergicus) yang diinduksi sodium nitrit subakut. Penelitian lain yang mendukung penelitian ini yaitu penelitian oleh Anda, P. T., (2015) yang menyimpulkan bahwa sodium nitrit memiliki efek yang signifikan pada kerusakan sel purkinje serebelum. 7 Penelitian serupa juga dilakukan oleh Lyhatskiy et al. (2013). Penelitian tersebut menyebutkan bahwa induksi sodium nitrit 45mg/kgBB/hari menyebabkan peningkatan kadar methemoglogin yang signifikan dalam darah. Selain itu, terjadi peningkatan kadar NO2- yang signifikan pada jaringan yang menyebabkan intoksikasi endogen. Intoksikasi tersebut yang menyebabkan kematian sel. 8 Dalam hasil penelitian ini, pemberian sodium nitrit subakut dapat meningkatkan ekspresi Bax pada neuron pyramidal CA1 hippocampus sebagai penanda adanya proses apoptosis. Hal tersebut di buktikan dengan adanya perbedaan bermakna pada uji post-hoc test antara kelompok kontrol dengan kelompok P2. Sementara itu, pemberian ekstrak etanol pegagan (Centella asiatica) dapat mencegah terjadinya apoptosis yang ditandai dengan menurunnya ekspresi Bax pada neuron pyramidal CA1 hippocampus. Hal tersebut dibuktikan dengan nilai uji post-hoc test antara kelompok P1 dan P2 yang 10
bermakna. Perbedaan bermakna juga ditunjukkan pada nilai uji post-hoc test antara kelompok kontrol dengan kelompok P2. Hal tersebut membuktikan masih terdapat perbedaan ekspresi Bax antara kelompok kontrol dengan kelompok P2. Ekspresi Bax pada kelompok P2 lebih tinggi dibandingkan kelompok kontrol. Pegagan (Centella asiatica) merupakan tanaman yang telah digunakan sebagai obat herbal sejak beberapa ribu tahun yang lalu. Flavonoid merupakan salah satu kandungan yang terdapat dalam Centella asiatica yang berperan sebagai agen neuroprotektif. Flavonoid dan metabolitnya dapat melindungi otak dari jejas yang diinduksi neurotoksin. Dalam mencegah inflamasi, flavonoid menekan ekspresi COX-2 dan inos, produksi NO, pelepasan sitokin, aktivasi NADPH oksidase, dan pembentukan ROS. Selain berfungsi sebagai antioksidan dan antiinflamasi, flavonoid meningkatkan aliran darah otak dan memicu neurogenesis di hippocampus. 4 Hasil penelitian ini sesuai dengan penelitian Priyantiningrum et al. (2015) yang bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol pegagan (Centella asiatica) terhadap jumlah sel neuron di korteks prefrontalis tikus (Rattus novergicus) yang diberi perlakuan stres menyimpulkan, pegagan (Centella asiatica) berpengaruh terhadap peningkatan jumlah sel neuron Rattus novergicus. Oleh karena itu, pegagan dapat menghambat kematian sel akibat stres. 9 Kuswati et al. (2015) dalam penelitiannya menyimpulkan ekstrak etanol daun pegagan dapat meningkatkan ekspresi protein antiapoptosis B-cell lymphoma (Bcl-2) di korteks prefrontalis tikus Sprague Dawley yang diberi perlakuan stres retrain kronik. 10 SIMPULAN Berdasarkan hasil pengamatan dan perhitungan jumlah ekspresi Bax pada sediaan bahan biologi tersimpan berupa blok parafin untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol pegagan (Centella asiatica) terhadap ekspresi bax pada neuron pyramidal CA1 hippocampus tikus (Rattus novergicus) yang diinduksi sodium nitrit subakut, maka diambil kesimpulan bahwa pemberian ekstrak etanol daun pegagan (Centalla asiatica) menurunkan ekspresi Bax pada neuron pyramidal CA1 hippocampus tikus (Rattus norvegicus) 11
yang diinduksi dengan sodium nitrit subakut. SARAN Dari hasil penelitian dapat disarankan beberapa hal seperti perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui gambaran sel-sel neuron pyramidal CA1 hippocampus tikus yang rusak akibat induksi sodium nitrit dan Diperlukan penelitian lanjutan dengan struktur otak tikus (Rattus novergicus) yang berbeda untuk melihat pengaruh pemberian ekstrak etanol pegagan sebagai agen neuroprotektif. UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terima kasih disampaikan kepada dr. Kuswati, M.Sc., dan dr. Ety Sary Handayani, M.Kes., kedua orang tua, saudara, sahabat dan semua pihak yang baik secara langsung maupun tidak langsung telah membantu sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA 1. Gehle, K., 2013. ATSDR Case Studies in Environmental Medicine Nitrate/Nitrite Toxucity. ATSDR, U.S. Departement of Health and Human Service. 2. Petrova, E., Dishkelov, A. T., Vasileva, E. G., 2011. Glycolipid Change in Rat Brain Mitochondria and Synaptosomes Following Experimental Hypoxia. MD- Medical Data, Volume 3(4):331-334. 3. Tortora, G.J., 2009. Principles of Anatomy and Phyisilogy, 12 th Edition, John Wiley & Sons, Inc, USA. 4. Halim, H.D.P., Ibrahim, N., 2013. Efek Neuroprotektif Ekstrak Akar Acalypha indica 500 mg/kgbb terhadap Perubahan Inti Sel Saraf Hipokampus Pascahipoksia Serebri. Vol. 1, No. 2 5. Hussin, M., et al. 2007. Protective Effect of Centella asiatica Extract and powder on oxidative stress in rats. Elsevier, Food chemistry 100, 535-541 6. Khattouti,A., Selimovic,D., Haikel, Y., Hassan,M., 2011. Crosstalk Between Apoptosis and Autophagy: Molecular Mechanisms and Therapeutic Strategies in Cancer. Journal of Cell Death. doi: 10.4137/JCD.S11034. 7. Anda, P. T., 2015. Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Daun Pegagan (Centella asiatica) Terhadap Jumlah Sel Serebelum Tikus (Rattus novergicus) yang Diinduksi Natrium Nitrit Subakut, Karya Tulis Ilmiah, Jurusan Pendidikan Dokter Fakultas Kedokteran, Universitas Islam Indonesia 8. Lyhatskiy, P. G. et al., 2013. Methabolic Abnormalities in the Organism of Rats Under the Conditions of Natrium Nitrite Damage, Horbachevsky Ternopil State Medical Universty. 9. Priyantiningrum, A.K., Kuswati, Handayani, E.S., Pengaruh Ekstrak Etanol Centella Asiatica Terhadap Jumlah Sel Neuron di 12
Korteks Prefrontalis Tikus yang Diberi Perlakuan Stres. http://journal.uii.ac.id/index..php/j KKI/article/download/3397/3052 [diakses pada tanggal 10 Maret 2016] 10. Kuswati, Prakosa, D., Wasita, B,.Wiyono, N., 2015. Centella asiatica increases B-cell lymphoma 2 expression in rat prefrontal cortex. Univ Med 2015;34: 10-16 13